O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

Resumo

O transplante de pele da cauda é um modelo poderoso para estudar a rejeição dependente de células T e a indução de tolerância durante respostas imunes alogênicas em camundongos. As vantagens deste protocolo são pequenas cirurgias invasivas e facilidade de monitoramento sem a necessidade de sacrificar o camundongo receptor.

Resumo

O estudo das respostas das células T e suas consequências durante o reconhecimento do aloantígeno requer um modelo que permita distinguir entre células T doadoras e hospedeiras, monitorar facilmente o enxerto e adaptar o sistema para responder a diferentes questões imunológicas. Medawar e colegas estabeleceram o transplante alogênico de pele da cauda em camundongos em 1955. Desde então, o modelo de transplante de pele tem sido continuamente modificado e adaptado para responder a perguntas específicas. O uso da pele da cauda torna este modelo fácil de pontuar para a rejeição do enxerto, não requer preparo extensivo nem anestesia profunda, é aplicável a animais de todos os antecedentes genéticos, desencoraja a necrose isquêmica e permite intervenção química e biológica.

Em geral, as células T alogênicas CD4⁺ e CD8⁺ são responsáveis pela rejeição de aloenxertos, uma vez que reconhecem antígenos principais de histocompatibilidade incompatíveis de diferentes cepas de camundongos. Vários modelos foram descritos para ativar células T alogênicas em camundongos transplantados de pele. A identificação de moléculas de classe I e II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em diferentes cepas de camundongos, incluindo camundongos C57BL / 6, foi um passo importante para a compreensão e estudo das alorespostas mediadas por células T. No modelo de transplante de pele da cauda descrito aqui, uma mutação de três pontos (I-A^bm12) no sulco apresentador de antígeno da molécula MHC CLASSE II (^{I-A b}) é suficiente para induzir forte ativação alogênica de células T CD4⁺ em camundongos C57BL/6. Enxertos de pele de camundongos I-A^bm12 em camundongos C57BL/6 são rejeitados dentro de 12-15 dias, enquanto enxertos singênicos são aceitos por até 100 dias. A ausência de células T (camundongos CD3^-/- e Rag2^-/-) permite a aceitação do enxerto de pele por até 100 dias, o que pode ser superado pela transferência de 2 x 10⁴ células T selvagens ou transgênicas. As células T transferidas adotivamente proliferam e produzem IFN-γ em camundongos Rag2^-/- transplantados com^bm12 I-A.

Introdução

O transplante de órgãos sólidos, tais como a pele, o coração e os rins já é um procedimento padrão na prática médica mundial ^1. Órgãos transplantados com sucesso pode ser rejeitado pela activação do sistema imune receptor, o qual reconhece os principais antigénios de histocompatibilidade dos dadores. Pacientes transplantados Portanto precisam de tratamento com drogas imunossupressoras ^2. O transplante alogênico de pele em ratos foi estabelecida por Medawar e seus colegas em 1955 e foi útil para identificar as moléculas-alvo mais tarde descrito como complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e II. Desde então, o modelo de transplante de pele tem sido continuamente modificado e adaptado para estudar o papel das subpopulações de células T e a relevância da química e biológica de intervenção na supressão da rejeição do enxerto ^2-4. Pele da orelha e tronco são mais difíceis de preparar e são mais suscetíveis à hipóxia e necrose de pele ^tail-5; no entanto,o procedimento de transplante é semelhante. Além disso, o monitoramento de transplantes de cauda de pele é fácil, devido à textura do cabelo característico da pele.

Este artigo fornece um procedimento detalhado para a classe II do MHC transplante incompatibilidade cauda-de pele que permite que para o estudo de diferentes aspectos dos linfócitos T CD4 ⁺ mediada por células T e tolerância rejeição do enxerto em murganhos. A mutação de três pontos natural na molécula de MHC de classe II IA ^b (chamado IA ^{BM12) 6-9} é suficiente para induzir a rejeição de enxertos de pele em ratos C57BL / 6 ^8. A molécula ^BM12 IA activa as células T CD4 ⁺ com vários receptores de células αβ-T (TCR) cadeias de ratinhos C57BL / 6, entre os quais as células T Vα2Vβ8-específicos de TCR foram identificados, a fim de gerar um ratinho transgénico ^Tc-10. A transferência adoptiva de células T específicos de TCR Vα2Vβ8 tem sido usado para estabelecer um modelo de rejeição em C57B imunodeficienteL / 6 RAG2 ^{- / -} ratos transplantados com IA ^BM12 pele.

