Artigo de método

Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água

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DOI:

10.3791/51744

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3 de fevereiro de 2015

 , 
1U.S. EPA

Neste artigo

Resumo

Uma abordagem foi desenvolvida para identificar condições ideais de concentração viral para amostras de água de pequeno volume usando picos de adenovírus humano. As técnicas descritas aqui são usadas para identificar parâmetros de concentração para outros alvos virais e aplicadas à experimentação de concentração viral em larga escala.

Resumo

A concentração em pequena escala de vírus (volumes de amostra de 1 a 10 L, aqui simulados com amostras de água enriquecidas de 100 ml) é uma maneira eficiente e econômica de identificar parâmetros ideais para a concentração de vírus. Os vírus podem ser concentrados a partir da água usando filtração (eletropositiva, eletronegativa, lã de vidro ou exclusão de tamanho), seguida de concentração secundária com extrato de carne bovina para liberar vírus das superfícies do filtro e, finalmente, concentração terciária resultando em um concentrado de vírus de volume de 5-30 ml. A fim de identificar os procedimentos de concentração ideal, foram avaliados dois filtros eletropositivos diferentes (um filtro de vidro/celulose [1MDS] e um filtro de nano-alumina/vidro [NanoCeram]), bem como diferentes técnicas de concentração secundária; A técnica Celite onde foram avaliados três diferentes tamanhos de partículas Celite (fina, média e grande) seguida da comparação desta técnica com a do método de floculação orgânica estabelecido. Vários aditivos de eluição também foram avaliados quanto à sua capacidade de aumentar a liberação de partículas de adenovírus (AdV) das superfícies do filtro. A celite de partículas finas recuperou níveis semelhantes de AdV40 e 41 aos do método de floculação orgânica estabelecido quando os picos virais foram adicionados durante a concentração secundária. O filtro de vidro/celulose recuperou níveis mais altos de AdV40 e 41, em comparação com um filtro de nano-alumina/fibra de vidro. Embora não seja estatisticamente significativo, a adição de eluente de extrato de carne bovina corrigido com polifosfato de sódio a 0,1% recuperou 10% mais partículas de AdV em comparação com o extrato de carne bovina não alterado.

Introdução

Vírus entéricos humanos são importantes causadoras doenças transmitidas pela água 1-3, mas são geralmente presentes em números baixos nas águas ambientais contaminados, tornando difícil a sua detecção, sem concentração. Os procedimentos usados ​​para concentrar os vírus incluem, tipicamente, uma etapa de filtração, seguido por eluição do filtro, e concentração secundária do eluato filtro. Um procedimento de filtração comum se baseia em uso de membranas carregadas, tais como filtros electropositivos (recentemente revisados ​​em 4,5). Estes filtros dependem de captura de vírus em suspensão em água usando interacções electrostáticas entre a superfície de filtro (carregado positivamente) e partículas de vírus segmentados (carregada negativamente). Dois filtros electropositivos que estão disponíveis comercialmente confiam nesta tecnologia, os filtros de vidro / celulose e nano-alumina / fibra de vidro. Os custos de filtro de vidro / celulose são até 10 vezes maior do que a nano-alumina / fibra de vidro, o que limita o uso do vidro / cefiltros llulose para monitoramento de vírus de rotina. Estudos recentes concluíram que as diferenças são nominais entre estes dois filtros em recuperação de enterovírus de 6,7 água do ambiente, o que justifica o uso de um filtro alternativa mais barata. Outras opções de filtros, como filtros electronegativos e de fibra de vidro foram estudadas, no entanto, que quer impor ao pré-tratamento da água de nascente (filtros electronegativos) ou não estão disponíveis comercialmente (filtros de fibra de vidro). O desenvolvimento de processos de concentração de vírus tenha focado principalmente na optimização das técnicas de concentração primária (filtros), a fim de melhorar a recuperação de vírus a partir de água. No entanto, os procedimentos de concentração secundários, os quais reduzem o volume de eluente, tipicamente de 1 L para mililitro volumes, também pode ter um impacto significativo sobre a recuperação de vírus 8.

