Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A Trichoderma reesei Em Plantas de tabaco

Resumo

As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.

Resumo

Enzimas degradantes Celulose, celulases, são alvos de pesquisa e interesses industriais. A preponderância destas enzimas in-a-cultura difíceis organismos, tais como fungos de construção de hifas e bactérias anaeróbias, acelerou o uso de tecnologias recombinantes neste campo. Métodos de expressão de plantas são um sistema conveniente para a produção em grande escala de enzimas e outras proteínas industrialmente úteis. Nisto, os métodos para a expressão transiente de uma endoglucanase de fungos, Trichoderma reesei Cel5A, Nicotiana tabacum são demonstradas. A expressão da proteína de sucesso é mostrado, monitorizada por fluorescência utilizando uma proteína de fusão mCherry enzima. Além disso, um conjunto de ensaios de base são usadas para examinar a actividade de T. expresso transitoriamente reesei Cel5A, incluindo SDS-PAGE, Western blot, zimografia, bem como a fluorescência e ensaios de degradação de substrato à base de corantes. O sistema aqui descrito pode ser usado para produzir uma célula activaULASE em um curto período de tempo, de modo a avaliar o potencial de produção em plantas através de sistemas de expressão constitutiva ou induzida.

Introdução

Degradação de biomassa lignocelulósica e sua conversão em combustível líquido foi concebido como um método para reduzir a dependência dos combustíveis fósseis. Um obstáculo significativo na criação de sistemas de processamento de biomassa é economicamente viáveis ​​na degradação enzimática da celulose e hemicelulose ^1. Os sistemas de expressão de plantas apresentam um grande potencial para a produção de enzimas a uma escala industrial. Agricultura, sistemas para instalações de colheita economicamente e em termos de volume já estão estabelecidos, como têm sido há milhares de anos. A produção de celulases em plantas é desejável devido a factores tais como a facilidade de autohydrolysis ^2, e o potencial para maximizar o uso de níveis mais baixos de enzima, aumentando a digestibilidade das paredes das células das plantas ^1. Finalmente, sistemas de plantas permitir o direccionamento das proteínas recombinantes para áreas específicas de células de plantas e são capazes de modificar posttranslationally enzimas onde requeridas ^3.

ve_content ">

Nicotiana tabacum (tabaco) é muito comumente utilizado como um organismo modelo para estudos de expressão de proteínas heterólogas em plantas, devido ao seu rápido crescimento e de biomassa de acumulação de recursos ^4. A expressão transitória de proteínas recombinantes é uma técnica que permite a produção de proteína em períodos de tempo curtos ^5, enquanto mantém a flexibilidade como para a localização e, portanto, as modificações pós-traducionais das proteínas seleccionadas, ou seja, celulases. Isso permite a produção de celulase (s) para a análise básica, ao mesmo tempo, preparando o terreno para novas estratégias de expressão em plantas. Usando essa estratégia expressão transitória, uma endoglucanase de glicosil hidrolases da família 5, Cel5A, derivado do hospedeiro do fungo Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ⁶ é produzido (doravante referida como TrCel5A). TrCel5A é uma proteína de 42 kDa, que é nativamente glicosilada e é altamente ativo em hidráulicaroylzing cadeias de celulose ^7.

A técnica de expressão transitória descrito aqui baseia-se num sistema relativamente comumente utilizado, infiltrando-se as folhas das plantas com a Agrobacterium transportando o gene de interesse num vector de expressão apropriado. Para permitir a análise rápida de expressão bem sucedida em planta, TrCel5A também pode ser expressa como uma proteína de fusão com mCherry, uma proteína fluorescente monomérica originalmente derivada de Discosoma sp. Proteína dsRed ^8, com um período adicional de seis resíduos de histidina (His-tag) fundido com a o C-terminal (TrCel5A-mCherry). Expressão da proteína de fusão heteróloga, TrCel5A-mCherry, pode, assim, ser controlada dentro da planta em crescimento usando luz verde para examinar mCherry dispersão. Se desejado, as secções finas de material de planta pode ser examinado sob luz verde ao microscópio para estabelecer a localização específica da proteína. Para este trabalho, sinal e transentar péptidos foram incorporadas na construção para a localização da exportação da proteína heteróloga para o retículo endoplasmático ^9.

