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Artigo de método

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

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DOI:

10.3791/51764

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23 de agosto de 2014

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Biology, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

Neste artigo

Resumo

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Resumo

Uma grande limitação com células-tronco embrionárias (ESC) protocolos de diferenciação atuais é a geração de populações de células heterogêneas. Estas culturas contêm as células de interesse, mas também estão contaminados com CES indiferenciadas, derivados não-neuronais e outros subtipos neuronais. Isto limita a sua utilização in vitro e in vivo em aplicações, tais como em modelagem vitro para a descoberta de drogas ou terapia de substituição de células. Para ajudar a superar isso, linhas de células repórter, que oferecem um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse, podem ser projetados. No entanto, para alcançar este objectivo em células-tronco embrionárias humanas por meio de recombinação homóloga convencional é extremamente ineficiente. Este protocolo descreve a segmentação do homeobox Hipófise 3 (PITX3) lugar em células estaminais embrionárias humanas usando nucleases zinc-finger projetados, que introduzem quebras de DNA de cadeia dupla específicas do local, juntamente com umaPITX3 - EGFP -específico vector dador de DNA. Após a geração da linha celular PITX3 repórter, que podem então ser diferenciadas usando protocolos publicados para a utilização em estudos in vitro, tais como a doença ou modelos de substituição de células terapia de Parkinson.

Introdução

Current células estaminais embrionárias (ESC) protocolos de diferenciação resultar em populações celulares heterogéneas, em particular no que diz respeito à determinação de fenótipos neuronais específicas. Assim, embora as culturas contêm o fenótipo celular desejado, outro neuronal, tipos de células não-neuronais e não-diferenciados estão freqüentemente presentes 1. Estas características de limitar a aplicação da CES derivado de fontes celulares para utilização na terapia de substituição de células e em modelos in vitro da doença.

Linhas de células repórteres genéticos oferecer um meio para visualizar, rastrear e isolar as células de interesse, desde que a expressão da proteína repórter (RP) reproduz expressão endógena. A utilização de promotores imediatamente a montante de uma região codificante do gene podem ser utilizados para derivar os repórteres genéticos bruto mas tais construções não possuem os elementos reguladores que controlam a expressão precisos gene endógeno. Em contraste, a recombinação homóloga ofereceoportunidade de assegurar a expressão de alta fidelidade da RP. No passado, os vectores de direccionamento concebidos para a recombinação homóloga no locus específico de interesse foram utilizados para direccionar RPS em rato (CES mESCs) utilizando electroporação, como um meio de entrega de ADN de 1,2. No entanto, a geração de linhas de células repórteres via recombinação homóloga convencional é extremamente ineficiente para humanos (CES hESCs), e, assim, só tem sido documentada em diversos casos (revista em 3). Ao utilizar uma proteína quimérica engenharia contendo uma fusão de uma nuclease Fok I com motivos de dedos de zinco específicas do local, conhecidos colectivamente como nucleases de dedos de zinco (ZFNs), quebras de ADN de cadeia dupla pode ser introduzida no locus genómico pre-determinado. Quando um vector de ADN com homologia com ambos os lados da ruptura de DNA de cadeia dupla é adicionado, o sítio genómico pode ser reparada por recombinação homóloga, permitindo a incorporação da sequência de ADN dador. Esta técnica provou ser útil fou edição genômica em células primárias humanas 4,5 e 6,7 hESCs. Trabalhos mais recentes tem utilizados activadores de transcrição, como efectoras nucleases (TALENS), factores de transcrição utilizadas por agentes patogénicos 8, para auxiliar na criação de site-specific nucleases 9.

No seguinte protocolo que demonstram a geração de uma linha celular de células estaminais embrionárias humanas repórter por electroporação de um vector de EGFP contendo homólogo direccionamento 6 em conjunto com ZFNs para a homeobox pituitária humana 3 (PITX3) local. Após a seleção de antibióticos por 2-3 semanas, hESCs com DNA corretamente integrado pode ser escolhido manualmente, expandiu e selecionados, inicialmente, via PCR, e posteriormente validada por Southern blotting.

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Protocolo

Todos os procedimentos são realizados numa câmara de fluxo laminar estéril. Todos os meios e as soluções são equilibradas a 37 ° C, salvo especificação em contrário.