Concentração Secundária de vírus entéricos normalmente se baseia em um agente de floculação, como alguns tipos de extrato de carne bovina (floccu orgânicamento) ou floculação leite desnatado 9-12 para remover partículas do vírus a partir de superfícies de filtro. Recentemente, um outro processo de concentração secundária utilizando extracto de carne juntamente com a adição de Celite (partícula fina) mostrou-se promissor para a recuperação de adenovírus, enterovírus, e norovírus 8,13,14. Obras de concentração de celite sob princípios semelhantes aos do método de floculação orgânico em que as partículas de vírus para anexar e são libertados de partículas (ou flocos de celite), alterando o pH da solução de suspensão. As comparações entre estas duas técnicas de concentração secundários foram avaliadas em recuperação de adenovírus cravado (Adv) tipos 40 e 41 8. Este estudo concluiu que as duas técnicas de concentração secundários foram estatisticamente semelhantes em recuperação de adenovírus. No entanto, o método de floculação biológica requer um 30 min. de incubação a pH 3,5, enquanto que a técnica de celite requer uma incubação mais curto (10 minutos) a pH 4,0. O flocculat orgânicaião também requer a utilização de equipamento de laboratório caro (centrífugas), para recolher as partículas de flocos durante a concentração terciária, a técnica de celite em contraste utiliza apenas equipamentos básicos de laboratório (filtração no vácuo) para separar as partículas de celite suspensão.

Determinadas combinações de filtros e técnicas de eluição secundárias pode também afectar as recuperações de vírus. Um estudo concluiu que certas combinações de (filtros) electropositivos primárias e secundárias técnicas de concentração (Celite ou floculação orgânica) teve um impacto significativo de recuperação de adenovirus 13. Estes resultados sugerem que a optimização é necessária, a fim de recuperar o vírus alvo de forma óptima a partir de uma dada matriz de água quando se utiliza estas técnicas. Optimization é um demorado, árduo processo muitos pesquisadores evitam ativamente desde inúmeras variáveis ​​serão avaliadas (tipo de filtro / marca, solução de eluição pH, Celite / floculação orgânica).

Para este study, foi desenvolvido um processo para identificar as condições óptimas para a concentração de vírus a partir da água utilizando adenovírus humano cravado estirpes 40 e 41. Presumivelmente, uma vez que cada tipo de vírus exibe uma morfologia única e capsídeo cápside carga específica, protocolos de concentração pode necessitar de ser optimizado para cada vírus alvo, a fim de alcançar a recuperação viral ideal. Este estudo fornece uma abordagem para AdV 40 e 41 concentração por: 1) avaliar as recuperações de vírus na água da torneira usando discos de filtro electropositivos seguidos de 2) avaliação de um método de floculação orgânica estabelecida versus a técnica de celite como uma concentração secundária, e 3) avaliação da tampões de eluição para a concentração terciária.

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Protocolo

1. Preparação de material de vidro e Carcaças de filtro

  1. Salvo disposição em contrário, esterilizar todos os copos, caixas de filtro e soluções a 121 ° C por 15 min. Para garantir a esterilidade, cobrir todas as aberturas ou as superfícies expostas, quer com a folha de alumínio ou papel fixada com fita antes da esterilização.
  2. Montar aparelho de filtração, anexando carcaça do filtro (47 mm de diâmetro) para 1 L Erlenmeyer braço lateral. Recolha filtros necessários: 47 milímetros de diâmetro electropositivos / electronegative filtros de disco.
  3. Prepare 1 L de 1,5% de extracto de carne de bovino (floculação; produz partículas de flocos quando o pH da solução é reduzido para 3,5, ou não-floculação, o que não agregar a pH 3,5), com 0,05 M de glicina, por dissolução de 15 g de extracto de carne em 1 L de água desionizada e adição de 3,75 g de glicina.
    NOTA: extractos de carne não-floculantes irá requerer a adição de celite antes da concentração terciária.
  4. Adicionar eluição polyph aditivo de sódioosphate de extracto de carne a uma concentração de 0,1%.
  5. Adicionar uma solução de ácido clorídrico M, gota a gota, a mistura de extrato de carne, o pH da solução de pH desejado. Extracto de carne autoclave durante 15-30 min a 121 ° C.
  6. Meça 0,1 g de pó fino, médio ou grande celite de partículas (para uso com o não-floculação apenas extrato de carne).
  7. Prepare vácuo / aspiração, anexando tubo compatível para Erlenmeyer de braço lateral e para a saída de vácuo.