As diferenças genéticas entre doador e receptor influência sobre o resultado de aceitação de transplante e rejeição. Existem diferentes tipos de transplantes: auto-enxertos são transplantados a partir do próprio indivíduo receptor; syngrafts e enxertos são transplantes de indivíduos geneticamente idênticos e geneticamente não relacionadas, respectivamente. A aceitação de transplante de órgãos alogénicos foi demonstrada por intervenção química e biológica de pacientes e de modelos de rato ^11,3,4. Numa abordagem básica, anti-CD3 tratadas com anticorpo C57BL / 6 ratos mostraram sobrevivência prolongada de IA ^BM12 cauda-de pele (dados não publicados). A depleção de células T CD4 ⁺ e CD8 ^+, células T antes do transplante em ratinhos receptores resultou na aceitação do MHC de classe I e II enxertos incompatíveis (rev. em ^12). Curiosamente, a rejeição de enxertos de pele depende da presença de células T CD4 ⁺ As células T (Rev. em ^12). Neste modelo, tendo como alvo as interacções específicas entre as células imunes diferentes, bloqueando as moléculas de co-estimulação com anticorpos ou com supressão de células T reguladoras, pode induzir tolerância (dados não publicados). Na verdade, bloqueando tanto CD40 e CD28 levou a longo prazo a tolerância do enxerto de pele ^13,14.

O transplante de pele da cauda-é fácil de realizar e é fácil de monitorizar em comparação com o transplante de outros órgãos. Além disso, os transplantes de pele de cauda são fáceis de preparar e são menos susceptíveis à isquemia do que os outros tecidos da pele. Em contraste com os anestésicos injectáveis, o uso de gás anestésico (isoflurano) durante o transplante de ambos encurta o processo e o tempo de recuperação do destinatário. Curling do transplante de cauda-de pele, o que pode conduzir a cicatrização incompleta e rejeição de enxerto, é evitada por aplicação de adesivo de tecido. Além disso, o modelo de transplante de pele da cauda-IA ^BM12 ativa exclusivamente CD4 ^{+ Células T, tanto em imunocompetentes e camundongos imunodeficientes (do mesmo fundo genético) facilitando a interpretação dos resultados.}

Este protocolo descreve um modelo fiável, reprodutível e facilmente monitorado rato que permite a intervenção química e biológica. O modelo destina-se a investigar a rejeição ea tolerância indução de transplantes de rabo-de pele.

Protocolo

Nesta publicação de vídeo e protocolo, todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com o protocolo de animais aprovados pela Autoridade cantão Basileia-Cidade, Suíça. Execute todos os procedimentos em condições estéreis, sempre que possível.

1. Preparação de Cirurgia

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e gaze antes de usar.
2. Aqueça a almofada quente e organizar instrumentos cirúrgicos sobre a mesa (Tabela de Materiais / Métodos).
3. Abra as ataduras tira dedo. Aplique vaselina na almofada ferida com um cotonete (certifique-se a gaze é completamente coberto).
4. Pesar os ratinhos e administrar analgesia buprenorfina 0,05 mg / kg de peso corporal. Nota: este vai proporcionar analgesia imediatamente após o transplante.

2. Preparação do Cauda-pele para Transplante

1. Eutanásia camundongos doadores (por exemplo, ^BM12 IA) por asfixia CO ₂ e disinfect as caudas com solução desinfetante antes da excisão.
2. Posicione o rabo com a tarja preta para baixo em uma placa de plástico limpo e corte-o longitudinalmente ao longo da linha do meio, fazendo uma incisão superficial envolvendo apenas a camada de pele.
3. Retire a pele da cauda usando uma pinça agarrando.
4. Coloque o rabo-de pele em uma placa de cultura de 10 centímetros célula cheia com 10 ml de HBSS.

