Um Guia para In vivo Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

Resumo

Aqui descrevemos nossa estratégia para obter gravações de unidade única estáveis e bem isoladas de interneurônios inibitórios identificados no córtex de camundongo anestesiado. Os neurônios que expressam ChR2 são identificados por sua resposta à luz azul. O método usa equipamento de gravação extracelular padrão e serve como uma alternativa barata à imagem de cálcio ou patch guiado visualmente.

Resumo

Um grande desafio em neurofisiologia tem sido a de caracterizar as propriedades de resposta e função dos inúmeros tipos de células inibitória no córtex cerebral. Nós aqui partilhar a nossa estratégia para a obtenção estáveis, bem isoladas gravações de uma única unidade de interneurônios inibitórios identificadas no córtex anestesiado mouse usando um método desenvolvido por Lima e colaboradores ^um. As gravações são realizadas em ratinhos que expressam channelrodopsina-2 (ChR2) em subpopulações neuronais específicas. Os membros da população são identificados pela sua resposta a um breve flash de luz azul. Esta técnica - chamada de "PINP", ou Identificação fotoestimulação-assistida de Populações Neuronais - pode ser implementado com equipamento de gravação extracelular padrão. Ela pode servir como uma alternativa barata e acessível a imagiologia de cálcio ou patching visualmente-guiado, com o objectivo de direccionamento gravações extracelulares de células identificadas geneticamente. Here nós fornecemos um conjunto de diretrizes para a otimização do método na prática diária. Nós refinado nossa estratégia especificamente para alvejar as células parvalbumina-positivo (PV +), mas descobriram que ele funciona para outros tipos interneuron, bem como, tais como (CR +) interneurons expressando Calretinin-somatostatina expressando (SOM +) e.

Introdução

Caracterizar a miríade de tipos de células que compõem o cérebro dos mamíferos tem sido um objetivo central, mas há muito indescritível, da neurofisiologia. Por exemplo, as propriedades e funções de diferentes tipos de células inibitórias no córtex cerebral são tópicos de grande interesse, mas ainda são relativamente desconhecidos. Isso ocorre em parte porque as técnicas convencionais de gravação in vivo cegas são limitadas em sua capacidade de distinguir entre diferentes tipos de células. A largura do pico extracelular pode ser usada para separar neurônios inibitórios positivos para parvalbumina de células piramidais excitatórias, mas esse método está sujeito a erros do tipo I e do tipo II^2,3. Alternativamente, os neurônios gravados podem ser preenchidos, recuperados e corados para posteriormente confirmar sua identidade morfológica e molecular, mas este é um processo doloroso e demorado. Recentemente, populações geneticamente identificadas de interneurônios inibitórios tornaram-se acessíveis por meio de imagens de cálcio ou gravações de patches guiadas visualmente. Nessas abordagens, a expressão viral ou transgênica de um repórter de cálcio (como GCaMP) ou proteína fluorescente (como GFP) permite a identificação e caracterização de tipos de células definidos pela expressão do promotor. Essas abordagens usam microscopia de 2 fótons, que requer equipamentos caros, e também são limitadas a camadas corticais superficiais devido às propriedades de dispersão de luz do tecido cerebral.

Recentemente, Lima e colegas¹ desenvolveram uma nova aplicação de optogenética para direcionar registros eletrofisiológicos para tipos neuronais geneticamente identificados in vivo, denominada "PINP" – ou Identificação Assistida por Fotoestimulação de Populações Neuronais. As gravações são realizadas em camundongos que expressam Channelrhodopsin-2 (ChR2) em subpopulações neuronais específicas. Os membros da população são identificados por sua resposta a um breve flash de luz azul. Ao contrário de muitas outras aplicações optogenéticas, o objetivo não é manipular a função do circuito, mas simplesmente identificar neurônios pertencentes a uma classe geneticamente definida, que pode ser caracterizada durante a função cerebral normal. A técnica pode ser implementada com equipamento de registro extracelular padrão e, portanto, pode servir como uma alternativa acessível e barata à imagem de cálcio ou ao patch guiado visualmente. Aqui descrevemos uma abordagem para PINPing tipos específicos de células no córtex auditivo anestesiado, com a expectativa de que os pontos mais gerais possam ser aplicados de forma útil em outras preparações e regiões cerebrais.

No córtex, o PINP é particularmente promissor para investigar as propriedades de resposta in vivo dos interneurônios inibitórios. Os interneurônios GABAérgicos compreendem um subconjunto pequeno e heterogêneo de neurônios corticais⁴. Recentemente, diferentes subtipos, marcados pela expressão de marcadores moleculares específicos, desempenham diferentes papéis computacionais em circuitos corticais^5-9. À medida que as ferramentas genéticas melhoram, pode eventualmente ser possível distinguir morfologicamente e fisiologicamente os tipos separáveis que se enquadram nessas classes amplas. Compartilhamos aqui nossa estratégia para obter gravações de unidade única estáveis e bem isoladas de interneurônios inibitórios identificados no córtex de camundongo anestesiado. Essa estratégia foi desenvolvida especificamente para atingir células positivas para parvalbumina (PV+), mas descobrimos que também funciona para outros tipos de interneurônios, como interneurônios que expressam somatostatina (SOM+) e expressam calretinina (CR+). Embora o PINP seja conceitualmente simples, pode ser surpreendentemente inflexível na prática. Aprendemos uma série de dicas e truques por tentativa e erro que podem ser úteis para outras pessoas que tentam o método.

Protocolo

NOTA: O seguinte protocolo está de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde como diretrizes aprovados pela Universidade de Oregon Animal Care e do Comitê Use.

1. Cirurgia aguda

1. Anestesiar o animal com um cocktail de cetamina-medetomidina, via intraperitoneal (ip) (Tabela 1).
   NOTA: Os ratos usados ​​nestas experiências são gerados pelo cruzamento de um ChR2-EYFP line10 transgénico dependente de cre a Interneuron linhas de driver (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Entrega Viral de ChR2 ou opsinas relacionados devem funcionar igualmente bem, assumindo níveis de expressão semelhantes são obtidos.
2. Antes de iniciar a cirurgia, garantir que as exposições de animais não resposta a uma pitada toe suave. Re-administração de anestésicos durante todo o experimento como necessário para manter este profundidade da anestesia. Se usar anestésicos injetáveis, opcionalmente implantar um cateter ip para injeções de manutenção.
3. Manter o animal hidratado com solução de Ringer com lactato ao longo da experiência (aproximadamente 3 ml / kg / h), por exemplo, utilizando um cocktail de anestésico apropriadamente diluído para injecções de manutenção (Tabela 1) ou solução salina.
4. Colocar o animal em um aparelho de cabeça-holding estereotáxica ou outro. Certifique-se que o crânio é bem protegido. Isto é essencial para a manutenção de gravações de célula única estáveis.
5. Aplicar pomada opthalamic aos olhos para evitar o ressecamento. Manter a temperatura corporal a 36,5-37 ° C.
6. Realize um dreno cisternal para a estabilidade de gravação adicional. Usando uma lâmina de bisturi, remover o tecido a partir da face posterior do crânio para expor a cisterna magna. Faça um pequeno corte na dura para drenar o líquido cefalorraquidiano. Use somente a ponta da lâmina, e evitar entrar em contato com a haste cerebelo ou cérebro.
7. Usando o bisturi, realizar uma craniotomia pequena (~ 2 milímetros ²⁾ sobre a área cortical de interesse (por auditivocórtex, cerca de -2,3 mm posterior do bregma, 4.5 mm lateral da linha média).
8. Remover a dura-máter e cobrir o córtex exposto, com uma camada de agarose a quente 0,5-1 mm de espessura (1,5% de agarose em solução salina, 0,9% de NaCl; aplicam-se a ~ 37 ° C). Manter a húmido de agarose ao longo da experiência pela aplicação periódica de várias gotas de solução salina.