1 Expansão de unidades Humanos (hESCs e hiPSCs, WA-09 utilizado no presente protocolo) para transfecção

Nota: Não é necessário ampliar hESCs sobre Matrigel ou Geltrex. hESCs expandidas em fibroblastos embrionários de ratinho (MEFs) pode ser utilizado para a electroporação ou nucleofection seguir um passo de remoção de MEF (ver secção 2.8).

  1. Preparar uma placa de 100 mm x 1 e x frascos de 75cm2 DR4 MEFs a 2,0 x 10 4 culas por cm 2 em meio de MEF (ver Tabela 1) em placas pré-revestidas com 0,1% w / v de gelatina.
    Nota: CF1, BLK6 ou MF1 MEFs pode ser utilizado, no entanto, recomenda-se que as linhas de MEF resistentes a antibióticos são usados, por exemplo, DR410.
  2. No dia seguinte, hESCs passagem num prato 100 milímetros pré-revestida com MEFs preparados na seção 1.1. Para fazer isso aspitaxa hESC meios de culturas pratos, lavar hESCs com solução salina balanceada Ca2 + / Mg2 + Livre de Hanks (HBSS), adicione Dispase (ver Tabela 2 para as quantidades adequadas) e coloque em uma incubadora umidificada a 37 ° C / 5% de CO2. Após a incubação de 3-5 minutos, aspirado e Dispase lavar cuidadosamente 1-2 vezes com HBSS para remover MEFs. Adicionar meios de células estaminais embrionárias humanas (ver Tabela 3) e utilizando um raspador de células, ou 5 ml de pipeta, raspe as colónias para fora da superfície da placa de cultura.
  3. Colete os fragmentos de colônias em suspensão da placa de cultura para um tubo de centrífuga de 15 ml. Placa de cultura Enxaguar com media hESC e transferência para o tubo de 15 ml. Tenha cuidado para não quebrar aglomerados em células individuais ou em pequenos fragmentos.
  4. Centrifugar durante 5 minutos a 160 xg para sedimentar fragmentos da colônia.
  5. Aspirar o sobrenadante. Toque fundo do tubo de 15 ml com o dedo para soltar colônia fragmento pellet. Fragmentos de colônias suavemente ressuspender em media hESC de acordo com a taxa de divisão (normallya dividir proporção entre 1: 4 e 1: 8 é o caso). Tenha muito cuidado para não tornar aglomerados em células individuais ou em pequenos fragmentos como isso vai afetar repique eficiência.
  6. Antes replating fragmentos hES para lavar MEFs 1x com HBSS. Lentamente, adicionar uma quantidade adequada (ver Tabela 2) de suspensão de células contendo fragmentos de células estaminais embrionárias humanas em células estaminais embrionárias humanas a mídia pratos pré-revestidos a MEFs.
  7. Coloque placas de cultura na prateleira na incubadora e mover-se lentamente para trás e para a frente e para os lados para distribuir uniformemente fragmentos da colônia.
  8. Substituir mídia hESC diária.
  9. Para preparar meios condicionados de MEFs (MEF-CM) lavar os 75 cm 2 frascos pré-revestida com MEFs 1 x com HBSS. Adicionar media hESC. Após 24 horas, recolher meios condicionados e substituir com media hESC fresco. Repita diariamente por um período máximo de 12 dias. Armazenar MEF-CM a 4 ° C até ser necessário.

2 Preparação do CES Humanos para transfecção

  1. Observar o crescimento de hESCssob um microscópio diariamente. Quando as colônias tornam-se 40-50% confluentes, a placa 3 x 100 mm pratos com 2,0 x 10 5 MEFs por cm 2.
  2. Quando as colônias tornam-se 60-70% confluentes eles estão prontos para ser transfectados. colônias 'noivo', removendo colônias diferenciados ou para núcleos de colônia.
    Observação: Como acreditamos maior eficiência de transfecção e segmentação ocorrer quando as células estão na fase de crescimento logarítmico, é sugerido que a electroporação ser conduzida antes de chegar hESCs ≥ 70% de confluência.
  3. Lave colônias hESC com HBSS e adicionar Accutase.
    Nota: Não é necessário hESCs para o pré-tratamento com inibidor ROCHA Y-27632 inibição suficiente ocorrerá quando incubadas com Y-27632 durante a etapa 2.7
  4. Incuba-se durante 10 - 20 min a 37 ° C / 5% de CO 2 até colónias são processados ​​células individuais como visto sob um microscópio. Tritura-se com células de uma pipeta de 1 ml.
  5. Adicionar media hESC e filtro em um tubo de 15 ml utilizando uma straine 40 um celularr para remover aglomerados de células.
  6. Centrifugar a 160 xg por 5 min. Ressuspender pellet celular em media hESC frescos e repita para remover qualquer solução Accutase residual.
  7. Ressuspender as células em meio contendo 10 uM de hES Y-27632 e transferir a suspensão de células totais de uma placa de 100 mm Pré-revestidas com gelatina.
  8. Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante um período mínimo de 30 min.
  9. Durante este tempo MEFs vai aderir ao prato revestido de gelatina. Recolhe hESCs não aderentes utilizando uma pipeta de 1 ml em 15 ml de um novo tubo de centrífuga e determinar a densidade de células utilizando um hemocitómetro.

