Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A Trichoderma reesei Em Plantas de tabaco

Summary

As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.

Abstract

Enzimas degradantes Celulose, celulases, são alvos de pesquisa e interesses industriais. A preponderância destas enzimas in-a-cultura difíceis organismos, tais como fungos de construção de hifas e bactérias anaeróbias, acelerou o uso de tecnologias recombinantes neste campo. Métodos de expressão de plantas são um sistema conveniente para a produção em grande escala de enzimas e outras proteínas industrialmente úteis. Nisto, os métodos para a expressão transiente de uma endoglucanase de fungos, Trichoderma reesei Cel5A, Nicotiana tabacum são demonstradas. A expressão da proteína de sucesso é mostrado, monitorizada por fluorescência utilizando uma proteína de fusão mCherry enzima. Além disso, um conjunto de ensaios de base são usadas para examinar a actividade de T. expresso transitoriamente reesei Cel5A, incluindo SDS-PAGE, Western blot, zimografia, bem como a fluorescência e ensaios de degradação de substrato à base de corantes. O sistema aqui descrito pode ser usado para produzir uma célula activaULASE em um curto período de tempo, de modo a avaliar o potencial de produção em plantas através de sistemas de expressão constitutiva ou induzida.

Introduction

Degradação de biomassa lignocelulósica e sua conversão em combustível líquido foi concebido como um método para reduzir a dependência dos combustíveis fósseis. Um obstáculo significativo na criação de sistemas de processamento de biomassa é economicamente viáveis ​​na degradação enzimática da celulose e hemicelulose ^1. Os sistemas de expressão de plantas apresentam um grande potencial para a produção de enzimas a uma escala industrial. Agricultura, sistemas para instalações de colheita economicamente e em termos de volume já estão estabelecidos, como têm sido há milhares de anos. A produção de celulases em plantas é desejável devido a factores tais c....

Protocol

1. Crescimento do tipo selvagem de N. tabacum plantas

1. Para crescer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 no solo, colocar sementes de tabaco em potes adequados cheios de envasamento solo normal para a germinação. Após 2 semanas, a transferência de mudas para vasos individuais. Incubar as plantas em uma estufa com constante de 22 ° C (período escuro) ou 25 ° C (período de luz) e 70% de umidade relativa do ar. Fornecer iluminação em um ciclo claro / escuro 16/8 h luz (por exemplo, Philips IP65 400 lâmpadas W; 180 mol · s ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) e água diariamente.

2. Ex....

Results

TrCel5A e TrCel5A-mCherry foram expressos com sucesso em plantas do tabaco usando o sistema de expressão transiente (Figuras 1A e 1B). O exame do modelo da proteína de fusão TrCel5A-mCherry expressão revelado folhas saudáveis ​​(Figura 1C), que mostrou a expressão de proteínas largamente espalhada sob luz verde (Figura 1D).

Extracção das proteínas totais foi realizada em plantas de tabaco que tinham folhas que continham a pr.......

Discussion

A expressão recombinante de celulases é um campo de grande interesse, devido ao desejo de sistemas de produção de biocombustíveis mais eficientes ^1. As plantas oferecem muitas possibilidades para a produção de celulase de sucesso, com recursos como técnicas de colheita econômica e métodos autohydrolysis sendo propriedades muito desejáveis ​​para a produção de biocombustíveis em larga escala. Além disso, o uso de diferentes localizações para a produção de proteínas de permitir, se necessário, as modificações p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-metilumbelliferil β-D-cellobiosídeo	SIGMA-ALDRICH	M6018
Ácido acético	ROTH	3738
Acetosiringon (concentrado)	ROTH	6003
Antibiótico - canamicina	ROTH	T832
Antibiótico - rifampicina	ROTH	4163
Antibiótico - carbenicilina	ROTH	6344
Anticorpo - coelho anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Anticorpo - cabra anti coelho AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboximetilcelulose	MEGAZYME	S-ACMC
β-ciclodextrina	SIGMA-ALDRICH	C4805
Cloreto de cálcio di-hidratado	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboximetilcelulose	ROTH	3333.1
Celulase de Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo red	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie azul brilhante G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glicose	ROTH	8337
Etanol	ROTH	K928
Papel de filtro - Papel mata-borrão Rotilabo	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
Tampão	MES ROTH	4256
Metanol	ROTH	8388
Citrato de sódio	ROTH	3580
Dodecilsulfato de sódio	SERVA	20765
Hidróxido de sódio	ROTH	6771
Solo, Einheitserde classic	Espectrômetro PATZER GMBH
- Infinite M200	TECAN
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hidroxi benzhidrazida	SIGMA-ALDRICH	H9882
ROTH	1058		tampão fosfato
- BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica