De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Resumo

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

Resumo

Microscopia única molécula está emergindo como uma abordagem poderosa para analisar o comportamento de moléculas de sinalização, nomeadamente sobre os aspectos (por exemplo., Cinética, a coexistência de diferentes estados e populações, interações transitórias), que são normalmente escondidos em medições Ensemble, como os obtidos com métodos bioquímicos ou microscopia padrão. Assim, os eventos dinâmicos, como interações receptor-receptor, pode ser acompanhado em tempo real em uma célula viva com alta resolução espaço-temporal. Este protocolo descreve um método baseado na marcação com fluoróforos orgânicas pequenas e brilhantes e de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualizar directamente os receptores individuais sobre a superfície de células vivas. Esta abordagem permite localizar com precisão os receptores, medir o tamanho de complexos receptores, e capturar eventos dinâmicos, como interações receptor-receptor transitórias. O protocolo proporciona uma descrição detalhada de como perform uma experiência única molécula, incluindo a preparação de amostras, aquisição de imagem e análise de imagem. Como um exemplo, a aplicação do presente método para analisar acoplados à proteína G, com dois receptores, ou seja., Β _{2-adrenérgicos} e γ-aminobutírico tipo ácido B (GABA _B) do receptor, é relatado. O protocolo pode ser adaptado para outras proteínas da membrana de células e modelos diferentes, os métodos de transfecção e estratégias de rotulagem.

Introdução

Receptores localizados na superfície da célula sentir do ambiente extracelular e responder a uma variedade de estímulos, tais como aromatizantes, iões, pequenos neurotransmissores e hormonas proteicas grandes. A natureza fluida das membranas celulares permite movimentos de receptores e outras proteínas de membrana. Isto é essencial para a formação de complexos de proteínas e a ocorrência de interacções proteína-proteína transitórios, tais como os utilizados pelos receptores para montar em unidades funcionais e transdução de sinais no interior das células. Por exemplo, L-receptores acoplados à proteína (GPCRs), que constituem a maior família de receptores da superfície celular, ^um, têm sido sugeridos para formar di-/oligomers, que parece estar envolvida na regulação de ajuste entre a transdução de sinal e pode ter conseqüências fisiológicas e farmacológicas importantes ^2-5.

Microscopia única molécula tem o grande potencial de visualizar diretamente com alta spatiotempresolução por via oral o comportamento dinâmico de receptores individuais localizados na superfície de células vivas, incluindo a sua associação para formar dímeros e complexos moleculares de maior ordem ^{de 6-10.} Este oferece várias vantagens em relação aos métodos bioquímicos e de microscopia de padrão, que geralmente relatam o comportamento médio de milhares ou milhões de moléculas.

De marcação de proteínas com um fluoróforo suficientemente brilhante e fotoestável é essencial para a microscopia de molécula única. Este protocolo tem vantagem de a marca de SNAP recentemente introduzido ¹¹ para ligar covalentemente as pequenas e brilhantes fluoróforos orgânicos para os receptores da superfície celular. SNAP é uma proteína de 20 kD marcação derivados a partir da reparação do ADN enzima O-DNA alquiltransferase ^{6-alquilguanina} humano, que pode ser irreversivelmente marcado com fluoróforo conjugado benzilguanina (fluoróforo-BG) derivados. CLIP, uma marca ainda mais engenharia derivada da SNAP, pode ser em vez marcado com fluoróforo-cderivados benzilcitosina onjugated ^12.