Para analisar a actividade de plantas, incluindo as celulases expressas TrCel5A, uma série de testes de actividade de celulase pode ser executado. Após a extracção do total de proteínas vegetais solúveis, TrCel5A podem ser parcialmente purificadas utilizando uma técnica de incubação térmica. O tamanho da proteína é efectuada por meio de SDS-PAGE seguido por Western blot. Zimografia pode ser utilizado para analisar a actividade contra os substratos, por exemplo, de celulose, que foi carboxi-metilado (fazendo carboximetilcelulose: CMC) para a solubilidade ^10. Actividade de celulase e glicosidase pode ser monitorizada utilizando o fluoróforo 4-metilumbeliferilo (4-MU), associada com β-D-celobiósido (combinados: 4-MUC). Outro método para avaliar a actividade de endoglucanase envolve a análise de espectrometria de CMC que tem sido associado com um azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) ^11. Além disso, a actividade da proteína de ambas as endoglucanases e uma variedade de celulases pode ser monitorizado pela utilização de um teste de análise de açúcar, tais como a hidrazida de p-hidroxi-benzóico (PAHBAH) ensaio de ^12. Estas técnicas podem ser utilizados para elucidar e quantificar a actividade da celulase expressa de interesse.

Protocolo

1. Crescimento do tipo selvagem de N. tabacum plantas

1. Para crescer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 no solo, colocar sementes de tabaco em potes adequados cheios de envasamento solo normal para a germinação. Após 2 semanas, a transferência de mudas para vasos individuais. Incubar as plantas em uma estufa com constante de 22 ° C (período escuro) ou 25 ° C (período de luz) e 70% de umidade relativa do ar. Fornecer iluminação em um ciclo claro / escuro 16/8 h luz (por exemplo, Philips IP65 400 lâmpadas W; 180 mol · s ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) e água diariamente.

2. Expressão transiente de TrCel5A e TrCel5A-mCherry Proteínas

1. Sob condições estéreis, escolher colónias isoladas de Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) contendo ou pTRAkc-ER-TrCel5A ou pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry e transferir para um erlenmeyer contendo 10 ml de extrato de leveduracaldo (YEB, preparado de acordo com as especificações dos fabricantes) médio e canamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), e carbenicilina (100 mg / ml) para a selecção. Incubar durante 36-40 horas a 26 ° C e 180 rpm. Nota: A concepção de construções apropriadas para a expressão da proteína está fora do âmbito deste documento, mas a título indicativo, os métodos de Maclean et al ¹³ e Munro e Pellham ¹⁴ pode ser seguido para a construção de criação..
2. Tomar 200 mL de cada cultura para inocular 20 ml de YEB com as concentrações de antibióticos acima mencionados e incubar sob as mesmas condições que anteriormente.
3. Após 36-40 horas, as culturas preinduce por adição de 2 ul acetosyringon (200 uM concentração final), 100 ul de 40% (w / v) de uma solução de glucose e 200 ul de 1 M de MES pH 5,6. Incubar durante a noite.
4. Preparar 100 ml de um tampão de infiltração 2x (sais basais de 100 g / L de sacarose, 3,6 g / L de glucose, 8,6 g / L de Murashige e Skoog, Ajustar o pH para 5,6 utilizando hidróxido de potássio).
5. Medida _OD600 das culturas com diluições de 1:05 até atingir uma OD ₆₀₀ de 5-6. Calcular o volume necessário para a cultura de 30 ml de meio de infiltração a OD _600. Adicionar 15 ml de tampão de infiltração 2x, em seguida, adicionar _H2O desionizada para tornar o tampão até 30 ml.
6. Tome plantas de estufa e usar uma ponteira para nick do lado abaxial da 3 ^ª a 5 ^ª folha a partir do topo para facilitar a infiltração.
7. Use uma ponteira de nick o lado abaxial das folhas para facilitar a infiltração.
8. Encha uma seringa com meio de infiltração e colocá-lo (sem agulha) em um dos nicks feitas anteriormente. Apoio seringa com um dedo no lado inferior das folhas. Pressione o meio com cuidado para o tecido das zonas folha internervais. Nota: Após a infiltração, cultivar plantas em estufa sob as mesmas condições que as descritas acima. Além disso, manter uma proporção igual de untreated, plantas não-transitórios de expressão (NTEPs) como controles, nas mesmas condições que as plantas infiltrada.

3. Avaliação da TrCel5A-mCherry Expressão em folhas de plantas

1. Depois de 4-6 dias, tome plantas infiltrados com A. Agrobacterium contendo pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry do efeito estufa e colocá-los em um quarto escuro por análise de fluorescência.
2. Para visualizar a fluorescência em secções foliares expressando TrCel5A-mCherry, as plantas de luz usando uma fonte de luz portátil que emite luz verde a 515 nm com um filtro vermelho (620-750 nm). Nota: Em profundidade caracterização da expressão da proteína nas folhas de plantas pode ser conseguida por folhas finas, corte com um vibratome e exame sob luz e microscopia de fluorescência. Para isso, siga os passos abaixo:
   1. Cortar pequenas secções de aproximadamente 5 x 5 mm de tamanho a partir de uma folha infiltrada e incorporá-las em 4% de agarose dissolvido em 50 mM de tampão de fosfato (pH 5,7).
   2. Cortesecção de 80-90 mM de tamanho das folhas incorporadas utilizando um vibratome. Coloque-as sobre uma lâmina de microscópio, cobrir com um tampão ou uma lamela e examiná-las usando um microscópio no aumento de 10x com um detector de fluorescência, usando o mesmo comprimento de onda e filtro indicado acima.

4. TrCel5A extração de folhas de tabaco

1. Cortar pedaços de folhas de tabaco para um peso aproximado de 1 g a partir de plantas infectadas com A. Agrobacterium contendo pTRAkc-ER-TrCel5A e coloque em uma argamassa pré-resfriada com nitrogênio líquido. Adicionar uma quantidade apropriada de azoto líquido para as amostras. Moer deixa de pó usando um pilão pré-resfriada.
2. Adicionar 2 ml de tampão fosfato salino (PBS) contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, para a folha de matéria solo e misturar até que a maior parte da matéria de folha é em suspensão. Extracto de centrifugar a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C e levar sobrenadante contendo proteína.
3. Centrifuge o extracto a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C e levar sobrenadante contendo proteína tendo cuidado para não perturbar o sedimento. Desprezar o pelete.
4. Purificar parcialmente TrCel5A por incubação do sobrenadante que continha a proteína, a 55 ° C durante 10 min. Deixa-se repousar à temperatura ambiente durante mais 10 minutos, depois centrifugar a 15000 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Repita o processo de purificação parcial para plantas não-infiltrados para obter amostras de controle. Usar estas amostras para todas as experiências seguintes. Nota: As soluções de proteína pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana ou a -20 ° C durante até 3 meses.
5. Repetir o processo de purificação parcial por plantas não infiltrada para obter amostras de controlo. Usar estas amostras para todas as experiências seguintes. Nota: As soluções de proteína pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana ou a -20 ° C durante até 3 meses.

5. SDS-PAGE, Western Blot, e Azo-CMC zimografia de TrCel5A-mCherry

1. Compra ou preparar 12% (p / v) géis SDS-PAGE como por métodos estabelecidos ^15.
2. Dissolver CMC em água para obter uma solução a 1,5% (w / v). Para fazer géis de CMC-SDS-PAGE, substitui 1 ml de 1,5% de CMC para 1 ml de água em uma solução de 10 ml de mistura de gel de SDS-PAGE, o que resulta em um 0,1% (w / v) de CMC + 12% (w / v ) mistura em gel de SDS-PAGE. Despeje gel normalmente. Nota: certifique-se de que a CMC na solução inicial é completamente dissolvida por uma combinação de agitação e aquecimento para 40 ° C (repetir directamente antes da preparação da solução de gel).
3. Desnaturar amostras por ebulição na presença de SDS, de acordo com métodos estabelecidos ^12. Como um controlo positivo, usar uma diluição de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. 1:500 reesei, tal como T. reesei ATCC 26921. Como controlo negativo utilizar uma solução de proteínas preparada de modo semelhante a partir de folhas não infiltrados (NTEPs).
4. Efectuar a eletroforese conforme protocolos normais ^15,por exemplo, utilizar ~ 200 V durante 50 min com a electroforese interrompida uma vez a frente do corante atingir o fundo do gel.
5. Manchar um gel de SDS-PAGE utilizando 0,1% (w / v) de azul brilhante de Coomassie e destain usando uma mistura de metanol / ácido acético glacial. Nota: a coloração rápida e de descoloração pode ser realizada por aquecimento suave a coloração e descoloração de soluções, ou seja, usando um forno de microondas para ~ 15 seg para aquecer (mas não ferver) primeiro a coloração e, em seguida, as soluções de descoloração, mudando a solução de descoloração após 10 min ou quando esfriou, e repetir com a nova solução de descoloração.
6. Realizar Western blot de um gel de SDS-PAGE utilizando os protocolos estabelecidos ^16,17. Usar os seguintes anticorpos: um anticorpo policlonal de coelho contra uma região Fc de His-tag (primário) e um anticorpo policlonal de cabra anti-anticorpo de coelho que foi conjugado com uma fosfatase alcalina (secundário). Nota: Os anticorpos secundários devem ser seleccionados para permitir a visualização utilizando nitroazul tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-p-toluidina indolyphosphate sal (NBT / BCIP), tal como descrito ^18.
7. Realizar proteína em gel redobramento no 0,15% (w / v) de gel de CMC de SDS-PAGE através da incubação do gel de 1,5% (w / v) β-ciclodextrina, tampão fosfato-citrato 20 mM, pH 6,5, à temperatura ambiente com agitação suave durante 15 min ^19.
8. Descartar a solução β-ciclodextrina e lavar rapidamente o gel com H ₂ O. Incubar à temperatura ambiente em tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 4,8) durante mais 15 min. Realizar CMC zimografia utilizando a 0,15% de CMC em gel de SDS-PAGE redobradas por incubação do gel em 30 mM de acetato de sódio tampão pH 4,8, durante 20 min a 50 ° C.
9. Realizar CMC zimografia utilizando o redobrado 0,15% (w / v) de gel de CMC de SDS-PAGE através da incubação do gel em tampão de acetato de sódio 30 mM (pH 4,8) durante 20 min a 50 ° C.
10. Corar o gel durante 10 min utilizando um 0.1% w / v de solução de vermelho de Congo e destain durante 30 minutos ou até que as bandas claras são observadas utilizando 1 M de NaCl. Lavar o gel com 0,3% (v / v) de ácido acético para melhor visualização.

6. MUC-4 Ensaio da Actividade de TrCel5A

1. Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4-MUC em 50% (v / v) de metanol, e armazená-lo no escuro à temperatura ambiente
2. Imediatamente antes do ensaio, preparar uma solução de trabalho de 4-MUC 2x, composto de 1 mM de 4-MUC e 60 mM de acetato de sódio, pH 4,8.
3. Realizar este teste em amostras contendo 100 ul de proteína de folha (com ou sem TrCel5A expressa por indução), 100 ul de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. 1:1.000 reesei e puro _H2O, respectivamente. Execute cada uma das amostras em triplicata.
4. Pipete 100 pi da solução de trabalho de 4-MUC em poços separados de uma placa de 96 poços, em seguida adicionar 100 ul de cada amostra.
5. Determinar 0 min ponto temporal de 4-MU fluorescência através de espectroscopia de fluorescência, utilizando um comprimento de onda de excitação de 360 ​​nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.
6. Incubar as placas por 20min a 50 ° C, cobertas com tampas de adesivo para evitar a evaporação. Parar a reacção por congelação (ou pela combinação de 100 mL de 0,15 M de glicina, pH 10,0, e 100 ul de amostra de uma placa separada).
7. Determinar o ponto final de 4-MU fluorescência através de espectroscopia de fluorescência, usando um comprimento de onda de excitação de 360 ​​nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. Subtrair 0 min a partir do terminal (20 min), ponto de tempo para obter a alteração dos valores de fluorescência.

7. Azo-carboximetil celulose Ensaio da Actividade de TrCel5A

1. Preparar um estoque de 1,5% (w / v) Azo-CMC que é armazenada à TA, e uma solução de precipitação contendo 18 mM de acetato de zinco, 0,5 M de acetato de sódio, pH 5 e 80% de etanol (v / v), na loja quarto temperatura.
2. Imediatamente antes do ensaio, preparar uma solução 2x Azo-CMC a trabalhar, composto por 1% (w / v) Azo-CMC (em H ₂ O) e 60 mM de acetato de sódio, pH 4,8.
3. Combinar 50 mL de amostra e 50 ul do trabalhoing solução em tubos de 1,5 ml.
4. As amostras de ensaio contendo 50 ul de proteína de folhas (com ou sem TrCel5A transitoriamente expressa); 100 ul de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. reesei diluído 1:1.000; pura e H ₂ O. Executar amostras e padrões em triplicata.
5. Incubar as amostras durante 20 min a 50 ° C. Parar a reacção por adição de 250 ul de solução de precipitação. Vortex cada amostra vigorosamente durante 10 segundos para garantir soluções foram completamente combinados.
6. Incubar as amostras a temperatura ambiente durante 10 min e, em seguida, novamente vórtice. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 10 min. Remover 200 ul de cada sobrenadante da amostra para uma placa de 96 poços, tendo cuidado para não perturbar o sedimento.
7. Ensaio usando espectroscopia de absorvância a um comprimento de onda de 590 nm.

8. PAHBAH Ensaio de TrCel5A

1. Use um furador para cortar um círculo (~ 5,5 milímetros de diâmetro) de papel de filtro. Adicionar 100 ul de NaAc 60 mM, pH 4,8, e 100 ul de amostras, ou contendo proteína folha (com ou sem TrCel5A por indução expresso) ou um T. comercial mistura de celulase reesei, diluído 1:1000, e incubar com círculos de papel de filtro durante 20 horas a 50 ° C com agitação de 300 rpm. Para cada amostra incubada com papel de filtro, também incubar uma solução duplicata sem papel filtro como amostras-controles individuais.
2. Prepara-se uma 330 mM de p-hidroxi-hidrazida do ácido benzóico (PAHBAH) Uma solução por dissolução de PAHBAH em H ₂ O, com a adição de 5 ml de HCl concentrado, para um total de 100 ml de solução, e armazenamento à temperatura ambiente. Nota: Os melhores resultados são obtidos pela adição do HCl a um menor volume de lama PAHBAH, isto é, 30 ml, que é agitada sob temperatura para ajudar a dissolução, antes de fazer o volume para 100 ml com H ₂ O.
3. Prepare PAHBAH solução B, contendo citrato de sódio 50 mM, cloreto de cálcio 10 mM, e 500 mM de NaOH e armazenamento à temperatura ambiente.
4. Immediately antes do ensaio, preparar uma solução de trabalho de 1,5 x de reagente PAHBAH 1 ml de 9 ml de solução tampão, de armazenar em gelo até à sua utilização (para ser utilizado dentro de 4 horas).
5. Preparar as amostras em termoestáveis ​​0,2 ou tubos de 0,5 ml. Combinar 5 ul de cada solução incubadas com papel de filtro (passo 8.1), 45 ul de _H2O e 100 ul de solução de trabalho de PAHBAH. Controles de exemplo (amostras incubadas sem filtro de papel) deve ser executado nas mesmas concentrações (5 mL da amostra, 45 ₂ O, solução de trabalho de 100 mL PAHBAH mL H). Além disso, teste 5 padrões (5 ul) contendo entre 0 e 0,2 g / L de glicose, e puro _H2O Executar amostras e padrões em triplicata.
6. Incubar as amostras durante exactamente 10 minutos a 100 ° C, depois arrefecer à temperatura ambiente, durante exactamente 10 min. Soluções de pipeta para uma placa de 96 poços e espectroscopicamente ensaio num comprimento de onda de 410 nm. Subtrair amostra-controles individuais (incubadas sem filtro de papel) a partir de amostras para obter últimavalores.

Resultados

TrCel5A e TrCel5A-mCherry foram expressos com sucesso em plantas do tabaco usando o sistema de expressão transiente (Figuras 1A e 1B). O exame do modelo da proteína de fusão TrCel5A-mCherry expressão revelado folhas saudáveis ​​(Figura 1C), que mostrou a expressão de proteínas largamente espalhada sob luz verde (Figura 1D).

Extracção das proteínas totais foi realizada em plantas de tabaco que tinham folhas que continham a pr...

Discussão

A expressão recombinante de celulases é um campo de grande interesse, devido ao desejo de sistemas de produção de biocombustíveis mais eficientes ^1. As plantas oferecem muitas possibilidades para a produção de celulase de sucesso, com recursos como técnicas de colheita econômica e métodos autohydrolysis sendo propriedades muito desejáveis ​​para a produção de biocombustíveis em larga escala. Além disso, o uso de diferentes localizações para a produção de proteínas de permitir, se necessário, as modificações p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4-metilumbelliferil β-D-cellobiosídeo	SIGMA-ALDRICH	M6018
Ácido acético	ROTH	3738
Acetosiringon (concentrado)	ROTH	6003
Antibiótico - canamicina	ROTH	T832
Antibiótico - rifampicina	ROTH	4163
Antibiótico - carbenicilina	ROTH	6344
Anticorpo - coelho anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Anticorpo - cabra anti coelho AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboximetilcelulose	MEGAZYME	S-ACMC
β-ciclodextrina	SIGMA-ALDRICH	C4805
Cloreto de cálcio di-hidratado	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboximetilcelulose	ROTH	3333.1
Celulase de Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo red	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie azul brilhante G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glicose	ROTH	8337
Etanol	ROTH	K928
Papel de filtro - Papel mata-borrão Rotilabo	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
Tampão	MES ROTH	4256
Metanol	ROTH	8388
Citrato de sódio	ROTH	3580
Dodecilsulfato de sódio	SERVA	20765
Hidróxido de sódio	ROTH	6771
Solo, Einheitserde classic	Espectrômetro PATZER GMBH
- Infinite M200	TECAN
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hidroxi benzhidrazida	SIGMA-ALDRICH	H9882
ROTH	1058		tampão fosfato
- BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica