Ensaios aprimorados de neurotoxicidade in vitro ajudariam na identificação de novos compostos neuroprotetores. A utilidade de um analisador celular baseado em impedância em tempo real para determinar a citotoxicidade e citoproteção em linhagens celulares neuronais e delinear o envolvimento das vias do segundo mensageiro, obtendo assim informações sobre o mecanismo de neuroproteção é apresentada.
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Artigo de método
Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas doenças relacionadas com o cérebro tem a morte celular neuronal envolvida na sua fisiopatologia. Melhoria em modelos in vitro para estudar os efeitos neuroprotetores ou neurotóxicos das drogas e vias a jusante envolvidos ajudaria a obter insights sobre os mecanismos moleculares de neuroproteção / neurotoxicidade e, potencialmente, poderia facilitar o desenvolvimento de drogas. No entanto, muitos ensaios in vitro de toxicidade existentes têm limitações importantes - mais avaliar a neurotoxicidade e neuroprotecção num único ponto de tempo, não permitindo observar o decurso do tempo e a cinética do efeito. Além disso, a oportunidade de coletar informações sobre as vias de sinalização a jusante envolvidos na neuroproteção em tempo real seria de grande importância. No protocolo corrente que descrevem a utilização de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT 2A) agonistas do receptor numa linha de células neuronais sob livre de marcador e em tempo real Conditíons, utilizando medidas de impedância. Além disso, demonstra-se que os inibidores das vias de segundo mensageiro podem ser utilizados para delinear as moléculas jusante envolvidos no efeito neuroprotector. Os requerentes também descrevem a utilidade desta técnica para determinar se um efeito sobre a proliferação celular, contribui para um efeito neuroprotector observada. O sistema utiliza placas de microeletrônica especiais referidas como E-placas que contêm alternando matrizes de microeletrodos de ouro na superfície inferior dos poços, que servem como sensores celulares. A leitura da impedância é modificada pelo número de células aderentes, a viabilidade celular, a morfologia e a adesão. Um parâmetro adimensional chamado Índice celular é derivada das medições de impedância eléctrica e é usado para representar o estado da célula. Em geral, o analisador de células à base de impedância em tempo real permite em tempo real, livre de marcador de avaliação de neuroprotecção e neurotoxicidade, e a avaliação do envolvimento das vias de segundo mensageiro, contribuindo para maisavaliação detalhada e de alto rendimento de potenciais compostos neuroprotetores em vitro, para a seleção de candidatos terapêuticos.
Introdução
Morte das células neuronais desempenha um papel fundamental na fisiopatologia de várias doenças relacionadas com o cérebro 1. A disponibilidade de dados fiáveis e de alto rendimento em ensaios de toxicidade in vitro é fundamental para obter uma melhor visão sobre os mecanismos de neurotoxicidade e ajudar a selecionar moléculas neuroprotetores como candidatos terapêuticas no desenvolvimento de medicamentos 2. No entanto, existem muitas limitações para mais amplamente utilizados em assays.They neurotoxicidade in vitro avaliar a neurotoxicidade / neuroprotecção a um único ponto de tempo, não permitindo resoluçã....
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Protocolo
1 Preparação
- Coloque a estação do analisador de células em tempo real num incubador de cultura de tecido fixado a 37 ° C e com 5% de CO 2. Realizar toda a manipulação de cultura de células e tratamentos farmacológicos em um capuz de cultura de tecidos em condições de esterilidade.
- NOTA: Neuronal linhas celulares que requerem ajustes de temperatura diferentes em relação às condições normais de cultura, deve ser ajustada em conformidade. Para as linhas de células fracamente aderentes, utilizar agentes de revestimento para facilitar a interacção das células com os microeléctrodos de ouro no fundo dos poços da placa de E-96.
- Prep....
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Resultados
Privação de soro leva à diminuição nos valores de índice de células, que podem ser monitorados continuamente com o analisador de células em tempo real
Neurotóxicos estímulos para as células de levar a uma redução nos valores do índice de células, o que pode ser monitorado em tempo real com a técnica apresentada e a dinâmica dos quais é dependente do estímulo neurotóxico específico e do tipo de célula estudada. Figura 2 mostra o aumento em Índice celula.......
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Discussão
O protocolo atual apresenta a utilidade de um analisador de células em tempo real para avaliar de forma contínua e em condições livres de etiqueta os efeitos neuroprotetores / neurotóxicos de compostos em linhas de células neuronais e para obter insights sobre as segundas vias mensageiros envolvidos no efeito.
Embora a utilidade do analisador de células em tempo real para estudar a toxicidade e efeitos das drogas sobre a proliferação celular é geralmente reconhecido, poucos estudos têm usado.......
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Divulgações
Os custos de publicação para o atual vídeo-artigo foram patrocinados pela "ACEA Biociências".
Agradecimentos
O apoio financeiro para os experimentos apresentados no estudo foi fornecido pelo programa Marie Heim-Vögtlin da Swiss National Science Foundation.
Agradecemos à Sra. Johanna Nyffeler por desenvolver um conjunto de programas MATLAB modificados para triagem de diferenças estatisticamente significativas nos dados do analisador de células em tempo real e ao Dr. Yama Abassi pela discussão útil.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| xCELLigence Pacote de sistema RTCA SP | ACEA Biosciences | Nº: 00380601030 | Consiste em Analisador RTCA, Estação RTCA SP e Unidade de Controle RTCA |
| Placa E 96 | ACEA Biosciences | Nº: 05232368001 | Para cultura das células, inseridas na Estação RTCA SP |
| SK-N-SH | ATCC (em parceria com LGC Standards) | HTB-11 | Pode ser substituído por outra linha de células neuronais aderentes de interesse |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Meio de cultura de células |
| Soro bovino fetal | Life Technologies | 16140-063 | Suplementos de proliferação, mas não meio de privação de soro |
| Frasco de cultura de tecidos T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | Para células de cultura, que serão posteriormente plaqueadas na placa E 96 |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | Para tripsinização de células cultivadas em frascos de cultura de tecidos |
| Contador de células Scepter 2.0 Contador de células | Merck Millipore | PHCC20060 | Contador de células automatizado |
| Solução salina tamponada com fosfato | Life Technologies | 10010-015 | Para lavar as células |
| (±)-Cloridrato DOI | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonista para tratamento de cultura celular |
| Cloridrato LY-294002 | Sigma-Aldrich | L9908 | para tratamento de cultura celular |
| Maleato de lisurida | Tocris Bioscience | 4052 | Composto com atividade agonística 5-HT2A para tratamento de cultura celular |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D4540 | Para dissolução de LY-294002 e maleato de lisurida |
Referências
- Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Prot....
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Reimpressões e permissões