3. Eletroporação de hESCs

  1. Meio Filtrante CM-MEF usando um filtro de 0,22 um e adicionar 10 fator de crescimento de fibroblastos humana recombinante ml / ng 2 (rhFGF2).
  2. Transferir 7,5 x 106 hESCs de secção 2.9 para um novo tubo de 15 ml e centrifugar a 160 xg durante 5 min.
  3. Durante esse tempo, criou o electroporator: Select programa para ELE exponencialctroporation e definir os seguintes parâmetros, Tensão: 250 V, Capacidade: 500 mF, e Resistance: ∞-.
  4. Aspirar o sobrenadante e re-suspensão da pelota celular em 0,8 ml de gelado de 0,22 um filtrado HBSS. Transferir a solução para um estéril 0,4 centímetros de eletroporação cuvete.
  5. Adicione-TV-hPITX3 frente segmentação construção (30 mg DNA) e misture delicadamente com uma pipeta de 200 mL. Incubar em gelo por 5 min. Durante este tempo, retire uma alíquota de PITX3 ZFN mRNA e descongelar em gelo. Quando descongeladas transferência 7,5 ul de ADN de ARNm de ZFN mistura / célula em cuvete de electroporação. Misture delicadamente com uma pipeta de 200 mL.
    Nota: O local a ser alvo é o principal fator que contribui para o direcionamento eficiência. Codificação Loci genes silenciosos, genes não expressos na CES, como PITX3 são difíceis de atingir usando recombinação homóloga convencional 6. Assim, este protocolo utiliza costume ZFNs projetado para o locus PITX3 humano para induzir um DNA dupla vertente break.
  6. Electroporate, seguindo as instruções na tela no electroporator.
  7. Usando uma pipeta de 200 uL transferir o conteúdo da cuveta de electroporação com um tubo de 15 ml contendo 10 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. Lave a cuba duas vezes com 200 mL de mídia hESC cada vez e transferir para um tubo de 15 ml. Haverá "muco-like" detritos que consiste em DNA e proteínas das células lisadas que irá impactar negativamente a sobrevivência das células. Centrifugar a 160 xg por 5 min para remover os entulhos.
  8. Aspirar o sobrenadante e bata suavemente pellet celular para soltar. Re-suspender em 30 ml suplementados MEF-CM contendo 10 mM Y-27632 e replate para 3 x 100 mm pratos preplated com MEFs.
  9. Troque a mídia diariamente. No dia 2, Y-27632 pode ser retirado e as células cultivadas em apenas media hESC.
  10. Depois de 2-3 dias o hESCs deverá ser de 50-70% confluentes. Neste ponto começa selecção de antibiótico (por exemplo, 0,5 ug / ml de puromicina).
  11. Manter selexão adicionando fresco media hESC / �puromicina diária. Depois de ~ 7 dias pequenas colônias devem ser visíveis. Se MEFs resistentes a antibióticos não são utilizados, MEFs pode ser suplementada pela adição de um adicional de 1,0 x 10 células por 4 cm2.

4. Picking Clones Transgênicos hESC

  1. Cerca de 14-21 dias após a seleção (quando as colônias atingiram ~ 1 milímetro de diâmetro) para preparar as placas de expansão e de triagem. Começar por descongelamento de uma alíquota de Matrigel ou Geltrex a 4 ° C durante um mínimo de 5 horas. Dilui-se de acordo com as instruções dos fabricantes e adicionar 75 ul a cada poço de placas de 3 x 96 poços. Prepare pratos 3 x 48 poços por plaqueamento MEFs a 2.0 x 10 4 células por cm 2. Incubar as duas placas O / N a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. No dia seguinte dissecar colónias em 16-25 peças usando uma agulha 21 G na extremidade de uma pipeta de 2 ml por meio de corte de uma grade.
  3. Aspirar Matrigel a partir de placas de 96 poços e substituir com Supplemmídia entadas CM-MEF. Lave MEFs em placas de 48 poços 1 x com HBSS e add media hESC.
  4. Usando uma pipeta de 200 uL suavemente transferir uma terços da colónia dissecado em uma placa de 48 poços para expansão. Transferir o outro dois terços da colónia dissecado em uma placa de 96 poços contendo meio correspondente CM-MEF suplementados.
  5. Manter ambas as placas, alterando os meios de comunicação diária (suplementado meios de CM-MEF para placas revestidas matrigel 96 poços e meios de células estaminais embrionárias humanas para placas de 48 poços contendo MEFs; ambos suplementados com 0,5 ug / ml de puromicina).
  6. Expandir até placas de 96 poços são 100% confluentes e, em seguida, inicialmente através de rastreio por PCR.

5. Triagem e Expansão das clones positivos

  1. Para preparar DNA genômico (método baseado em 11) Remova todas as mídias placas invertendo, em seguida, seque em papel toalha.
  2. Lavar cada poço duas vezes com PBS temperatura ambiente (100 ul / poço de cada lavagem), inverter e blot como no passo 5.1. Coloque as placas a -80 ° C fou 1 - 2 h para auxiliar na lise celular (placas podem ser armazenadas indefinidamente como este).
  3. Enquanto as células são uma temperatura entre -80 ° C fazer sarcosil Tampão de Lise (ver Tabela 4) (50 uL / poço). Para lisar as células, as placas quentes durante 5 min à temperatura ambiente, em seguida tampão de lise pipeta em cada cavidade. Selar as bordas de cada placa com fita, coloque em um recipiente lacrado contendo papel toalha umedecido para criar umidade, e incubar O / N a 60 ° C.
  4. Após a incubação, adicionar 150 ul de NaCl 5 M a 10 ml de -20 ° C de etanol absoluto, misturar bem e adicionar 100 ul a cada poço (Nota: etanol vai turva quando é adicionado NaCl). Placas Toque suavemente para misturar (não pipeta) e deixe por um mínimo de 30 minutos em temperatura ambiente. Durante este tempo, a solução irá clara e o ADN precipitar.
  5. Remova a solução tal como no passo 5.1, em seguida adicionar 150 ul de etanol a 70% a cada poço. Inverta placa suavemente e apaga como antes. Repetir esta etapa umas 2x.
    Nota: Como o DNA precipitado naturalmente Adheres para a cultura de tecidos de plástico não se soltar durante essas etapas de lavagem.)
  6. Após a lavagem final, as placas brevemente centrífuga a uma velocidade superior a concentrar-se o DNA para o fundo de cada poço em seguida secar ao ar à temperatura ambiente (ou 37 ° C) durante pelo menos 30 min.
  7. Adicionar 40-50 uL T0.1E (pH 8,0) (ver Tabela 5) ou TE (pH 8,0) a cada poço e colocam as placas a 65 ° C durante 1 h ou a 4 ° CO / N antes de usar para a PCR. Ressuspender o ADN batendo suavemente os lados da placa. Use 1-2 uL da re-suspensão de ADN / 10 uL da reacção de PCR.
  8. Usando o Modelo longo PCR System Expandir com hPITX3 L braço gen. F e G hPITX3 braço GFP R primers realizar a triagem inicial de clones a 58 ° C de recozimento, 45 seg de extensão, 35 ciclos.
  9. Amostras de electroforese com 1kb Hyperladder em um gel de agarose a 1% contendo GelRed a 100 V durante 45 min e detecção de clones positivos por meio de iluminação UV.
  10. Validar clones positivos de PCR por digestão de ADN genómico a partir de expaclones NDED (ver abaixo) com HindIII e hibridação de sondas de 5 'e 3' dos braços de vector de homologia para uma mancha de Southern (conforme anteriormente descrito em 1). As sondas são gerados por PCR utilizando os pares de iniciadores hPITX3 sonda 5 'F e R, e hPITX3 3' da sonda F e I, digerido com EcoRI e ligado num vector de clonagem geral.
  11. Dependendo do número de clones positivos, preparar duas cavidades de uma placa de 6 poços por pré-plaqueamento (MEFs com 2,0 x 10 células por 4 cm2).
  12. No dia seguinte, pré-tratamento de clones positivos na placa de 48 poços com 10 uM Y-27632 por um período mínimo de 1 hora.
  13. Lave clones positivos com HBSS e adicione 300 ml de Accutase.
  14. Quando as colônias são prestados células individuais, adicionar 1 ml de mídia hESC e recolher em um tubo de 15 ml.
  15. Troque a mídia diariamente. No dia 2, Y-27632 pode ser retirado e as células cultivadas em meio hESC.
  16. Quando as colônias são 70-80% confluentes, subcultura e congelar o resto do colofragmentos NY.

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Resultados

Após a co-electroporação do projetado PITX3 par dedo de zinco, juntamente com o PITX3 - ADN de EGFP -específico doador vector e subsequente selecção de puromicina, os clones de células estaminais embrionárias humanas positivas foram inicialmente detectadas por meio de rastreio por PCR genómico (Figura 1). Hibridação de mancha de Southern destes clones positivos de PCR com 5 'e 3' de sondas específicas confirmada direccionamento correcto ao exão 1 do locus PITX3

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Discussão

A geração de linhas celulares repórter oferece um meio poderoso para rastrear, visualizar e isolar as células de interesse de uma população heterogênea derivado de hESCs. No entanto, a abordagem selectiva de genes através de recombinação homóloga convencional provou ser extremamente ineficiente para o CES humanos 3. Neste protocolo, descrevem uma técnica relativamente simples para a introdução de uma RP para um exão do locus PITX3, em hESCs utilizando um vector de direccionamento amplamente disponíve...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Trabalho descrito neste protocolo foi possível graças ao financiamento do Governo de Victoria, como parte de uma aliança de colaboração com o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fibroblastos Embrionários de Camundongo (DR4)GlobalStemGSC-6004G
Gelatina SigmaG1393-100ML
HBSS, sem Cálcio, sem Magnésio, sem Fenol Vermelho (HBSS)Life Technologies14175-095
DispaseStemCell Technologies7923
Raspador de CélulasCorning3008
AccutaseLife TechnologiesA11105-01
Y27632Axônio MedchemAxônio 1683
Filtro de Células - 40 μ mBD Biosciences352340
33 mm - 0,22 μ m filtroMilliporeSLGP033RS
rhFGF2R& D Systems233-FB-025/CF
ElectroporatorBioRad165-2661
Cubeta de eletroporação de 0,4 cmBioRad165-2088
Human TV-hPITX3-construção de direcionamento frontalAddgene31942
ZFN Kit; Humano PITX3Sigma-AldrichCKOZFN1050-1KT
PuromicinaInvivoGenant-pr-1
MatrigelBD Biosciences354277
GeltrexLife TechnologiesA1569601
NaClSigma-AldrichS3014
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies10566-016
Soro Fetal Bovino, Qualificado, Inativado por Calor, Origem dos EUA (FBS)Life Technologies16140-071
Pen/StrepLife Technologies15070-063
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Life Technologies11320-033
KnockOut Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828-028
Aminoácidos não essenciais MEM  (NEAA)Life Technologies11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
ß-mercaptoetanolLife Technologies21985-023
Solução de sal de sódio N-Lauroilsarcosina (Sarcosyl) (30%)Sigma-Aldrich61747
EDTASigma-AldrichE9884< / a >
Cloridrato de TrizmaSigma-AldrichT3253
Solução de proteinase K (20 mg / ml)Bioline AustraliaBIO-37084
Expand Long Template PCR SystemRoche Australia11681834001
hPITX3 L arm gen. F (primer): 5 ' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'GeneWorks, Austrália
hPITX3 Braço em L GFP R (primer): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'GeneWorks, Austrália
HyperLadder 1 kb Bioline AustraliaBIO-33025
GelRedJomar Bioscience, Austrália41003

Referências

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Repórter PITX3EletroporaçãoSouthern BlottingTriagem por PCRCocultura de MEFDissecção de ColôniasSeleção por Antibióticos
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