Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Resumo

Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é <30 min, em comparação com 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Resumo

Métodos de isolamento mitocondriais descritas anteriormente, utilizando centrifugação diferencial e / ou centrifugação em gradiente de Ficoll exigir de 60 a 100 min para completar. Descreve-se um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de mamífero, utilizando um tecido comercial Dissociator filtração e diferencial. Neste protocolo, homogeneização manual é substituído por ciclo de homogeneização padronizada do Dissociator tecido. Isto permite uma uniforme e consistente homogeneização de tecido que não é facilmente conseguido com a homogeneização manual. Após a dissociação de tecidos, o produto homogeneizado é filtrado através de filtros de nylon de malha, o que elimina os passos de centrifugação repetitivas. Como resultado, o isolamento mitocondrial pode ser realizada em menos de 30 min. Este protocolo de isolamento rende aproximadamente 2 x 10 ¹⁰ mitocôndrias competentes viáveis ​​e respiratória de 0,18 ± 0,04 g (peso húmido) de uma amostra de tecido.

Introdução

As mitocôndrias existem em todas as células do corpo, excepto as células vermelhas do sangue e são envolvidos num grande número de importantes processos celulares e metabólicas ^1-4. Devido a estas várias funções, dano mitocondrial pode ter efeitos prejudiciais ^3. A fim de investigar a função mitocondrial e disfunção de vários métodos de isolamento mitocondriais foram descritos. Os primeiros relatos publicados de data isolamento mitocondrial à década de 1940 ^5-8. A primeira tentativa documentada demonstrado isolamento mitocondrial por trituração do tecido do fígado, num almofariz, seguido por centrifugação de uma solução de sal de ^5,8 a baixa velocidade. Mais tarde, outros grupos expandiu o procedimento original e demonstrou fraccionamento de tecido com base na centrifugação diferencial ^6-8. Estes métodos iniciais formaram a base das técnicas atuais que muitas vezes incorporam homogeneização e / ou centrifugação diferencial ^9-15. O número de homogenizatiem passos de centrifugação e varia entre protocolos. Estes passos repetitivos aumentar o tempo para o isolamento mitocondrial e, finalmente, reduzir a viabilidade. Além disso, a homogeneização manual pode causar danos e inconsistentes resultados mitocondriais se não for devidamente controlado ^10,16.

Recentemente, foi utilizado homogeneização e centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias para transplante no tecido do miocárdio ^17,18. Este procedimento de isolamento demorado necessário cerca de 90 min e a aplicabilidade clínica deste método era, portanto, limitado. Para possibilitar a utilização terapêutica aguda em tratamentos clínicos e cirúrgicos, desenvolvemos um procedimento de isolamento mitocondrial rápido que pode ser realizada em menos de 30 min.

Os principais benefícios deste protocolo são de que a dissociação do tecido padronizado permite uniforme e consistente homogeneização do tecido que não é facilmente alcançada com homogeneização manual. Em additião, o uso de filtração diferencial em lugar de centrifugação diferencial elimina demorado e passos de centrifugação repetitivas que permitam o isolamento de mitocôndrias mais rápida competentes altamente purificadas, viáveis ​​e respiratória.

A capacidade de isolar mitocôndrias competentes viáveis ​​e de respiração, em menos de 30 min permite a aplicabilidade clínica. Este protocolo de isolamento tem potencial para uso em cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) e outros procedimentos terapêuticos.

Protocolo

Preparação

1. Prepare 1 M K-HEPES da Solução (ajustar o pH para 7,2 com KOH).
2. Prepare 0,5 M K-EGTA da Solução (ajustar o pH para 8,0 com KOH).
3. Prepare 1 M KH ₂ PO ₄ da solução.
4. Prepare 1 M _MgCl2 da solução.
5. Preparar tampão de homogeneização (pH 7,2) 300 mM de sacarose, 10 mM de K-HEPES, e 1 mM de K-EGTA. Armazenar a 4 ° C.
6. Preparar tampão de respiração de 250 mM de sacarose, 2 mM de KH ₂ PO _4, 10 mM de _MgCl2, 20 mM de K-HEPES (pH 7,2) e 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0). Armazenar a 4 ° C.
7. Prepare PBS 10x da solução por dissolução de 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, e 2,4 g de KH ₂ PO ₄ em 1 L duplo _H2O destilada (pH 7,4).
8. Prepare 1x PBS por pipetagem de 100 ml de 10x PBS em 1 L duplo _H2O destilada
9. Prepare a Subtilisina A Stock por pesagem de 4 mg de Subtilisina A empara um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -20 ° C até o uso.
10. Preparar por pesagem da BSA a 20 mg de BSA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -20 ° C até o uso.

Isolamento mitocondrial (Figura 1)

1. Imediatamente antes do isolamento, dissolver Subtilisina A em 1 ml de tampão de homogeneização.
2. Imediatamente antes do isolamento, dissolver de BSA em 1 ml de tampão de homogeneização.
3. Recolher duas amostras de tecido fresco utilizando um perfurador 6 milímetros amostra de biópsia e armazenar em 1x PBS num tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo.
4. Transferir os dois perfuradores 6 mm de tecido para um tubo de dissociação C contendo 5 ml de tampão de homogeneização arrefecida com gelo.
5. Homogeneizar o tecido, ajustando o tubo de dissociação C no Dissociator tecido e selecione a pré-definido ciclo isolamento mitocondrial (60 seg homogeneização).
6. Retire o tubo de dissociação C para um balde de gelo.
7. Adicionar 250 mL de uma solução de estoque Subtilisin aohomogeneizado, misturar por inversão e incubar o homogeneizado em gelo durante 10 min.
8. Colocar um filtro de malha de 40 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo.
9. Adicionar 250 ul de BSA preparada de fresco da Solução ao filtrado e misturar por inversão.
   Nota: Ignore essa etapa se a determinação da proteína mitocondrial é necessária.
10. Colocar um filtro de 40 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo.
11. Colocar um filtro de 10 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, e pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo.
12. Transferir o filtrado para dois pré-refrigerada tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e centrifugue a 9000 xg durante 10 min a4 ° C.
13. Remover o sobrenadante e re-suspender e combinar pelotas em 1 ml de gelo frio Respiração Buffer.

ATP Assay

Nota: Para determinar a actividade metabólica da mitocôndria isolada de um ensaio de luminescência de ATP pode ser realizada utilizando um kit de ensaio de ATP. O protocolo, e os reagentes foram os padrões fornecidos no kit de ensaio. Um resumo do processo é descrito abaixo.

1. Equilibrar reagentes para RT.
2. Preparar 10 mM de ATP da solução através da dissolução de ATP sedimento liofilizado em 1170 mL de água duplamente destilada. Guarde ATP padrão da solução e amostras mitocondriais preparadas no gelo.
3. Adicionar 5 ml de solução de tampão de substrato para um frasco de solução de substrato liofilizado. Misture delicadamente e coloque no escuro.
4. Adicionar 100 ul de tampão de respiração de todos os poços de uma preta, de fundo opaco, placa de 96 poços.
5. Adicionar 10 ul de mitocôndrias das amostras preparadas a cada poço ofa preta, de fundo opaco, placa de 96 poços. Nota: As amostras são colocadas em placas em triplicado. Inclua uma linha para os padrões e três poços para o controle negativo (Respiração Buffer).
6. Adicionar 50 ul de solução de lise de células de mamíferos a todos os poços, incluindo padrões e controlos.
7. Incubar a placa a 37 ° C por 5 min em um agitador orbital a 125 rpm.
8. Durante a incubação preparar padrões de ATP em concentrações de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM e 0,0001 mM de ATP a partir de ATP 10 mM da solução. Padrão das lojas no gelo.
9. Após a incubação, adicionar 10 ul de ATP padrão aos poços correspondentes como indicado na placa de mapa. Nota: Os padrões são realizadas em duplicata.
10. Adicionar 50 ul da solução de substrato a cada poço reconstituído.
11. Incubar a placa a 37 ° C num agitador orbital durante 5 minutos a 125 rpm.
12. Abra o software Gen5 1.11 em um computador ligado com o espectrofotômetro.
13. Em "Criar um novo item ", clique em" Experiment ".
14. Clique em "protocolo padrão". Clique em "Ok".
15. Na coluna da esquerda, selecione "Protocolo", depois em "Procedimento".
16. Selecione "Delay". Defina a 0:10:00. Clique em "Ok".
17. Selecione "Ler". Selecione "luminescência" do menu suspenso. Ajuste outras definições para o seguinte: Leia tipo Endpoint, Tempo de Integração 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Sets 1, Emissão Hole, Ótica posição, Sensibilidade 100, Top Probe Desvio vertical 1,00 milímetros.
18. Quando a placa está pronta para ser analisada, clique no ícone "Leia Plate" na linha superior. Clique em "Read". Quando o espectrofotômetro abrir, colocar a placa na bandeja com poço A1 no canto superior esquerdo. Uma caixa com a temperatura vai abrir. Clique em "Read". Nota: Os valores mais elevados correlacionam-se com os níveis de ATP aumento e maior atividade metabólica.

Resultados

A figura delinear os passos processuais no isolamento de mitocôndrias utilizando dissociação do tecido e filtração diferencial está representada na Figura 1. Tempo processual total é inferior a 30 min.

As amostras de tecido foram obtidas utilizando um punch de 6 mm. O peso do tecido era de 0,18 ± 0,04 g (peso molhado). O número de mitocôndrias isoladas, como determinado por contagem de tamanho de partícula foi de 2,4 x 10 ¹⁰ ± 0,1 x 10 ¹⁰ mitocôndrias p...

Discussão

Para isolar com sucesso mitocôndrias que utilizam este protocolo é fundamental para manter todas as soluções e amostras de tecido em gelo para preservar a viabilidade mitocondrial. Mesmo quando mantidos em gelo, as mitocôndrias isoladas irá exibir uma diminuição na actividade funcional ao longo do tempo ^19. Recomendamos que todas as soluções e adições ser pré-preparado. Nós pré-pesar e armazenar Subtilisina A em alíquotas de 4 mg em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga e armazená-las a -20 ° C. Similarmente BSA...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sucarose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite >	Perkin Elmer
Tubos Cônicos de 50 ml	BD	352098
40 μ m Filtros de Nylon	BD	352340
Tubo C GentleMACS	Miltenyl Biotech	120-005-331
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Punção de biópsia de 6 mm	Miltex	33-36
10 μ m Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Centrífuga Eppendorf 5415C	Marshall	Scientific EP-5415C
Dissociador GentleMACS	Miltenyl Biotech	130-093-235
, tratadas com cultura de tecidos	VWR	82050-732
Rotomax 120 agitador orbital	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode   Leitor de Microplacas	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Sistema Oxytherm	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110