O protocolo relatado neste manuscrito explica como a transfectar e etiqueta ^SNAP-11 com etiquetas receptores com pequenos fluoróforos orgânicos e utilizar de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualizar os receptores individuais ou complexos de receptores na superfície de células vivas ^10. Os resultados do protocolo relatado em> 90% de eficiência de marcação de uma extracelularmente SNAP-tag de proteína da superfície da célula ^10. Para mais informações sobre a utilização de dados de molécula única para analisar o tamanho e a mobilidade dos complexos de receptores, bem como para capturar as interacções receptor-receptor transiente, é fornecida. Um fluxo esquemática de todo o protocolo é dada na Figura 1. Como um exemplo, a transfecção de células de ovário de hamster chinês (CHO) com L-receptores acoplados à proteína SNAP-tag (GPCRs) seguido de marcação com um derivado de fluoróforo-BG quanto bem como a sua aplicação a quantify e di-/oligomerization receptor do monitor são descritos. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas da superfície celular, e marcadores fluorescentes (p. ex., CLIP), assim como a outros métodos de transfecção e de rotulagem.

Protocolo

1. Exemplo de Preparação

1. Limpeza Coverslip
   NOTA: Trabalhar sob uma coifa.
   1. Use uma pinça limpa para colocar lamínulas de vidro (24 mm de diâmetro) em um suporte lamela que separa lamelas individuais.
   2. Colocar o suporte com lamelas para uma proveta, e adicionar clorofórmio até as lamelas são cobertas. Cobrir a proveta com folha de alumínio para reduzir a evaporação e sonicado num banho de ultra-sons durante 1 hora à temperatura ambiente. Retire o suporte a lamela para fora do copo e deixe as lamelas seco.
   3. Repetir o passo 1.1.2, com uma solução de NaOH 5M em vez de clorofórmio.
   4. Retire o suporte da lamela em um novo recipiente e lavar três vezes com água destilada. Coloque lamelas limpas em uma placa de cultura de células de vidro cheio com etanol a 100%.
2. Preparação de amostras de calibração
   1. Dissolver corante fluorescente no solvente apropriado.
   2. Prepara-se uma diluição em série 1:10 do corante fluorescente variandoentre 1 pM a 1 nM em filtro esterilizado (0,22 mM) de água.
   3. Tome lamelas limpas armazenados em etanol a 100% e lava-se com água, esterilizada por filtração. Mancha 20 ul de cada diluição do corante fluorescente em uma lamela limpa separado. Deixe as lamelas secar sob um capuz estéril. Proteja as lamelas da luz e poeira até o uso. Usar estas amostras para avaliar a intensidade de moléculas fluorescentes individuais (ver etapa 3).
3. A transfecção
   1. Cultura de células CHO no meio de uma mistura 1:1 / nutriente de Eagle modificado por Dulbecco F-12 (DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C, em . 5% de CO ₂ NOTA: Utilize a mídia livre de fenol-vermelho durante todo o experimento para minimizar autofluorescência.
   2. Tome lamelas limpos a partir da solução de etanol a 100%, lavá-las com uma solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), e colocar uma lamela em cada poço de uma cultura de células de 6 poços plcomeu.
   3. Trypsinize, e contar as células CHO semente a uma densidade de 3 x 10 ⁵ células / poço na placa de 6 poços de cultura de células contendo as lamelas. Permitir que as células crescem numa incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante 24 horas, a fim de atingir aprox. 80% de confluência, o que representa a densidade celular óptima para transfecção.
   4. Para cada poço, diluída de 2 ug de ADN de plasmídeo desejado (por exemplo., SNAP-tag β receptor _{2-adrenérgico)} e 6 uL de Lipofectamine 2000, em dois tubos separados contendo 500 ul de meio de Optimem. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
   5. Combina-se as soluções a partir do passo 1.3.4 em um tubo e misturar para obter uma mistura de transfecção. Incubar a mistura de transfecção em TA durante 20 min.
   6. Durante a incubação (1.3.5), levar as células CHO e lavar duas vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS. Substituir PBS com 1 ml / poço de meio de vermelho de fenol livre de DMEM/F12 suplementado com FBS a 10%, mas sem antibióticos.
   7. Adicionar toda a transfecçãomistura de iões (1 ml) a partir do passo 1.3.5, gota a gota a cada poço, e abane a placa para trás e para assegurar a mistura completa.
   8. Incubar durante 2 a 4 horas a 37 ° C, em 5% de CO ₂ e proceder imediatamente a seguir para o passo seguinte NOTA:. Estas condições de transfecção foram optimizados para conseguir densidades de receptores <0,45 partícula / iM ^{de 2,} que são adequadas para uma única imagiologia molécula. Ajustes podem ser necessários quando se utiliza diferentes células, construções ou reagentes.
4. De marcação de proteínas
   1. Dilui-se 1 ml de solução de estoque fluoróforo-BG em 1 ml de meio de DMEM/F12 suplementado com FBS a 10% para obter uma concentração final de 1 uM. Levar as células transfectadas da incubadora e lavar duas vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS. Substituir PBS com 1 ml de solução de fluoróforo 1 uM-BG e incubar durante 20 min a 37 ° C, 5% de CO ₂ num incubador.
   2. Após a incubação, lavar as células trêsvezes com meio DMEM/F12 suplementado com FBS a 10%, de cada vez seguido de 5 minutos de incubação a 37 ° C. Dê uma lamela (com células marcadas) com uma pinça e colocá-lo em uma câmara de imagem.
   3. Lavar duas vezes com 300 ul de tampão de imagem. Adicionar 300 mL de tampão de imagem fresca e proceder de imediato à imagem (parte 2).

2. Aquisição de Imagem

NOTA: Use uma reflexão interna total de fluorescência (TIRF) microscópio, equipado com um objetivo de imersão em óleo de alta abertura numérica (por exemplo, 100X magnification/1.46 abertura numérica.), Lasers adequados (por exemplo, 405 nm, 488 nm, 561 nm e 645 lasers de diodo nm), um elétron multiplicação Charge Coupled Device (EMCCD) câmera, uma incubadora e um controle de temperatura para visualizar moléculas fluorescentes individuais.

1. Defina os parâmetros desejados, ou seja, de microscópio., Linha laser, ângulo TIRF (este parâmetro controla a penetraçãoprofundidade ção do campo evanescente), tempo de exposição, taxa de quadros e número de imagens por filme ^10. Mantenha o controle do aquecedor / incubadora e temperatura sempre para evitar desvios de temperatura e condensação de umidade.
2. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o objetivo 100X do microscópio. Coloque a câmara de imagens com as células marcadas para o suporte da amostra do microscópio, e trazer as células em foco com uma iluminação de campo claro.
3. Mudar para iluminação TIRF. Mantenha a potência do laser tão baixo quanto possível para permitir a pesquisa para a célula desejada, mas, ao mesmo tempo que minimiza o fotobranqueamento.
4. Selecione a célula desejada e multa ajustar o foco. Defina a potência do laser para um nível que permite a visualização de fluoróforos individuais. Adquirir seqüência de imagens e salvar o arquivo de seqüência de imagens raw como. Tiff.

3. Calibration (fluoróforos individuais sobre vidro e monoméricas / Controles Receptores diméricas)

1. Monte cada sampl calibraçãoe preparados como descrito em 1.2, no câmara de imagem. Colocar cada amostra ao microscópio e escolher a amostra contendo manchas limitada de difração bem separados que lixívia em uma única etapa NOTA:. Estes pontos representam moléculas de corante fluorescente.
2. Adquirir sequências de imagens TIRF como descrito no passo 2 Importante:. Os mesmos parâmetros de formação de imagens devem ser usadas em todas as experiências, incluindo aqueles para a calibração.
3. Realizar a detecção e acompanhamento de análise conforme detalhado na 4,1-4,2. Extrai-se a intensidade de cada uma das partículas como descrito em 4.2.6. A partir destes dados, calcular a média (μ) e desvio padrão (σ) da intensidade de fluoróforos individuais.
4. Opcional: executar a mesma análise sobre as células transfectadas com um receptor de superfície celular monomérica (. Por exemplo, CD86), N-terminal etiquetado com uma ou duas cópias de SNAP ¹⁰ e marcado com o fluoróforo derivado-BG. Follow o procedimento acima descrito para o fluoróforo único em vidro. Estimativa da eficiência de marcação, tal como descrito em Calebiro, D. et al. ¹⁰

4. Image Analysis

1. Preparação seqüência de imagens
   1. Utilize um software de processamento de imagem (por exemplo., ImageJ) para cortar as imagens.
   2. Salve quadros individuais como separado. Imagens TIFF em uma nova pasta, indicando em cada imagem o número do quadro.
   3. Medir a área de superfície da célula através da elaboração de uma região de interesse (ROI) ao longo do contorno de uma célula e utilizando a ferramenta da medida em ImageJ ou um instrumento semelhante, em outro software. Utilizar este valor para calcular a densidade da partícula, dividindo o número total de partículas no início do filme pela área da superfície da célula.
2. Detecção e rastreamento de partículas
   NOTA: Use um software não comercial, como u-track ^13, trabalhando em Matlabmeio ambiente, para detectar e rastrear partículas receptores individuais automaticamente.
   NOTA: O algoritmo de u-pista é baseado no método de rastreamento de várias hipóteses. Esta abordagem liga partículas entre quadros por construir matrizes de custo, onde as probabilidades, que uma dada partícula em um quadro corresponde a uma dada partícula do próximo quadro, aparece, desaparece ou funde / divide com / a partir de outras partículas são atribuídos. A solução que minimize os custos a nível global, ie., Aquele com a maior probabilidade, é finalmente selecionado. Isso também permite o acompanhamento de um partícula desaparecer temporariamente, um fenômeno típico causado pelo fluoróforo piscar. A última versão do u-track (2.1.0) tem interfaces gráficas que facilitam a execução dessas análises.
   1. No prompt de comando do Matlab, digite "movieSelectorGUI" para abrir a interface de seleção de filmes. Siga as instruções para criar umanovo banco de dados filme a partir das imagens separadas salvas anteriormente (ver 4.1.2).
   2. Fornecer o tamanho do pixel em nm, intervalo de tempo em segundos, abertura numérica, profundidade de bits da câmara e comprimento de onda de emissão do fluoróforo, necessário para a detecção e monitoramento de partículas. Salve o banco de dados do filme.
   3. A partir da interface de seleção de filmes, executar a análise, a escolha de "partículas individuais" como o tipo de objetos. Uma nova janela aparecerá onde os parâmetros utilizados para detecção e rastreamento de partículas pode ser definido. Comece com os parâmetros padrão. Mais tarde, ajustar esses parâmetros, se a qualidade da detecção e / ou rastreamento não é satisfatório (por exemplo, algumas partículas não são detectados ou faixas são fragmentados) Opcional:. Sob as configurações de rastreamento, marque "resultados de rastreamento Exportar para o formato matriz" para armazenar as coordenadas e as amplitudes de todas as partículas em uma única matriz (campo denominado "trackedFeaturedInfo"). Para uma descrição detalhada destes parâmetros, consulte a documentação do u-track.
   4. Execute o algoritmo de detecção. Este algoritmo determina automaticamente a localização ea intensidade acima do fundo de cada ponto de difração limitada (ou seja., Complexos de receptores individuais / receptores) por montagem de uma função gaussiana bidimensional com desvio padrão igual à função de ponto de difusão do microscópio em torno maxima intensidade local . Em seguida, execute o algoritmo de rastreamento. Armazenar os resultados das análises de um arquivo de esteira..
   5. Use a rotina "movieViewer", contido no pacote u-track, ou os personalizados semelhantes a visualizar as pistas e verificar a qualidade de detecção e rastreamento.
   6. Abra o ficheiro de esteira. Ver a posição e amplitude (isto é., Intensidade) das partículas controladas em cada trama. Os dados gerados no passo 4.2.4 estão contidas no domínio tracksCoordAmpCG do ar tracksFinalray e / ou em trackedFeaturedInfo. A partir do número total de partículas detectada calcular a densidade das partículas dividindo este valor pela área da superfície da célula medida em 4.1.3.
   7. Opcional: Utilize a partícula coordena ao longo do tempo (ver 4.2.6) para analisar o movimento das partículas de receptores. Calcular os deslocamentos médios quadrados (MSD) e coeficientes de difusão (D), utilizando Matlab ou software similar. Para cada partícula e de cada intervalo de tempo (Δ t) considerado, calcular o deslocamento médio quadrático (MSD) utilizando a seguinte fórmula:
      
      onde Δ t é o intervalo de tempo em quadros, N é o número de etapas analisadas, x e y são x e y da partícula coordenadas no quadro indicado pelo índice. Use o MSD sobre parcelas de tempo para avaliar o tipo de movimento de uma dada partícula: relações linearesindicam uma difusão livre (isto é., movimento browniano), uma curvatura positiva (isto é., a curva se parece com uma parábola) sugere movimento dirigido, uma curvatura negativa é um indicativo de movimento confinado ^14. No caso de partículas que difundem livremente, calcular o coeficiente de difusão (D) de cada partícula de pelo ajuste dos dados MSD obtidos com a seguinte equação:
      
3. Cálculo de tamanho de partícula com o método de montagem de Gauss
   Observação: Uma vez que a distribuição de intensidade de amostras de calibração (fluoróforos individuais em vidro e / ou os receptores monoméricos marcados com fluorescência) é conhecida, realizar um ajuste de Gauss misto sobre a distribuição das intensidades de partículas no início de uma sequência de imagens para determinar o tamanho dos complexos de receptores (isto é., o número de receptores por partículas) ^10. Execute estas análises utilizando Matlab ou ssoftware imilar.
   1. Calcula-se a intensidade de cada partícula a média da intensidade da partícula do primeiro quadro para o quadro antes da primeira mudança na intensidade ocorreu (na maioria dos casos uma diminuição devido à fotodegradação).
   2. Realizar um encaixe Gaussian misto de acordo com a seguinte equação:
      
      onde φ (i) é a frequência de partículas tendo intensidade i, n é o número de componentes, α _n é um parâmetro que contribui para a altura do componente de n, e μ σ são a média e o desvio padrão da intensidade de referência fluoróforos individuais . (calculada tal como descrito no passo 3) NOTA: Determinar tele número máximo de componentes (n _max) para cada seqüência de imagens, aumentando progressivamente até o _máximo n adição de um componente que já não produzem um melhor encaixe estatisticamente, como julgado por um teste F.
   3. Opcional: (., Por exemplo, nos últimos 60 quadros de uma seqüência de quadros 400) Execute um ajuste de Gauss misto na distribuição de intensidade obtidos nos últimos quadros do filme. Substitua μ e σ com os valores obtidos após este ajuste, que fornecem estimativas refinados para esses parâmetros, e repita o passo 4.3.2.
   4. Calcula-se a área sob a curva (AUC) de cada um dos componentes do encaixe Gaussian misto. Calcular a abundância relativa de partículas de receptores de diferentes tamanhos (isto é, monómero, dímero, trímero, etc), dividindo o valor de AUC de cada componente pela AUC de toda a distribuição.
   5. Opcional: usar dados de diferentes células e as densidades de partículas correspondentes (calculados como descrito no ponto 4.2.6) para gerar parcelas onde a distribuição de partículas com tamanho diferente está correlacionada com a densidade de partículas ^10.
4. Cálculo de tamanho de partícula com o método de passo a montagem
   NOTA: Usar uma análise de ajuste passo como um método alternativo para determinar o tamanho dos complexos de receptores ^10. A base para esta análise é o de que a destruição induzida pela luz (fotodegradação) de uma única resultados fluoróforo no seu desaparecimento instantâneo - assim partículas contendo fluoróforos n se espera que a produção de lixívia, progressivamente um perfil de intensidade com o n passos.
   1. Extrato de perfis de intensidade de cada partícula do arquivo mat. Gerado por u-track ou software de detecção / rastreamento semelhante (ver 4.2.6).
   2. Usar um algoritmo de ajuste de fase, tal como o apresentadona ref. 10, para contar o número de passos de branqueamento para cada partícula.
   3. Opcional: utilizar os resultados para gerar distribuições mostrando a abundância relativa de partículas de tamanho diferente do receptor e correlacioná-los com uma densidade de partícula tal como anteriormente descrito para os resultados da instalação de Gauss misto (ver 4.3).

Resultados

O protocolo descrito pode ser aplicado a uma variedade de diferentes proteínas de membrana. Como um exemplo, os resultados representativos obtidos com β receptores _{2-adrenérgicos} e receptores _GABAB são relatados ^10. Desde sinais fluorescentes de moléculas individuais são fracas, a minimização da fluorescência de fundo é o primeiro passo fundamental para resultados bem sucedidos. Assim, é importante o uso de lamelas extensiva limpeza (Figura 2A), bem como para minimizar a...

Discussão

O protocolo descrito permite a análise do arranjo espacial, a mobilidade e o tamanho dos complexos de receptores da superfície celular no nível de molécula única. Em comparação com a utilização de proteínas fluorescentes, marcação com fluoróforos orgânicas pequenas, que são mais claras e mais fotoestável, tem a vantagem de permitir a visualização ampliada das partículas de receptores individuais. Uma vez que os níveis extremamente baixos de expressão são atingidos (<0,45 mM partículas do receptor / ^2), as ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Chloroform	AppliChem GmbH	A1585	CUIDADO: substância tóxica e irritante, bem como um possível carcinógeno
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	CUIDADO: base forte e reagente altamente corrosivo
Etanol absoluto	Sigma-Aldrich	32205
Glass coverwash	Marienfeld-Superior	111640	24 mm de diâmetro, 0,13-0,16 mm de espessura
0,2 mm filtro estéril	Sarstedt	83.1826.001
Células CHO	ATCC, EUA	ATCC CCL-61	Linha celular de ovário de hamster chinês
Placa de cultura de células de 6 poços	Nunc	140675
Meio DMEM/F-12	GIBCO, Life Technologies	11039-021	Meio livre de fenol vermelho
Soro fetal bovino	Biochrom	S 0115
Penicilina - estreptomicina	Pan Biotech GmbH	P06-07 100
Tripsina-EDTA	Pan Biotech GmbH	P10-23100
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Life Technologies	11668-019
Opti-MEM I Soro Reduzido Meio	Invitrogen, Life Technologies	31985-047
Benzilguanina conjugada com fluoróforo	New England BioLabs	S9136S	SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Faça uma solução estoque de 1 mM em DMSO. Armazene a -20 graus C.
DMSO	AppliChem GmbH	A1584
Tampão de imagem:			137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,3, filtrado estéril
NaCl	AppliChem GmbH	A1371
KCl	AppliChem GmbH	A3582
CaCl2	AppliChem GmbH	A2303
MgCl2	AppliChem GmbH	A3618
HEPES	AppliChem GmbH	A3724
Câmara de Imagem	Sondas Moleculares, Life Technologies	A-7816	Câmara de Células Attofluor, para microscopia
TIRF-M	Leica		Modelo: DMI6000B
objetiva TIRF	Leica	11 506 249	HCX PL Apo 100x/1.46 Óleo CORR
Câmera EM-CCD	Roper Scientific		Photometrics Cascade 512B Controlador de
temperatura	Pecon		Tempcontrol 37-2 digital
ImageJ software	NIH, EUA		http://rsbweb.nih.gov/ij
u-track software	Laboratório de biologia celular computacional, Departamento de Biologia Celular, Harvard Medical School, EUA		http://lccb.hms.harvard.edu/software.html
Matlab software	The MathWorks, EUA