2. Gravação de Set-up

1. Prepare um eletrodo de tungstênio (14/07 mohms, 127 mm de diâmetro, 12 ° ponta cônica, epóxi-revestido). Supercola o eletrodo a um tubo capilar de vidro e adicione psiquiatra tubulação de calor para grip (Figura 1).
2. Monte o eletrodo em um micromanipulator motorizada (ou hidráulica), definida para viajar ortogonal à superfície cortical. Deslize um fio terra sob a pele, contra o crânio. Evitar o contacto com os músculos do lado da cabeça e a parte de trás do pescoço enquanto eles podem gerar artefactos eletromiográficas.
3. Amplificar o sinal elétrico usando um amplificador extracelularli er fi adequado para a gravação em uma única unidade, de preferência equipado com um modo de verificação de impedância. Monitorar a atividade spiking em curso (passa-banda 300 - 5000 Hz) com dois osciloscópios e um conjunto de alto-falantes. Aqui, os dados gravados são digitalizados de forma contínua a uma taxa de amostragem de 10 kHz; picos são extraídos off-line.
4. Avance o eléctrodo através da agarose até que a ponta atinge a superfície do córtex. Observe este passo através de um microscópio. "Zero" esta posição no micromanipulator.
5. Para aproximar melhor a profundidade de gravação, confirmar visualmente que a ponta do eléctrodo sai da superfície cortical, a uma profundidade de zero quando a retirada do eléctrodo na extremidade de uma penetração.
   NOTA: A discrepância entre a leitura do manipulador e da posição do eletrodo observado indica que ele se afastou em relação ao tecido. Isto pode ser causada pela instabilidade do cérebro ou animal, ou manipulador deriva.
   1. Como uma verificação adicional para garantir queeste conjunto de ponto zero corresponde à superfície do córtex, monitorizar potenciais de campo evocadas por estímulo enquanto avança através das primeiras várias centenas de micrómetros de tecido. Ao monitorar potenciais de campo, diminuir o menor corte do filtro passa-banda do amplificador extracelular para 10 Hz. Confirmar que a polaridade do potencial de campo local inverte em torno de uma profundidade de ~ 100 pm, perto da fronteira I / II ¹³ camada. Este é um ponto de referência confiável para o córtex auditivo, mas pode variar para outras áreas corticais.
6. Montar uma fibra óptica acoplada a uma fonte de luz azul (Figura 2) para um micromanipulador manual. Utilizando o microscópio, posicionar a ponta da fibra tão perto da superfície da agarose quanto possível. Centrar o feixe em que o eléctrodo vai entrar no tecido.
7. Regular a saída da fonte de luz com uma unidade de controle capaz de entregar um TTL (lógica transistor-transistor) trem de pulsos de largura e duratio especificadon- por exemplo, um Arduino (Figura 3), um cartão de computador de I / O (como mostrado), ou um gerador de impulsos disponíveis comercialmente.
   1. Monitorar o sinal em ambos os osciloscópios.
8. Meça a potência total da luz (mW) na ponta da fibra óptica, utilizando um medidor de potência. Use esse valor para calcular a irradiância (mW / mm ^2), dividindo pela área da secção transversal do núcleo da fibra. Comece com um valor de intensidade no intervalo de 10 - 15 mW / mm ² e ajuste para baixo, se necessário, até artefactos são eliminados.
9. Verifique a existência de artefatos de luz com o eletrodo na agarose, pronta para entrar no tecido. Comece a busca de trem de pulso (por exemplo, 30 pulsos de luz ms, 500 ms intervalo interstimulus (ISI)).
   1. Elimine artefactos de luz transitórios (Figura 4) por reposicionamento da fibra óptica relativa ao eléctrodo para mudar o ângulo da luz incidente. Se artefatos persistir, tente diminuir o poder da luz. Em the caso raro que os artefatos não podem ser completamente eliminados (apenas minimizado), prolongar a duração do pulso de pesquisa. Isto pode ajudar a identificar os verdadeiros pontos neuronais.

3. Em linha reta PINP-in '

1. Avance o eléctrodo lentamente através do cérebro, a uma taxa de aproximadamente 1 mm / seg. Use um osciloscópio para monitorar a atividade em curso. Por outro lado, desencadear os pulsos de laser.
2. Escutar para o 'de hash "fraco de picos de luz evocado no monitor de áudio, o que indica que o eléctrodo está a aproximar de uma célula ChR2 + e pode muitas vezes ser percebido bem antes de o sinal eléctrico é aparente no osciloscópio. Diminuir a taxa de antecedência.
   NOTA: Se a célula situa-se no caminho do eletrodo, a atividade de luz evocada vai crescer mais (e mais alto). À medida que o eléctrodo se aproxima de uma única interneurónio, vai resolver o hash em pequenos mas bem definidas picos de tamanho e forma uniforme.
3. Assim que lispikes evocado-GHT são grandes o suficiente para desencadear de individualmente no osciloscópio, começar a fazer isso. Ajustar a escala no eixo horizontal para observar a forma exacta da forma de onda de pico.
4. Pare e espere o tecido para resolver. Resistir à tentação para mover o eléctrodo mais perto da célula. Este passo é crítico para uma leitura estável. Se depois de vários minutos a relação sinal-para-ruído não melhorou - isto é, o tecido tem resolvido, mas não trouxe a célula mais perto da ponta do eléctrodo - 5 um avanço adicional e esperar de novo.
   1. Repita esse processo até que o pico ou a calha do potencial de ação pode ser capturada de forma confiável com um limiar de tensão definir bem acima do ruído de fundo (por exemplo, +/- 300 mV ou mais).
      NOTA: Há pouco risco de resultados falso-positivos ou ambigüidade quando PINPing interneurônios inibitórios. A maioria das células pode facilmente seguir um trem de pulsos com duração de 30 ms e inter-pulintervalo de 500 ms si só, ou mais rápido, com um primeiro pico de latência de confiança de 2-5 mseg (Figura 5). A maioria das células fotovoltaicas +, em particular, pode sustentar a disparar para um total de 1 seg (Figura 6). Porque estes são neurônios inibitórios, disynaptic ativação (indireto) não é uma grande preocupação.
5. Durante a gravação, monitorar a atividade em curso no primeiro osciloscópio. Mantenha um olhar atento sobre o tamanho ea forma dos picos usando o segundo osciloscópio. Observe a qualidade de seu som no alto-falante.
   1. Ouça com atenção para mudanças abruptas, que indicam que a célula é qualquer desenho muito próximo ao eletrodo (onde corre o risco de ser empalado ou danificado), ou está se afastando. Se os picos se tornam grandes e distorcida, voltar para fora; se tornam menores, avançar o eletrodo. Mova-se lentamente em 2 mm etapas.
   2. Confirme a qualidade da gravação post-hoc sobrepondo todas as formas de onda de pico, alinhados ao pico ou vale. Variar os thres tensãosegurar. Através de uma ampla gama de valores de limiar, não só deve ser sempre uma forma consistente pico de altura uniforme (Figura 5a).
6. Se em algum momento o sinal torna-se contaminado com pontas de um neurônio vizinho, seguir em frente. Avance lentamente, no off-chance de que o eletrodo vai passar fora do alcance da célula vizinha, mas permanecem na faixa do neurônio alvo. (Isto é geralmente sem sucesso.)
7. Mover o eléctrodo através de toda a profundidade do córtex (900 + im) em cada penetração. Se nenhuma luz neurônios responsivos são encontradas depois de muitas penetrações ou, pelo contrário, as gravações são rotineiramente contaminados com picos de células ChR2- vizinhos, tente um novo eletrodo.
   NOTA: Mesmo dentro de um único lote, a geometria de impedância e ponta de eletrodos individuais podem variar consideravelmente. Ambos os fatores contribuem para a efetiva "Raio escuta" do eletrodo, o que deve ser grande o suficiente para detectar picos de luz evocados while pesquisa, ainda restringido o suficiente para permitir a gravação de um único interneurónio isoladamente.
8. Teste a impedância de eléctrodos como desejado. Para evitar danificar o tecido, fazer isso com a ponta do eléctrodo na parte superior da camada de agarose, bem fora do cérebro. Dentro da faixa de 7-14 mohms, a impedância exata não é um preditor certeza de desempenho, ou rendimento, para esta aplicação. Dito isto, é um proxy razoável para o raio de escuta: eletrodos de baixa impedância pegar mais unidades; de alta impedância, menos.
9. No fim do experimento, os animais a eutanásia por meio institucional-aprovados, tais como sobredosagem anestésica, ou luxação cervical sob um plano de anestesia profunda.