2. Preparação de Soluções e vírus Stock

  1. Prepare 1 litro de 1 M de HCl.
  2. Prepare 1 L de NaOH 1M.
  3. Preparar a solução de PBS 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 1,47 mM de K 2 PO 4, e 4,3 mM de NaH 2 PO 4).
    1. Ajustar o pH de 1x PBS a 9,0 usando NaOH 1 M.
  4. Prepare e diluir vírus estoque para 10 4 -10 5 número mais provável (NMP) ml -1 misturando 1 ml de vírus estoque com 9 ml de PBS (pH7), como anteriormente descrito 8,13. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 1 ml.
    1. Esterilizar estoque de vírus por meio de filtragem seringa (0,22 tamanho dos poros) para remover contaminantes potenciais.
  5. Água da torneira sem cloro
    1. Medida 1 L de água da torneira esterilizada utilizando um cilindro graduado estéril e despeje em um copo de 2 L contendo uma barra magnética.
    2. Adicionar 0,7 g de tiossulfato de sódio e misturar até dissolver grânulos. Ajustar o pH da água da torneira para 7-7,5, se necessário usando 1 M HCl ou solução de NaOH 1 M.
    3. Spike vírus Thaw (1 ml) e adicionar volume inteiro de pico para 1 L de água sem cloro torneira esterilizada. Mistura-se durante 10 min.
    4. Preparar um método em branco (sem água declorada adenovírus) com cada experimento e processo da mesma maneira como a amostra enriquecida.

3. Preparação de filtro Millipore Aparelho

  1. Retirar cobertura estéril sobre caixa do filtro. Garantirbom ajuste entre a caixa do filtro bacia superior e inferior da tela do filtro para evitar a fuga de amostra durante a filtração.
  2. Retirar cobertura estéril a partir de 1 frasco L Erlenmeyer. Assegure-se que a cortiça da unidade de filtro se encaixa perfeitamente na abertura superior do balão de Erlenmeyer, criar uma boa vedação.
  3. Remover bacia superior do filtro do filtro de tela menor e coloque 47 milímetros disco filtro electropositive diretamente sobre a tela com uma pinça estéril. Anexar caixa do filtro tigela para a tela de fundo e bloquear no lugar por torção anti-horário.

4. Toque em Filtragem de água (Concentração Primário)

  1. Medir 100 ml de vírus cravado água da torneira usando estéril proveta graduada.
  2. Despeje 100 ml de vírus cravado a água da torneira em carcaça de filtro contendo um filtro de 47 milímetros de vidro plissado / celulose ou de um filtro de disco de fibra nano-alumina / vidro.
  3. Deixe a água passar lentamente pelo filtro. Aplicar vácuo suave para remover os resíduos restantes oágua da torneira f da superfície do filtro.
  4. Se utilizando tratamento com tripsina, adicionar 5 ml de tripsina a 0,25% para filtrar superfície e incubar durante 5 min.
  5. Lavar tripsina da superfície do filtro com 50 ml de água desionizada estéril.

5. Vírus de eluição Filtrar

  1. Remover caixa do filtro de 2 balão L Erlenmeyer, e coloque-frasco de 250 ml de braço lateral.
  2. Medir 100 ml de extrato de carne usando proveta graduada. Juntar cuidadosamente 100 ml de extrato de carne em carcaça de filtro.
  3. Permitir extrato de carne bovina para derramar através do filtro, captando extrato de carne em um pequeno (250 ml) Erlenmeyer. Aplicar vácuo para puxar através de extrato de carne residual de filtro.

6. Celite Concentração Secundário

  1. Frascos de transferência contendo os vírus eluídas a uma placa de agitação. Adicionar estéril barra magnética e lugar na placa de agitação, mistura para criar ligeiro vórtice.
  2. Adicionar 0,1 g de celiteem pó a 100 ml de extracto de carne e permitir celite para dispersar. Coloque sonda pH estéril em extrato de carne.
  3. Adicionar gota a gota 1 M HCl de extrato de carne bovina para atingir pH 4.0. Permitir que a mistura lentamente, durante 10 min.
  4. Colocar 47 milímetros pré-filtro no alojamento do filtro (como descrito anteriormente) utilizando um balão de Erlenmeyer de 2 L.
  5. Despeje 100 ml de extrato de carne / mistura celite sobre pré-filtro. Permitir extrato de carne bovina para derramar through. Aplique uma leve vácuo para puxar através de extrato de carne residual de filtro.
  6. Coloque clipe de tubo de metal no final do bico caixa do filtro. Anexar estéril 15 ml tubo de coleta de polipropileno para o clipe tubo de metal. Coloque caixa do filtro de volta para Erlenmeyer.
  7. Adicionar 5 ml de tampão 1x PBS, pH 9.0 sobre celite recolhido em pré-filtro.
  8. Permitir PBS a gotejar através de pré-filtro. Aplique uma leve vácuo para puxar através PBS residual em 15 ml tubo de coleta.

7. Floculação Organic Concentração Secundário

  1. Transfira os copos contendo o vírus eluída a uma placa de agitação. Adicionar estéril barra magnética a 100 ml de extrato de carne e misture para criar ligeiro vórtice.
  2. Coloque sonda pH estéril em extrato de carne.
  3. Adicione 1 HCl M gota a gota a extrato de carne e ajustar o pH para 3,5. Mistura-se durante 30 min.
  4. Verter o eluído em 250 ml de tubos de centrífuga cónicos e centrifugar a 2500 xg durante 15 min a 4 ºC.
  5. Deitar fora sobrenadante tomando cuidado para não para não perturbar o sedimento. Ressuspender o sedimento em 5 ml de 1x PBS, pH 9.
  6. Centrifugar a suspensão a 4000 xg durante 10 min a 4 ºC. Retirar o sobrenadante e descartar o pellet.
  7. Ajustar o pH a 7-7,5, filtro de esterilização através de filtro de seringa de 0,22 um e congelamento a -80 ° C.

8. Viral Extraction Nucleic Acid

  1. Extrai-se os ácidos nucleicos virais utilizando um kit comercial adequado de acordo com as instruções do fabricante.

9. AdV 40/41 qPCR

  1. Use iniciadores e sondas, bem como mistura de reacção e perfis de ciclos térmicos como publicado 8,13.
    NOTA: O limite de detecção estimado para o ensaio é de cerca de 5 unidades de qPCR por reacção.
  2. Adicionar componentes de misturas de amplificação por PCR em concentrações como se segue: Tris 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, 4,5 mM de MgCl 2, 10 mM dNTPs, 10 uM iniciadores e sonda de 1 uM e 0,5 jil de polimerase de modo a que os volumes finais de 45 ul pode ser adicionado ao número adequado de poços no prazo de uma placa de 96 poços de reacção de PCR.
  3. Carga 45 ul de mistura de amplificação de PCR a cada poço adequado de uma de 96 poços, de reacção rápida placa de PCR.
  4. Adiciona-se 5 ul de amostra de ADN extraído a poços apropriados da placa de PCR.
  5. Espelho com vedação da tampa resistente ao calor, girar a placa para mover as gotas para o fundo da PCR poços da placa.
  6. Definir ciclos de amplificação de PCR como Follows: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min.

