In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

Resumo

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

Resumo

O pâncreas é um órgão essencial que regula a homeostase da glicose e secreta enzimas digestivas. A pesquisa sobre a embriogênese do pâncreas levou ao desenvolvimento de protocolos para produzir células pancreáticas a partir de células-tronco ¹. Todo o órgão embrionário pode ser cultivado em vários estágios de desenvolvimento ^2-4. Esses métodos de cultura têm sido úteis para testar drogas e para obter imagens de processos de desenvolvimento. No entanto, a expansão do órgão é muito limitada e a morfogênese não é fielmente recapitulada, uma vez que o órgão se achata

Propomos condições de cultura tridimensionais (3D) que permitem a expansão eficiente de progenitores pancreáticos embrionários de camundongos dissociados. Ao manipular a composição do meio de cultura, é possível gerar esferas ocas, compostas principalmente por progenitores pancreáticos que se expandem em seu estado inicial, ou organoides complexos que progridem para progenitores em expansão mais maduros e se diferenciam em células endócrinas, acinares e ductais e que se auto-organizam espontaneamente para se assemelhar ao pâncreas embrionário.

Mostramos aqui que o processo in vitro recapitula muitos aspectos do desenvolvimento natural do pâncreas. Este sistema de cultura é adequado para investigar como as células cooperam para formar um órgão, reduzindo sua complexidade inicial a poucos progenitores. É um modelo que reproduz a arquitetura 3D do pâncreas e que, portanto, é útil para estudar a morfogênese, incluindo polarização de estruturas epiteliais e ramificações. Também é apropriado avaliar a resposta a pistas mecânicas do nicho, como rigidez e os efeitos na tensegridade celular.

Introdução

Cultura órgão fornece um modelo útil que preenche as lacunas entre o complexo, mas altamente relevante em investigações in vivo ea simulação conveniente, mas aproximado de modelos da linha celular. No caso do pâncreas, não existe uma linha de células perfeitamente equivalente a progenitores pâncreas embora existam linhas de células transformadas que simulam células endócrinas e exócrinas. Todo o pâncreas adulto não podem ser cultivadas; ilhotas isoladas endócrinos pode ser mantida durante algumas semanas, sem proliferação celular e fatias de tecidos podem ser mantidos in vitro durante ⁵ horas. Cultura pâncreas embrionário tem sid....

Protocolo

Este protocolo destina-se a crescer organoids pancreáticas derivados de E10.5 de murino dissociadas células pancreáticas epiteliais.

O protocolo exige aprovação ética para experimentação animal.

1. Dissecção da Dorsal pâncreas Bud de E10.5 embriões de camundongos

1. Sacrifício camundongos cronometrado grávidas no dia embrionário (E) 10,5, abrir o abdômen com uma tesoura, retire os dois cornos uterinos e coloque-os em um prato de 10 centímetros de Petri cheia de fosfato frio salina tampão (PBS) ou Dulbecco modificado meio essencial (DMEM) conservados em gelo. O experimento total a partir do sacrifício a....

Resultados

E10.5 dorsais progenitores pancreáticas dissociadas e semeadas em Matrigel 3D recapitular desenvolvimento pâncreas. Progenitores pode ser mais fácil de ser seguido com repórteres fluorescentes. No nosso caso, usamos um camundongo transgênico que expressa uma proteína GFP nuclear controlada por Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER ^TM-nGFP) (Filme 1), na ausência de tamoxifeno e, portanto, sem ativar Neurog3 ⁴ (Figura 2).

Com o meio de organóide,.......

Discussão

A produção em grande escala de células beta funcionais in vitro ainda é ineficaz ^1. Neste contexto desafiador, estudos de biologia do desenvolvimento pode ajudar a decifrar os sinais exatos que são necessários para a diferenciação das células beta funcionais. Este protocolo permite a manutenção, expansão e diferenciação de células progenitoras pancreáticas embrionárias in vitro. Isso inclui a formação de células beta produtoras de insulina que não co-expressar outros hormônios endócrinas, tê.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15070-063	Estoque mantido em -20 ° C
KnockOut Substituição de soro (suplemento)	Gibco	10828-028	Estoque mantido em -20 ° C
2-mercaptoetanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Estoque mantido em 4 ° C
Acetato de Miristato de Phorbol (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Estoque mantido em -20 ° C
Y-27632 (inibidor de ROCK)	Sigma Aldrich	ab120129	Estoque mantido em -20 °C. Atenção! Estabilidade/fonte é uma fonte frequente de problemas.
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Estoque mantido em -80 ° C
R-spondina humana recombinante 1	R& D	4645-RS-025 / CF	Estoque mantido em -80 ° C
R-spondin 1 de camundongo recombinante	R& D	3474-RS-050	Estoque mantido em -80 &graus; C
FGF1 humano recombinante (aFGF)	R& D	232-FA-025	Estoque mantido em -80 ° C - não incluir para aumentar a produção de células beta
Heparina (Liquemin)	Drossapharm		Estoque mantido em 4 ° C
Humano Recombinante FGF10	R& D	345-FG-025	Estoque mantido em -80 ° C
DMEM / F-12	Gibco	21331-020
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15070-063	Estoque mantido em -20 ° C
B27 x50 (suplemento)	Gibco	17504-044	Estoque mantido em -20 ° C
FGF2 humano recombinante (bFGF)	R& D	233-FB-025	Estoque mantido em -80 ° C
Matrigel	Corning	356231	Stock mantido em -20 ° C
Tripsina 0,05%	Gibco	25300-054	Estoque mantido em 4 ° C
RNAlater - Reagente estabilizador de RNA	Qiagen	76104	Armazene na RT
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Concentração de trabalho: 1,25 mg/ml. Estoque mantido em -20 &graus; C
BSA para reconstituição	Milipore	81-068	Para reconstituição de citocinas  - estoque mantido em -20 > C
Soro fetal de bezerro (FCS)	Gibco	16141079	Estoque mantido em -20 ° C
Bandejas MicroWell de 60 poços	Sigma Aldrich	M0815-100EA
Placas de 4 poços	Thermo Scientific	176740
Placas de 95 poços F fundo	Greiner Bio	6555180
Placas inferiores de vidro	Ibidi	81158
Micropipetas de vidro de descarte	Blaubrand	708745
Microscópio			Estação de imagem Cell® (suporte motorizado invertido Olympus IX81) equipada com uma câmera Hamamatsu ORCA ER B7W e o Ludin Cube and Box. O Leica DMI6000 B está cercado por um Ludin Cube and Box, equipado com uma câmera Leica DFC365 FX e a interface de comando do software AF6000 Expert/Matrix.
Objetiva			Olympus UPLAN FL NA 0,30 ar 9,50 mm 10X longa distância; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 ar 11.0 mm 10X longa distância