3. Procedimento Cirúrgico

1. Anestesiar ratos receptores (por exemplo, ratinhos C57BL / 6) por inalação de uma solução a 3% de isofluorano em uma caixa de indução transparente. Nota: Demora 3-5 min para o mouse para chegar a anestesia plano cirúrgico. Use veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
2. Coloque o mouse sobre a almofada morna e aplique 1,5% isofluorano através de uma máscara boca e bundas cada reflexo animais por toe beliscar.
3. Raspar o site dorsal dos ratos destinatário (por exemplo, C57BL / 6) e remover os pêlos contaminantes usando um sw gaze secaab.
4. Desinfetar local transplante raspada com uma solução asséptica.
5. Aperte a pele com uma pinça no site meio / direita do dorso e usar tesoura curva para fazer uma incisão em torno de cerca de 1 x 0.6 cm.
6. Se ocorrer sangramento, em seguida, limpar a ferida com um cotonete estéril.
7. Avaliar o tamanho da incisão e corta um transplante do tamanho estimado a partir da cauda para a pele usando o bisturi.
8. Apare os cantos para arredondar o transplante.
9. Carregue o transplante no bisturi, o excesso de seca de HBSS em um cotonete estéril e colocá-lo na cama enxerto do mouse destinatário.
10. Evitar a sobreposição de doador e pele de acolhimento e aplicar adesivo de tecido na zona de contato com exclusividade.
11. Aplicar um emplastro sem vincos ao redor da cintura do mouse.
12. Aplique o adesivo curativo não-elástico para fixar o gesso para o mouse (três milímetros deslocado).
13. Inciso com a tesoura cerca de 3 mm no site ventral superior do curativo. Nota: Isto é para evitar trapping dos dentes do rato durante a fase de recuperação.
14. Remova a boca-máscara anestésica e manter os ratos transplantados com a almofada de aquecimento até acordado.
15. Retornar ratinhos transplantados para as suas gaiolas apenas quando totalmente recuperado e avaliar a sua mobilidade para assegurar que a ligadura não seja demasiado apertado.
16. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com etanol 70%, antes de prosseguir com a próxima cirurgia.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Adicionar contendo paracetamol xarope para a água de beber (4 mg / ml), e administrá-lo por 7 dias.
2. Retorno do mouse para a sala de animais, uma vez que se recuperou.
3. Acompanhar de perto os ratos para sinais clínicos, incluindo depressão ou outras alterações comportamentais (comer ou imobilidade), a aparência anormal (falta de higiene) ou postura (pilo-ereção ou postura arqueada) para o tempo o curativo está em vigor (1 semana).

5. Remoção Bandage (6-7 dias pós-transplante)

1. Anesthetize ratos por inalação de uma solução Isofluorano 3% em uma caixa de indução transparente (ver acima).
2. Corte curativo e gesso com uma tesoura da artéria e, cuidadosamente, remova-os. Nota: evitar o estiramento do local do transplante.
3. Monitorar os ratos transplantados para os sinais clínicos (ver 4.3) e marcar para a rejeição de enxertos de pele (Tabela 1). Nota: O sistema de pontuação do enxerto aproveita as diferentes texturas de cabelo na cauda-pele em comparação com o dorsal pele. A aparência do transplante e sua rejeição é classificado em 3 classes. Pele alogênico (MHC II incompatíveis, por exemplo, IA ^BM12) enxertos de camundongos C57BL / 6 imunocompetentes geralmente são rejeitados dentro de 12-15 dias pós transplante (próprios dados e ^15-20).

Resultados

Numa primeira abordagem C57BL / 6 foram transplantadas com IA allografts ^BM12 e IA ^b syngrafts. Após a remoção curativo, enxertos sinais manifestos de cicatrização de feridas, sem encerramento da zona de contato em camundongos C57BL / 6 (Figura 1A). Após a remoção do penso, a inflamação mediada por células T CD4 ^+, conduziu ao aparecimento de áreas necróticas (manchas vermelhas) e rejeição de aloenxertos IA ^BM12 em ratinhos C57BL / 6 no espaço de 13 dias após ...

Discussão

O transplante de pele é um método amplamente utilizado para estudar a rejeição e de tolerância em células T dependentes. Desde foi criado o modelo de transplante de pele, várias adaptações e mudanças foram aplicadas. No procedimento descrito, IA ^BM12 transplante de cauda-de pele é realizada usando gás anestésico (isoflurano). O uso de anestesia gás diminui o tempo de execução e recuperação de ratos, o que diminui o stress em ratos transplantados. O procedimento utiliza tecido adesivo para fixar o tail-pele, q...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução padrão Betadine	Mundipharma
Cotonete	Carl Roth GmbH	31025060
Dafalgan , UPSA	Bristol Myers Squibb UPSA Hansaplast
tiras de dedo	Beierdorf AG	REF.76861
Histoacryl adesivo tecidual	Braun	REF.1050052
Leukotape classic , 2 cm x 10 m	BSN Medical SAS	REF.02204-00
PBS, solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4	Invitrogen	10010015	GIBCO
Gaze estéril, 5 x 5 cm, 8 camadas	MaiMed GmbH	21010
Pinça de padrão estreito	FST	11003-12
Tesoura de íris fina curva	FST	14095-11
Tesoura de íris fina	FST	14094-11
Tesoura Mayo	FST	14010-15
Tesoura de artéria com ponta esférica 11,5 cm	FST	14080-11
Pinça de tecido	FST	11021-14
Lâmina cirúrgica nº 20	Swann-Morton LTD	3006	Aço carbono
Cabos de lâmina cirúrgica	Seringa Swann-Morton LTD
, 1 ml	ARTSANA		Descartável
Temgesic, buprenorfina	ESSEX Chemie AG		0,3 mg/ml
Placas de cultura de tecidos 10 cm, 60,1 cm2	TPP
Vaselina	Vifor SA
Almofada quente	Solis		Tipo 223