Microdissecção tem sido extensivamente utilizada para a análise de DNA, RNA e proteínas dentro do tecido. Microscopia captura a laser (LCM) é o método mais comumente utilizado, mas uma nova técnica de fresagem, mesodissection, é recentemente disponível. Demonstramos extração de RNA a partir de mesodissected formalina parafina fixo lâminas de tecido embebidos de Mycobacterium tuberculosis granulomas.
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Artigo de método
Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando
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Resumo
Resumo
Microdissecção foi usado para o exame de tecidos em ADN, ARN, e os níveis de proteína de mais de uma década. Microscopia captura a laser (LCM) é a técnica de microdissecção mais comum usado hoje. Nesta técnica, um laser é usado para fundir focalmente uma membrana termoplástica que se sobrepõe uma secção de tecido 1 desidratado. O compósito secção de tecido é então levantada e separada da membrana. Embora esta técnica pode ser utilizada com sucesso para a análise de tecido, que é demorado e caro. Além disso, a conclusão bem sucedida de procedimentos que utilizam esta técnica requer a utilização de um laser, limitando assim o seu uso. Uma nova abordagem microdissection mais acessível e prático chamado mesodissection é uma possível solução para as armadilhas da LCM. Esta técnica utiliza o sistema de MESO-1/MeSectr moer o tecido desejado a partir de uma amostra de tecido montada deslizante, enquanto simultaneamente a distribuição e aspiração de fluido para recuperar a amostra de tecido desejado emum pouco moinho consumível. Antes do processo de dissecação começa, o usuário alinha a parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) deslizar com hematoxilina e eosina (H & E) referência slide. Depois disso, o operador anota a área de dissecção desejada e prossegue para dissecar o segmento apropriado. O programa gera uma imagem arquivada da dissecção. A principal vantagem do mesodissection é a curta duração necessária para dissecar um slide, tendo uma média de 10 minutos de set up para provar geração neste experimento. Além disso, o sistema é muito mais rentável e fácil de usar. Um pequena desvantagem é que não é tão precisa como a microscopia de captura laser. Neste artigo, vamos demonstrar como mesodissection pode ser usado para extrair RNA de slides de granulomas FFPE causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introdução
As amostras foram tradicionalmente microdissecado manualmente a partir de qualquer tecido ou conjunto lâminas usando uma agulha e bisturi. Isto exige uma separação clara entre a secção de tecido de interesse e tecidos circundantes pontos 2. Com os avanços na tecnologia actual perfil molecular, tem havido uma necessidade cada vez maior para avaliar tecidos ao nível celular. Devido às limitações de microdissecção manual, foram estabelecidas técnicas, incluindo LCM para permitir uma maior precisão isolamento. Esta técnica permite ao investigador para isolar populações de células específicas a partir de vários tipos de células e de deslizamento, que podem então ser utilizadas para ensaios a jusante, tais como a expressão do gene de perfil. Embora muito eficaz para ensaios a jusante, GCV não é sem limitações. Primeiro, LCM é um processo caro e demorado. Além disso, devido à natureza instável do ARN, que é muitas vezes difícil obter o RNA de alta qualidade a partir de amostras de LCM 2. Devido ao disadvantages de LCM, novos avanços na tecnologia microdissection ainda são necessários para torná-lo mais acessível a um maior número de pesquisadores, de forma sensível a preços acessíveis e de tempo.
Um tal avanço da tecnologia microdissection agora está disponível uma técnica conhecida como mesodissection. Nesta técnica uma máquina é usada para moer a secção de tecido anotada de juros e aspira-lo em um consumível pouco moinho 3. Em seguida, essa amostra pode ser aspirado para dentro de um tubo de coleta e usado para aplicações a jusante. As vantagens deste sistema são que é significativamente menos dispendioso e sensíveis ao tempo. Em nossa experiência, o sistema permite a dissecação de uma secção de tecido granuloma pulmonar em dez minutos. Por outro lado, o LCM tradicional seria provável exigir horas para completar o processo. O sistema permite que o operador carregar uma lâmina de referência a ser usado como uma comparação, bem como ferramenta para anotação. Além disso, um relatório é gerado descrevendo ªárea e do slide que foi dissecado. Há duas principais desvantagens para mesodissection. Embora eficaz na extração de várias células, é um desafio para isolar uma única célula. Além disso, a precisão da imagem gerada não é tão clara como se estivesse usando outros microscópios de imagem.
A tuberculose (TB) é um grande assassino de doenças infecciosas da humanidade em todo o mundo e resulta de infecção por M. tuberculosis. Na maioria dos indivíduos expostos a aerossóis de Mtb, a infecção é latente limitado. Em pelo menos 10 milhões de pessoas por ano, que resulta em doença tuberculose ativa 4. Durante a infecção latente, Mtb está contido dentro de lesões pulmonares patológicos conhecidos como granulomas. Por isso, tem-se argumentado que o resultado de infecção por M. tuberculosis é decidido ao nível do granuloma 5.
Aqui demonstramos como mesodissection pode ser usado para microdissect granulomas provocadas por M. tuberculosis. Os slides utilizadossão de FFPE tecido pulmonar de macacos rhesus infectados. Para o propósito desta demonstração, vamos dissecar granulomas na sua totalidade. Também demonstramos que o RNA pode ser extraído a partir do tecido recuperado. Esta técnica pode ser aplicada a amostras de tecidos de várias outras amostras e, em seguida, utilizados para uma variedade de ensaios a jusante.
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Protocolo
1. Calibrar Mesodissection Instrumento com 2id Software Imaging
O software de imagem 2id será referido como o software ou o programa para o restante deste artigo. Esta etapa é necessária para monitorar corretamente a imagem, bem como alinhar vários quadros de slides.
- Ligue instrumento eo computador.
- Abra o software e selecione "instrumento calibrar".
- Calibrar viagem etapa, utilizando o joystick. Mover para a posição de fase superior esquerdo. Pressione o botão "set" no passo 1 em programa.
- Mova etapa para baixar posição correta. Pressione o botão "set" no passo 2 no programa.
- Calibrar aspiração pressionando primeiro "botão Z" para levantar a montagem cabeça. Pressione o botão "pulso aspirado" eo botão "dissecação" no joystick até haste de controle êmbolo atinge primeira posição. Pressione o botão "set" na etapa 3 do programa.
- Pressione "aspirado de reset &# 8221; botão. Uma vez que o êmbolo pára no fundo posição imprensa "set" no passo 4.
- Clique na guia "escala".
- Coloque governante calibração no lado em branco.
- Concentre-se microscópio, se necessário.
- Desenhar linha entre as duas barras de escala usando mouse.
- Introduza a distância na caixa passo 2 Pressione o botão. "Compute" rotulados.
- Clique na aba "mira". Gire a velocidade do motor a 1.
- Insira xScisor em conjunto da cabeça. Conjunto de cabeça inferior em posição pronta eixo z, premindo o botão "eixo z". NOTA: O conjunto da cabeça é a grande estrutura na parte superior do instrumento de dissecação. O xScisor será referida como uma ponta de fresagem consumível para o resto do artigo.
- Clique em "dissecação envolver" botão no joystick. NOTA: Este botão está localizado na parte superior do joystick.
- Definir centro de rotação visualmente. Para fazer isso, mover o centro da cruz sobre o centro de rotação usando definird parâmetro no passo 1 do programa. Use o para cima e para baixo setas no "x" e "bares do eixo y" para ajustar os pixels para alinhar mira. Clique na guia "feito".
- Clique no ícone de "casa". NOTA: Este é representada uma imagem casa localizada no canto superior direito por.
2. Criar Imagem de referência
- Coloque H & E de slides no palco. Coloque tampa opaca em cima de slide. Dirija o instrumento, movendo o joystick para a área desejada da H & E slide. Salve a imagem gerada. NOTA: Ou o guia "captura de referência" ou guia "dissecar" pode ser usado para concluir esta etapa.
3. Alinhe Tissue para Dissecção
- Clique na opção "dissecar tecido" na tela inicial.
- Preencha o "operador", "número de dissecção adesão", "referência número de acesso", "xScisor número de código de barras", & #8220; dissecção número muito fluida "," tamanho xScisor "e" descrição "na aba" Configuração ".
- Clique no botão "encontrar tecido" tab.
- Importação salvo anteriormente imagem de referência.
- Coloque um slide de FFPE imaculada de 5 mícrons de espessura no palco. Mover fase para a mesma área que o descrito na imagem de referência. Clique na guia "Inserir imagem".