10. Análise de Dados

  1. Analisar as medições em triplicado de diluições em série de 5 vezes das amostras distribuidas 1: 5 a 1: 625 de diluição intervalo, a fim de determinar o número mais provável (MPN) das partículas virais, como anteriormente descrito 8,13.
  2. Analise diluições em série de 5 vezes de picos experimentais adenovirus abrangendo 1: 5 a 1: 15.625 gama de diluição, a fim de determinar o número mais provável (MPN) das partículas virais.
  3. Usando a calculadora EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), ajustar a calculadora para contabilizar tipo de diluição (1: 5 ou 1:10), o número de diluições realizadas e número de duplicados de amostras em séries de diluição.
  4. Realizar log 10 de transformação dos dados, seguido por normalização para uma unidade de volume (por exemplo, 1 ml, 100 ml, etc. ). Calcular as recuperações para dada experiência por divisão do número de partículas virais presentes na amostra concentra com o número de partículas virais presentes em pontos experimentais.
  5. Avaliar o efeito das diferentes variáveis ​​experimentais (por exemplo, diferentes tipos de Celite, gamas de pH, os diferentes tipos de filtros e diferentes técnicas de concentração secundários) sobre recuperações por AdV realizar testes estatísticos paramétricos ou não-paramétricos (por exemplo, teste-t emparelhado, um ou dois -way ANOVA), dependendo da distribuição dos dados e do desenho experimental.

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Resultados

Seleção Celite

Três tipos diferentes de celite foram testados antes da selecção da variante com melhor desempenho. Celites com multa de partículas de tamanho médio produzido as maiores recuperações de adenovírus. Uso de celites maiores percentagens de recuperação mais baixas para ambos AdV40 e 41 (gama de 32% -100%) (Figura 1). A recuperação média de adenovirus 40 eram de 144% ± 52% (multa), 115% ± 28% (média) e 82% ± 53% celites (grande) de partículas e para AdV41, 13...

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Discussão

Filtros electropositiva são úteis na concentração vírus de água; no entanto, estes filtros podem diferir na sua estrutura e composição, que por sua vez poderia alterar a sua eficácia. Para agravar este problema, as estruturas do capsídeo e encargos variam entre cepas de vírus que requerem ser adaptados técnicas de concentração para garantir a recuperação óptima 15. Através de modificações simples das técnicas de concentração existentes (por exemplo, filtros electropositivos, extracto de carne de elui...

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Divulgações

Sem interesses financeiros concorrentes.

As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente as opiniões ou políticas da Agência de Proteção Ambiental dos EUA. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação de uso.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Nicholas J. Ashbolt e ao Dr. G. Shay Fout pela revisão do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adenovírus 40 estoqueATCCVR-931
Adenovírus 41 estoqueATCCVR-930
Tiossulfato de SódioFluka Chemical Co.72051
Celites #577Fluka Chemical Co.22142
NanoCeram 47 mmArgonideN/A
1MDS 47 mm3M6408502
AP-20 Pré-filtro 47 mmMillipore Corp.
Glicina Sigma50046-1KG
Polifosfato de SódioAcros Organics390930010
TripsinaGibco25200
PBSSigmaP5368
Ácido ClorídricoFisherA481-212
BBL Extrato de CarneBD Biosciences212303
Difco Extrato de CarneBD Biosciences211520
ABI 7900 Sistema de PCR em tempo realABIN / A
Caixa de filtro de aço inoxidávelMillipore Corp.
XX2004720 Kit de Extração de DNA de SangueQiagen 51104
EPA MPNhttp://www.epa.gov/nerlcwww/online.html
AP2004700Calculadora

Referências

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