Artigo de método
Uma abordagem foi desenvolvida para identificar condições ideais de concentração viral para amostras de água de pequeno volume usando picos de adenovírus humano. As técnicas descritas aqui são usadas para identificar parâmetros de concentração para outros alvos virais e aplicadas à experimentação de concentração viral em larga escala.
A concentração em pequena escala de vírus (volumes de amostra de 1 a 10 L, aqui simulados com amostras de água enriquecidas de 100 ml) é uma maneira eficiente e econômica de identificar parâmetros ideais para a concentração de vírus. Os vírus podem ser concentrados a partir da água usando filtração (eletropositiva, eletronegativa, lã de vidro ou exclusão de tamanho), seguida de concentração secundária com extrato de carne bovina para liberar vírus das superfícies do filtro e, finalmente, concentração terciária resultando em um concentrado de vírus de volume de 5-30 ml. A fim de identificar os procedimentos de concentração ideal, foram avaliados dois filtros eletropositivos diferentes (um filtro de vidro/celulose [1MDS] e um filtro de nano-alumina/vidro [NanoCeram]), bem como diferentes técnicas de concentração secundária; A técnica Celite onde foram avaliados três diferentes tamanhos de partículas Celite (fina, média e grande) seguida da comparação desta técnica com a do método de floculação orgânica estabelecido. Vários aditivos de eluição também foram avaliados quanto à sua capacidade de aumentar a liberação de partículas de adenovírus (AdV) das superfícies do filtro. A celite de partículas finas recuperou níveis semelhantes de AdV40 e 41 aos do método de floculação orgânica estabelecido quando os picos virais foram adicionados durante a concentração secundária. O filtro de vidro/celulose recuperou níveis mais altos de AdV40 e 41, em comparação com um filtro de nano-alumina/fibra de vidro. Embora não seja estatisticamente significativo, a adição de eluente de extrato de carne bovina corrigido com polifosfato de sódio a 0,1% recuperou 10% mais partículas de AdV em comparação com o extrato de carne bovina não alterado.
Vírus entéricos humanos são importantes causadoras doenças transmitidas pela água 1-3, mas são geralmente presentes em números baixos nas águas ambientais contaminados, tornando difícil a sua detecção, sem concentração. Os procedimentos usados para concentrar os vírus incluem, tipicamente, uma etapa de filtração, seguido por eluição do filtro, e concentração secundária do eluato filtro. Um procedimento de filtração comum se baseia em uso de membranas carregadas, tais como filtros electropositivos (recentemente revisados em 4,5). Estes filtros dependem de captura de vírus em suspensão em água usando interacções electrostáticas entre a superfí....
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1. Preparação de material de vidro e Carcaças de filtro
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Seleção Celite
Três tipos diferentes de celite foram testados antes da selecção da variante com melhor desempenho. Celites com multa de partículas de tamanho médio produzido as maiores recuperações de adenovírus. Uso de celites maiores percentagens de recuperação mais baixas para ambos AdV40 e 41 (gama de 32% -100%) (Figura 1). A recuperação média de adenovirus 40 eram de 144% ± 52% (multa), 115% ± 28% (média) e 82% ± 53% celites (grande) de partículas e para AdV41, 13.......
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Filtros electropositiva são úteis na concentração vírus de água; no entanto, estes filtros podem diferir na sua estrutura e composição, que por sua vez poderia alterar a sua eficácia. Para agravar este problema, as estruturas do capsídeo e encargos variam entre cepas de vírus que requerem ser adaptados técnicas de concentração para garantir a recuperação óptima 15. Através de modificações simples das técnicas de concentração existentes (por exemplo, filtros electropositivos, extracto de carne de elui.......
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Sem interesses financeiros concorrentes.
As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente as opiniões ou políticas da Agência de Proteção Ambiental dos EUA. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação de uso.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Nicholas J. Ashbolt e ao Dr. G. Shay Fout pela revisão do manuscrito.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adenovírus 40 estoque | ATCC | VR-931 | |
| Adenovírus 41 estoque | ATCC | VR-930 | |
| Tiossulfato de Sódio | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Pré-filtro 47 mm | Millipore Corp. | ||
| Glicina | Sigma | 50046-1KG | |
| Polifosfato de Sódio | Acros Organics | 390930010 | |
| Tripsina | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Ácido Clorídrico | Fisher | A481-212 | |
| BBL Extrato de Carne | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Extrato de Carne | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Sistema de PCR em tempo real | ABI | N / A | |
| Caixa de filtro de aço inoxidável | Millipore Corp. | ||
| XX2004720 Kit de Extração de DNA de Sangue | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
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