Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

Isolamento de RNA com elevada integridade é necessária para experiências de biologia molecular de rotina, tais como transferência Northern ^9, qRT-PCR ¹ ou a expressão do gene de perfil ^5. A maioria dos métodos contemporâneos de isolamento de ARN são baseados em modificações dos protocolos de tiocianato de guanidina ^{2, 3.} Tiocianato de guanidina é uma grande proteína desnaturante e vai efectivamente interromper a actividade de ribonuclease sob a maioria das condições. O método popular de Chomczynski e Sacchi ³ combinada de fenol na solução de tiocianato de guanidina a lise, reduzindo o tempo de isolamento de cerca de 4 horas. Muitos reagentes de extracção de RNA comercialmente disponíveis baseiam-se no método de Chomczynski e Sacchi ^3.

Ribonuclease tecidos ricos, como pâncreas humano ou mouse apresenta um desafio adicional para isolar RNA. Rato pâncreas pode conter até 75 mg de ribonuclease ⁶ alguns dos quais será lançado during destruição do tecido pancreático resultante em autólise tecido. As modificações dos protocolos de tiocianato de guanidina foram utilizados com êxito para isolar o ARN a partir de pâncreas com alta integridade ^{2, 4, 7, 10.} Infusão de ARN estabilização reagente em rato pâncreas isolamento facilitada do RNA com elevada integridade ^{4, 7, 10,} no entanto, a infusão de soluções para o pâncreas exige muita destreza, pode exigir instrumentos especializados, como um microscópio de dissecação e interrompendo a arquitetura do tecido durante o procedimento pode resultar em lise celular. Perfusão tecidual com reagente estabilização RNA pode interferir com outras aplicações, incluindo o isolamento de proteínas e coloração histológica. Além disso, esta técnica não é adequada para o isolamento de RNA a partir de pâncreas humanos. Outros protocolos requerem a preparação de soluções específicas pelo pesquisador ^2.

Relata-se um protocolo para isolar RNA com alta integridade de rato pâncreas. The protocolo utiliza elementos de métodos publicados anteriormente e é em grande parte baseada nos protocolos de reagentes padrão fenol / guanidina à base de tiocianato de lise. Ela não requer a preparação de soluções especializados, nem requer a infusão de reagentes para o pâncreas. As etapas críticas para o isolamento do ARN de sucesso incluem uma alta fenol / à base de guanidina lise reagente à relação do tecido, remoção de tecido não digerido antes da separação de fases e a inclusão de um inibidor da ribonuclease-se à solução de ARN resultantes. Usando estas e outras modificações, que tipicamente isolar o ARN com RIN superior a 7 para ser utilizado para análise da expressão do gene de rotina.

1. Preparação

As seguintes práticas aderir às políticas estabelecidas pelo Animal Care and Use Committee da Instituição (IACUC).

