3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

Summary

Neste protocolo de vídeo, rastreamos - em alta velocidade e em três dimensões - lisossomos marcados com fluorescência dentro de células vivas, usando o método de rastreamento orbital em um microscópio modificado de dois fótons.

Abstract

O objetivo deste protocolo de vídeo é discutir como executar e analisar uma fluorescente orbital experimento de rastreamento de partículas tridimensional usando uma versão modificada do microscópio de dois fótons ^1. Ao contrário de abordagens convencionais (digitalização raster ou campo grande baseado em uma pilha de quadros), o monitoramento orbital 3D permite localizar e seguir com uma alta espacial (precisão nm 10) e resolução temporal (frequência de resposta de 50 Hz) o deslocamento 3D uma partícula fluorescente passar comprimento escalas de centenas de microns ^2. O método baseia-se num algoritmo de realimentação que controla o hardware de um de dois fotões microscópio de varrimento laser, a fim de realizar uma órbita circular em torno do objecto a ser rastreado: o mecanismo de realimentação vai manter o objecto fluorescente no centro através do controlo da deslocação da o feixe de varrimento ^3-5. Para demonstrar as vantagens desta técnica, seguimos uma organela em movimento rápido, o lisossoma, dentro de alcélula iving ^6,7. As células foram semeadas de acordo com protocolos convencionais, e corados com um corante comercialmente lisossoma. Discutimos brevemente a configuração de hardware e de forma mais detalhada o software de controle, para realizar um experimento de monitoramento orbital 3D dentro de células vivas. Discutimos detalhadamente os parâmetros necessários, a fim de controlar o microscópio de varredura e permitir o movimento do feixe em uma órbita fechada em torno da partícula. Conclui-se, demonstrando como esse método pode ser efetivamente usado para rastrear o movimento rápido de um lisossoma marcado ao longo dos microtúbulos em 3D dentro de uma célula viva. Lisossomas podem mover-se com velocidades na gama de 0,4-0,5 um / seg, exibindo tipicamente um movimento dirigido ao longo da rede de microtúbulos ^8.

Introduction

Um grande número de abordagens têm sido desenvolvidas até agora para controlar partículas fluorescentes em três dimensões utilizando um microscópio. A maioria das abordagens se baseiam na utilização de câmeras rápidas, ideal para acompanhar em duas dimensões, normalmente combinados com modificações personalizadas da óptica de emissão do microscópio para alcançar rastreamento na direção axial. Microscópios de varredura a laser (ou confocal ou dois fótons) convencionalmente pode acompanhar uma partícula fluorescente através da realização de uma seqüência de tempo de z-stacks, embora este processo é normalmente demorado, e produz resolução de tempo razoável (10 Hz) somente se a partícula ser rastreado é mantida no centro de uma pequena região de imagem raster por um mecanismo de feedback activo ^2.

A ideia de bloqueio em que a partícula é a base do método de controle orbital. Em vez de um raster digitalizar uma órbita circular é realizada em torno da partícula fluorescente. A intensidade da fluorescência ao longoa órbita localiza com precisão a posição de partícula ^4.

A posição localizada da partícula pode então ser utilizado para accionar os scanners de microscópio e centro-re a órbita na posição de partícula. Os scanners galvanométricos do microscópio são accionados por uma tensão analógica. O componente AC desta voltagem permite realizar uma órbita com o feixe de laser focado, ou seja, um seno e co-seno de onda aplicada aos X e Y digitalização espelhos irá permitir a realização de uma órbita circular. O desvio do sinal de corrente contínua facilita a mudança de posição do centro da órbita. Depois de um período de órbita, é determinada e a forma de onda para o sinal de corrente alternada está configurada, o sistema de realimentação tem de actualizar apenas o componente DC do sinal.

Um software capaz de ler o sinal de fluorescência recolhido dos detectores é necessário para controlar os leitores e detectores, para calcular a posição da partícula e actualizar o CC foradefinido. Para uma reacção de sucesso imagens de uma cuidadosa escolha dos parâmetros da órbita (tamanho e de sincronização) é necessária e estes parâmetros têm de ser ajustadas com base nas características das partículas fluorescentes que é necessário para controlar.

Os fundamentos físicos e matemáticos da técnica foram descritos no passado ^{de 4,5} para ambas as aplicações de 2D e 3D. Neste protocolo, descrevemos resumidamente os principais componentes da configuração de hardware, e em mais detalhe a escolha dos parâmetros e a preparação da amostra necessária para uma experiência típica, permitindo-nos a seguir o deslocamento de um lisossoma em alta resolução temporal dentro de uma célula viva.

Protocol

Preparação 1 Amostra

1. Manter células CHOK1 em frascos de cultura de tecidos, utilizando meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 UI / ml de penicilina de 50 ug / ml de estreptomicina. Incubar as células em uma incubadora humidificada 5% CO ₂ a 37 ° C.
2. Colheita e, em seguida, as células CHOK1 prato sobre um diâmetro de micro-reservatório 14 mm, com uma espessura de superfície de 0,16 mm. Células de sementeira para a densidade óptima para a imagiologia, cerca de 60-70% de confluência.
3. Incubar as células durante a noite a 37 ° C, 5% de CO _2. Lavam-se as células três vezes em HBSS (Solução Salina Tamponada de Hank), e incubar as células numa solução que contém 50 nM de Lyso Tracker DND26 verde e 150 nM de verde tubulina rastreador. Incubar as células durante 1 hora a 37 ° C. Passo opcional: Antes da incubação, realizar uma mancha adicional coloração com um corante de matriz mitocondrial (25 nM).
4. Lavam-se as células três vezes em HBSS para remover qualquer corante não ligado. Adicionar meio de crescimento DMEM fresco antes de imagção das células.

2. Microscópio Configurações

O microscópio para o rastreamento de partículas descrito no protocolo de vídeo está montado na armação de um microscópio invertido comercialmente disponível (Figura 4). No entanto módulos comerciais para 3D rastreamento de partículas orbital já estão disponíveis.

1. Use a Ti Coherent Chameleon-Ultra II: fonte de luz laser de excitação femtosegundo Sa, com um comprimento de onda de saída ajustável entre 690 nm-1040 nm.
2. Certifique-se de que o feixe de laser é alinhado na porta traseira do microscópio usando espelhos revestidos por IR. O feixe de laser é atenuado usando uma placa de meia onda rotativa seguida por um polarizador linear calcite. Atenuar o feixe de modo a que a potência média da amostra está entre 0,5 e 2 mW.
   NOTA: O feixe de laser é reflectido por um par de espelhos accionados galvanómetro-motores que permitem o controlo da posição e da trajectória do feixe focado no plano da amostra. Numaconfiguração típica do feixe laser colimado de sair dos espelhos galvanométricos ampliada (10x), que passa através de um expansor de feixe, antes de entrar na parte de trás da objectiva de microscópio, após reflexão no espelho dicróico de curta passagem.
3. Recolha a luz de fluorescência da amostra através da colocação de um objectivo água abertura numérica elevada (60X, NA 1.2) no caminho da luz. Escolher um cubo de filtro de fluorescência de acordo com os comprimentos de onda de emissão desejadas em uma ou duas configurações de canal. Empregam filtros de banda de emissão para seleccionar ainda mais a gama espectral da fluorescência emitida.
4. Colocar a amostra para um palco motorizado, e ajustar o movimento fino da objetiva do microscópio usando um piezo-controlador objetivo.
5. Dirigir a luz a partir do cubo de filtro em tubos fotomultiplicadores, onde o sinal é discriminados e enviadas para um I / O cartão de aquisição de dados digital.
   NOTA: Os utilizadores são formas de onda da saída analógica da placa de I / O e são provided para os scanners sistema eletrônico. A entrada de contagem de fótons dos fotomultiplicadores e do sinal de saída para os scanners são medidos e controlados através do cartão de I / O por do Laboratório de Fluorescência software Dynamics SimFCS.

3 Imagens

1. Posicione as células no palco e se concentrar utilizando transmitida iluminação de luz.
2. Mudar para a imagem raster varredura para identificar as células que incorporaram o corante e visualizar os microtúbulos subjacentes. Identificar a área inicial onde o movimento vesícula está presente.
3. Uma vez que uma vesícula isolada é identificado, definir os seguintes parâmetros para o rastreamento orbital:
   1. Seleccione o raio da órbita para definir o tamanho da varredura circular de acordo com o tamanho da partícula a ser rastreado. Para um ponto emissor, definir o raio da órbita igual à cintura da Função propagação ponto (PSF) do feixe de excitação para maximizar a sensibilidade e de resposta.
   2. Defina o axialdistanciar para definir a distância entre as duas órbitas que são realizados para localizar a posição de partículas ao longo da direcção axial. Defina a distância axial de 1,5-3 vezes a cintura PSF.
   3. Define o tempo de permanência de acordo com o brilho das partículas para definir o tempo gasto em cada ponto da órbita, que também irá determinar a taxa de branqueamento foto-. Use o tempo de espera entre 10-100 ms.
   4. Defina o número de pontos em cada órbita a 64 ou 128 para produzir períodos de órbita na ordem de 4-32 ms e fornecer uma alta resolução temporal para determinar a posição da partícula.
4. Alterar o DC offset sinal enviado para os espelhos, a fim de centralizar o feixe sobre a partícula através da interface gráfica do usuário através de uma seleção cursor na imagem digitalizada-raster.
5. Começar a acompanhar desligando o modo de microscópio de varredura de geração de imagens para digitalização orbital.
6. Ative a coleta feedback e dados.

4. TrajectAnálise ory

1. Usar o software para exibir a fluorescência recolhidos em cada ponto ao longo da órbita e, em cada ponto de tempo sob a forma de um «tapete intensidade '. A intensidade coletadas ao longo do tapete fornece informações sobre a interação da partícula com outros objetos brilhantes. Usar o software para mostrar tanto a informação percurso (isto é, o deslocamento de DC ao longo do tempo de x, y e digitalizadores do -piezo z), bem como a intensidade de fluorescência recolhido a partir do tubo de fotomultiplicador ao longo do tempo sob a forma de séries de tempo.
2. Use a representação de séries temporais e as informações 'intensidade tapete "para selecionar apenas uma região de interesse na trajetória.
3. Use o software para exibir uma projeção 2D da parte selecionada da trajetória da partícula. Selecione os controles apropriados para cor-código a trajetória de acordo com a intensidade de fluorescência de partículas.
4. Selecione a opção para exibir o partigo trajetória em 3D, e cor code-lo de acordo com a intensidade de fluorescência. Gire a trajetória em 3D usando os controles para visualizar as características do movimento lisossomo ao longo do microtúbulo.

Results

De acordo com este protocolo de rastreio rápido 3D única partícula pode ser realizada dentro de células vivas utilizando um microscópio de dois fotões modificado para controlar o deslocamento de lisossomos marcados com fluorescência. O experimento realizado consiste em acompanhamento de um lisossoma isolado em movimento no interior da célula após o processo de maturação endosome ^9. Os lisossomos foram coradas utilizando um corante fluorescente verde e animado em 930 nm exploram dois fótons de excitação. Os no...

Discussion

Apesar dos avanços enormes de técnicas de microscopia de fluorescência e instrumentações, nos últimos anos, alcançando trajetórias de partículas fluorescentes em três dimensões com uma resolução temporal alta manteve-se um desafio no campo. Se alta resolução temporal foi alcançado partículas de rastreio em duas dimensões, a extensão no sentido axial tipicamente traz uma drástica redução na resposta de frequência do sistema ^10.

Neste protocolo de vídeo, focada na aplicação demonstr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysotracker DND 26	Life Technologies	L-7526
Rastreador de tubulina Green	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
Coherent Chamelon- ultra II TI	Coherent
Glan Taylor Calcite Polarizer	Melles Griot	03PTA001
Espelho de motor galvanômetro	Cambridge Technologies	M 6350
Espelho dicróico	Chroma Technologies	700 DCSPXR
Estágio motorizado	ASI	MS2000
Piezo	Tubo fotomultiplicador PI	P721-LLQ
	Hamamatsu	H7422P-40
Cartão de aquisição de dados	IO tech	PCI 1128-4000
Software de imagem	LFD	Global para imagens-SimFCS