- Clique na aba "align". Use o mouse e as setas associadas para alinhar a imagem de referência para a imagem imaculada.
4. Anotar Deslize
- Clique na aba "anotar".
- Use o mouse para desenhar um círculo ao redor da área desejada do slide que será microdissectados.
5. Carregar consumíveis Moinho Bit
- Preencha consumível pouco moinho com tampão desejado, aqui tampão PKD, puxando o êmbolo para cima e para baixo em um movimento fluido várias vezes. Certifique-se de excluir o arbolhas.
- Levante-eixo Z pressionando botão "eixo Z".
- Carregar consumível pouco moinho em máquina. Para fazer isso, deslizando a broca de fresagem consumível para a parte superior da máquina, de modo que a linha de branco sobre as linhas de instrumentos com a linha preta na broca de fresagem consumível. Pressione o botão "redefinição de aspiração" para permitir que o êmbolo de ser rebaixada para a posição correta. NOTA: Deve ser fácil para deslizar a pouco moinho consumível. Se não for, verifique se os encaixes estão corretamente alinhados.
- Eixo Z inferior em vez de pressionar o botão "eixo Z".
6. Dissecar tecidual (Figura 4)
- Abra guia "dissecar".
- Vire velocidades do motor e aspiração a 1.
- Marque a caixa "show de rastreamento". Nota: Isso permite que o usuário visualize a área dissecados durante o processo de dissecação.
- Uma vez pronto para dissecar, continuar a manter o botão "engajar", bem como "aspirado & #8221; botão enquanto move joystick em sentido anti-horário para dissecar tecidos.
- Continue a dissecar em sentido anti-horário até que o aspirado é guia "completo" fica vermelho.
7. Esvazie e remover consumíveis Moinho Bit
- Coloque um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL sob a ponta da broca de fresagem consumível.
- Haste de controle da "aspiração" rapidamente para ejetar amostra em tubo de microcentrífuga.
- Imprensa com maior força para ejetar usado consumível pouco moinho.
- Enxágüe fragmento de tecido, puxando o êmbolo para trás. Empurre o êmbolo para a frente para expressar amostra restante em consumível pouco moinho. O fragmento de tecido vai agora ser contido no interior do tubo de microcentrífuga.
8. Lyse Amostra com Proteinase K Digestão de um tratamento térmico
- Adicionar 70 ul de TE, pH 8,5, contendo 5 mg de proteinase K e recuperado da amostra de tecido.
- Colocar a amostra em programável aquecedor-shaker.
- Digestão completa usando programável aquecedor-shaker com a seguinte programação: 60 ˚ C por 30 min a 1.500 rpm; 82 ˚ C durante 15 min a 1500 rpm; e 25 ˚ C durante 1 min a 450 rpm. A amostra está pronto para aplicações a jusante.
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Resultados
O referido protocolo mostra como usar uma nova técnica mesodissection extrair RNA a partir de lâminas de tecido FFPE. Eficácia deste protocolo é mostrado através de slides FFPE de granulomas pulmonares de NHP infectados com Mtb em vários estágios infectantes. Figuras 1-3 são imagens do instrumento. Figura 4 mostra como ocorre o processo de dissecação ea imagem resultante gerado pelo software. Tabela 1 mostra os resultados de extração de RNA com um granuloma de ...
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Discussão
Mesodissection é uma técnica que pode ser aplicada para a extracção de ARN a partir de lâminas de lesões patológicas causadas por uma vasta gama de agentes patogénicos. É uma necessidade que o usuário acompanha a imagem e se alinha a imagem corretamente. Para conseguir isso, o instrumento deve ser calibrado de acordo com as instruções sobre o software de imagem. Ao dissecar, se o slide e área de interesse a ser dissecado não se alinham, o usuário deve recalibrar o instrumento. Outro passo importante no processo de disse...
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Divulgações
Os autores revelam que não existem interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer aos seguintes prêmios NIH / subawards para o apoio a esta pesquisa: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, e P51OD011104.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Outros tamanhos disponíveis | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE kit de extração | Sistema FFPE Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq | Kit de Purificação de PCR Nugen | 7150 | |
| QIAquick | Qiagen | 28104 |
Referências
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