1. Recomenda-se a isolar não mais de 6 pâncreas do rato em qualquer dia. Tenha todos os instrumentos cirúrgicos limpos e autoclavados, um conjunto por animal.
2. Rotular todos os microtubos. Quatro tubos de 2 ml por animal.
3. Colocar 8 ml de reagente de lise em 50 ml de tubos de centrífuga em gelo. Nota: Embora o kit de purificação trata com um reagente fenol de tiocianato de guanidina, que é adequado para o isolamento de pâncreas, de reagente de lise é usado por causa dos grandes volumes de que são necessárias por isolamento.
4. Dispensar cerca de 10 ml das seguintes soluções em tubos de centrífuga de 15 ml para a limpeza lâminas do homogeneizador. O etanol, 70% (2 tubos), HPLC água (1 tubo) e água de grau HPLC, contendo cerca de 200 mL de RNase afastado ou inativador ribonuclease equivalente.
2. Cirurgia, Dissection Pâncreas e homogeneização
1. Coloque 1-2 ml de isoflurano em um frasco contendo gaze de algodão ou toalhas de papel. Os ratos são colocados numa plataforma que os impede de se atingir a fonte de isoflurano. Adicionar isoflurano fresco para o frasco antes de anestesiar cada rato.
2. Delicadamente, coloque o mouse no frasco contendo o isoflurano. Tampe o frasco e monitorar os efeitos da anestesia, rodando suavemente o frasco e para trás. O animal é anestesiado, uma vez que está na incapaz de ficar na sua "própria.
3. Para confirmação da anestesia, remover o animal do frasco e aplicar uma pitada do dedo do pé firme. Se o mouse não reagir ao aperto do dedo do pé, vá para o passo 2.5.
4. Se o rato reage ao pitada dedo do pé, em seguida, repita os passos de 2,2-2,3.
5. Colocar o animal anestesiado na bancada na posição prona. Deslocar colo do rato por força colocando a mão esquerda no colo do mouse. Nósção da mão direita agarrar a cauda do rato e rapidamente puxar para cima em um ângulo de aproximadamente 45 ° para deslocar o colo do útero.
6. Fixe a carcaça a uma superfície (um pedaço de isopor nível de cobertas com toalhas de papel), perfurando cada uma das quatro patas do animal na superfície plana usando calibre 25 agulhas hipodérmicas.
7. Usando instrumentos cirúrgicos estéreis, corte o meio do mouse aberta e rapidamente remover o pâncreas do mouse. Use a pinça para segurar o pâncreas e cortá-la a partir do baço e do intestino delgado com uma tesoura de mola. Tenha cuidado para não esticar o pâncreas durante a remoção do mouse. O rompimento do tecido poderia liberar ribonuclease. Nota: O tempo que leva a remover o pâncreas do rato é crítica. Um perito deve ser capaz de dissecar o pâncreas em cerca de um minuto ou menos.
8. Colocar todo o pâncreas para um tubo de 50 ml contendo 8 ml de reagente de lise frio de gelo. Tampe o tubo e agitar brevemente para imergir o tissue no reagente e avançar para o próximo passo sem demora. A proporção de reagente de lise de tecido é crítica. Ver secção de resultados de uma comparação entre a integridade do RNA isolado utilizando diferentes volumes de reagente de lise.
9. Homogeneizar por 5 seg. É importante para pressionar as lâminas homogeneizador para o fundo do tubo de centrífuga para permitir que o tecido seja puxado para dentro das lâminas para homogenização eficiente.

3. Remoção de tecido não digerido

Nota: Após a homogeneização, pequenos pedaços de tecido permanecem no reagente de lise. É mais importante para lisar rapidamente o tecido deixando um pouco de tecido não digerido, em vez de ao longo de homogeneização e degradação risco de RNA.

1. Transferência de 2 ml de reagente de lise contendo o pâncreas lisadas para um tubo de microcentrífuga de 2 ml. Colete dois microtubos de homogeneizado por isolamento. Descarte o homogeneizado restante ou armazenar a -80 ° C para estudos futuros.
2. Centavorifuge a 4 ° C, 12000 g durante 5 min para sedimentar o tecido não digerido. Este é um passo crítico como transição de tecido não digerido em soluções posteriores de RNA provavelmente vai contaminar a amostra com ribonuclease (passo 5.13).
3. Transferir 1 ml do sobrenadante para um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Prosseguir com o isolamento imediatamente e armazenar o tubo de replicar-se a -80 ° C para uso futuro. Coloque todos os tubos contendo homogeneizado em gelo molhado enquanto prosseguir para a próxima etapa.
4. Descarte o reagente de lise restante em um recipiente de lixo químico apropriado.

4. Limpeza dos Blades homogeneizador

1. Antes de prosseguir para o próximo isolamento, limpeza das lâminas homogeneizador, colocando-os em 10 ml de etanol a 70%. Ative o homogeneizador por cerca de 20 segundos para remover quaisquer pedaços de tecido que podem ser capturados nas lâminas.
2. Use uma ponta de 200 mL da pipeta para remover quaisquer peças que permanecem nas lâminas homogeneizador. Repita o passo 4.1 na água, inativador geral Rnase e 70% de etanol. Seque o eixo com um homogeneizador de Kim limpo limpar.
3. Repetir o passo 2.1 para o isolamento pâncreas dos animais restantes, mantendo RNA isolado a partir de cada animal, em vez de separar o pool de RNA.

5. Isolamento de ARN

A secção que se segue é idêntico ao protocolo do kit de purificação. A vantagem do kit de purificação é que vai isolar o ARN total, incluindo pequenos RNAs.

1. Se estiver usando solução homogeneizado congelado, descongelar no gelo molhado e deixe descansar em temperatura ambiente por 5 min.
2. Adicionar 200 mL de clorofórmio, tampar o tubo e agitar vigorosamente à mão por 15 segundos. Deixe o tubo repousar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
3. Centrifugar durante 15 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C.
4. Transferir a fase aquosa superior para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 1,5 volumes de isopropanol e misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes.
5. Transfira até 700 ul da amostra em uma coluna de rotação que é colocada num tubo de recolha de 2 ml. Fechar a tampa e centrifugar a 8000 g durante 15 segundos à temperatura ambiente.
6. Descartar o escoamento.
7. Repita os passos de 5,5-5,6, utilizando-se o restante da amostra.
8. Adicionar 700 mL de buffer ERP para a coluna de centrifugação. Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 x g. Descartar o escoamento.
9. Pipetar 500 mL de buffer RPE na coluna de rotação. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g para lavar a coluna. Descartar o escoamento.
10. Adicionar 500 mL de buffer RPE para a coluna de centrifugação. Centrifugar durante 2 minutos a 8.000 xg, para secar a coluna.
11. Transferir a coluna de centrifugação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetar 80 mL sem ribonuclease água diretamente sobre a membrana coluna rodada. Centrifugar durante 1 minuto a 8.000 xg, para eluir o ARN.
12. Adicionar 1 mL inibidor de RNase à solução de ARN. Armazenar a -80 ° C ou prosseguir para 5.13.
13. Para validar a integridade do RNA, primeiro calcular o conce RNAntration e 260/280 escala utilizando um espectrofotômetro.
14. Dilui-se uma porção da solução de RNA de cerca de 500 ng / mL com água de grau de biologia molecular.
15. Determinar a integridade de ARN (isto é, RIN) usando a análise de electroforese capilar. Cerca de 5 ul da solução de RNA é suficiente para a análise.
16. Alíquota da solução de RNA (ver Figura 2) e armazenar a -80 ° C.

O rendimento de ARN total a partir de 1 ml de homogeneizado de lise é de 20-40 ug. OD 260/280 proporções são normalmente em torno de 2.0 e RIN são consistentemente superior a 7,0. Se o NIR é ≤ 6, o isolamento necessita de ser repetida. Ocasionalmente, um RIN que é maior do que 8,0 seja alcançado.

Os dois métodos mais comumente usados ​​de eutanásia de camundongos antes da remoção do pâncreas são CO 2 asfixia ou inalação de isoflurano. Ambas as técnicas são seguidas por deslocamento cervical. Uma vez que é possível que o tempo do agente e / ou o procedimento químico pode influenciar a integridade do RNA, o RIN de ARN pancreático do rato isolado foi comparado utilizando ambas as técnicas. Ratos foram anestesiados com CO 2 asfixia ou inalação de isoflurano; Ambas as técnicas foram seguidas por deslocamento cervical. O tempo de anestesiar os animais antes do deslocamento cervical foi de aproximadamente 1 a 2 minutos a mais por asfixia com CO2 em comparação com isoflUrane. RNA isolado após a inalação de isoflurano produziu um RIN de 7,5 ± 0,31 em comparação com um RIN de 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, média ± DP, triplicar isolamentos) para o CO 2 asfixia. O método de eutanásia tem um impacto dramático sobre a integridade de ARN e a técnica de inalação de isoflurano é preferível asfixia com CO2.

A integridade do ARN isolado a partir de pâncreas de rato que foram homogeneizados em 2, 4 e 8 ml de reagente de lise foram comparados. Colocámos a hipótese de que o aumento do volume de reagente de lise conduzirá a um maior grau de inactivação de ribonuclease. Para além do volume de reagente de lise, todas as condições eram idênticas às previstas no protocolo. Havia uma correlação directa entre o volume de reagente de lise utilizado na homogeneização e integridade de ARN (Figura 1). O RIN de RNA isolado usando 2, 4 e 8 ml de reagente de lise foi de 4,2, 6,5 e 7,4, respectivamente (média, é triplicadoolations). Portanto 8 ml de reagente de lise deve ser usado neste protocolo.

Para algumas experiências, pode ser necessário recolher ambos ARN e proteínas a partir da mesma pâncreas. Por exemplo, o ARN pode ser usado para qRT-PCR e da proteína pode ser visualizada usando imuno-histoquímica. Se este for o caso, é recomendado para cortar o pâncreas em metade da cabeça à cauda. Isso é importante, uma vez que o pâncreas é diferente anatomicamente da cabeça à cauda. Para demonstrar que as diferenças na integridade do RNA existe entre o RNA isolado a partir de qualquer uma das metades do pâncreas, a experiência seguinte foi feito. O ARN foi isolado a partir da primeira metade do pâncreas. O RIN determinada a partir deste ARN foi comparada com a de RNA isolado a partir da segunda metade do pâncreas após ele sentou à TA durante cerca de 30 segundos, durante o processamento da metade inicial. O NIR para a metade inicial do pâncreas foi de 7,4 ± 0,20 em comparação com um RIN de 6,9 ​​± 0,55 para a metade posterior. Embora o corte do pâncreas emDeste modo, não parece libertar ribonuclease e digestão de ARN, se o pâncreas deve ser seccionado, recomenda-se usar a primeira metade para análise de ARN e a segunda metade de proteína.

Reagente de lise perturba a estrutura da proteína e, portanto, reduz a atividade ribonuclease. Devido à grande quantidade de ribonuclease, que está presente no pâncreas, é possível que alguma da ribonuclease activa permanece no homogenato de lise e deste ribonuclease irá equilibrar-se com a fase aquosa. Qualquer ribonuclease que permanece na última solução de ARN irá impedir integridade. Para superar isto, adicionado um inibidor de ribonuclease para a solução aquosa de ARN. A integridade do RNA foi comparada a partir de uma solução de ARN que continha o inibidor da ribonuclease para um que não o fez. Mediante um descongelamento congelamento, o NIR para a solução de ARN com inibidor foi de 7,3 ± 0,15 em comparação com 2,9 ± 0,65 (Figura 2, p <0,001, média ± DP, isolamentos triplicado) para osolução que não continha inibidor. Outra questão é a possibilidade de que repetiu congelamento descongelamento irá desnaturar a ribonuclease inibidor tornando-o ineficaz. Para examinar esta possibilidade, uma solução de ARN que contém o inibidor da ribonuclease foram repetidamente congeladas e descongeladas. As soluções de ARN que foram congelados e descongelados até 5 vezes ainda produziu um RIN de 7 ou superior, enquanto que as soluções foram congeladas e descongeladas 6 vezes mais altos ou produzido um RIN inferior a 7 (Figura 2). Recomenda-se divida em alíquotas da solução de ARN antes da congelação e limitar o número de ciclos de descongelamento congelamento.

Para demonstrar a utilidade deste método, foi realizado de qRT-PCR em ARN isolado. A média RIN de isolamento de RNA triplicados foi de 7,4 ± 0,20 (média ± DP). CDNA iniciado aleatoriamente foi sintetizado a partir do ARN e a expressão de três genes de manutenção foi medida por qPCR utilizando técnicas padrão. Os dados mostrados na Figura 3 validanossa capacidade de usar com sucesso o RNA de pâncreas mouse em uma técnica de biologia molecular padrão.

Figura 1. Alta lise reagente à relação do tecido melhora a integridade do ARN. A integridade do RNA isolado a partir de pâncreas de rato que foi homogeneizado em 2 (A, D), 4 (B, E) ou 8 (C, F) ml de reagente de lise foi comparação. Para além de o volume de reagente de lise, todas as condições eram idênticas às do descrito no protocolo aqui. Existe uma correlação directa entre o volume de reagente de lise utilizado na integridade homogeneização e ARN. (L) Média ± SD, isolamentos em triplicado. p <0,05, ** p <0,001. Clique aqui para ver uma versão maiordesta figura.

Figura 2. ARN eventualmente degrada-se após o descongelamento repetidos de congelamento. RNA isolado a partir de rato pâncreas foi repetidamente congeladas e descongeladas na presença ou ausência do inibidor da ribonuclease (RNase I). Média ± SEM, ** p <0,001.

Figura 3. QRT-PCR do RNA do pâncreas do rato. RNA foi isolado a partir de três pâncreas de rato utilizando o protocolo optimizado. A expressão de 18S rRNA, β-2 microglobulina e snoRNA251 foi determinada utilizando qRT-PCR (média ± DP).

Os autores não têm nada a divulgar.