Resultados

Nós aqui partilhar a nossa estratégia para a obtenção de gravações de uma única unidade de interneurônios inibitórios geneticamente classificados no córtex anestesiado rato, utilizando um método optogenetic desenvolvido por Lima et al. A Tabela 1 detalha o cocktail anestésico sugerido, quetamina-medetomidina-acepromazina ⁽¹ ". KMA "). A Figura 1 representa um microeléctrodo de tungsténio, preparado para a gravação. A figura 2 contém um diagrama de ci...

Discussão

Embora PINP é conceitualmente simples, ele pode ser um desafio na prática. Um dos principais determinantes do sucesso é a escolha do eletrodo. O raio de audição eléctrica é o parâmetro crítico. Ele deve ser suficientemente grande para detectar picos de luz evocado quando a ponta é ainda a certa distância a partir de uma célula ChR2 +, de modo que se pode ajustar a velocidade de avanço em conformidade. Ao mesmo tempo, deve ser restringido o suficiente para permitir um bom isolamento única unidade. Ou seja, o eletrodo não...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha ChR2-EYFP	Colônias Jackson	12569
Linha Pvalb-iCre (PV) Colônias	Jackson	8069
Linha Sst-iCre (SOM) Colônias	Jackson	13044
Linha Cr-iCre (CR)	Colônias Jackson	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Tipo III-A, Alto EEO
Micro Point (dural gancho)	FST	10066-15
Tesoura Cirúrgica	FST	14084-09
Bisturi	FST	10003-12 (alça), 10011-00 (lâminas)
Pomada Oftálmica Puralube	Foster & Manta	9N-76855
	Aparelho Harvard	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ Resistência AC, 127 μ m de diâmetro, 12° ponta cônica, Tubo de Vidro Capilar Revestido com Epóxi
	Warner Instruments	G150TF-3
Tubo Termo Retrátil	DigiKey	A332B-4-ND
Acelerador Zapit	DVA	SKU ZA/ZAA	Use com Super Cola padrão.
Amplificador AC de Microeletrodo 1800	AM Systems	700000
MP-285 Micromanipulador Motorizado	Sutter	MP-285
Osciloscópios Digitais de 4 canais	Alto-falantes Alimentados	por TDS2000C
		Modelo Harman JBL  Manipulador Manual Duet
	Scientifica	LBM-7
800 µ m Cabo de remendo de fibra óptica	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Medidor de potência	ThorLabs	PM100D (medidor de energia), S121C (sensor de potência padrão)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	A potência e a eficiência do LED estão aumentando continuamente, por isso recomendamos verificar os produtos mais recentes (www.cree.com).
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