Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Resumo

O isolamento de células estromais de linfonodos é um procedimento de várias etapas, incluindo digestão enzimática e desagregação mecânica para obter células reticulares fibroblásticas, células linfáticas e endoteliais sanguíneas. No procedimento descrito, uma digestão curta é combinada com desagregação mecânica automatizada para minimizar a degradação do marcador de superfície das células estromais viáveis dos linfonodos.

Resumo

Os órgãos linfóides secundários, incluindo os linfonodos, são compostos de células estromais que fornecem um ambiente estrutural para a homeostase, ativação e diferenciação dos linfócitos. Vários subconjuntos de células estromais foram identificados pela expressão da molécula de adesão CD31 e glicoproteína podoplanina (gp38), células reticulares da zona T ou células reticulares fibroblásticas, células endoteliais linfáticas, células endoteliais do sangue e pericitos semelhantes a FRC dentro da população de células duplamente negativas. Para todas as populações, diferentes funções são descritas, incluindo separação e revestimento de diferentes compartimentos, atração e interação com diferentes tipos de células, filtração dos fluidos de drenagem e contração dos vasos linfáticos. Nos últimos anos, diferentes grupos descreveram um papel adicional das células estromais na orquestração e regulação das respostas das células T citotóxicas potencialmente perigosas para o hospedeiro.

Os linfonodos são estruturas complexas com muitos tipos de células diferentes e, portanto, requerem um procedimento apropriado para o isolamento das populações de células desejadas. Atualmente, os protocolos para o isolamento de células estromais linfonodais dependem da digestão enzimática com tempos de incubação variados; no entanto, as células estromais e suas moléculas de superfície são sensíveis a essas enzimas, o que resulta em perda de expressão de marcadores de superfície e morte celular. Aqui, é proposto um protocolo de digestão enzimática curto combinado com interrupção mecânica automatizada para obter uma suspensão viável de células monocelulares de células estromais linfonodais, mantendo sua expressão de moléculas de superfície.

Introdução

Os linfonodos são compartimentos especializados onde as respostas imunes adaptativas contra-antígenos próprios estrangeiros e são iniciadas e coordenadas. O processo aqui apresentado descreve uma digestão enzimática curto combinado com pipetagem automatizada mecânica para obter linfonodo suspensão de células individuais e obter acesso às células viáveis ​​do estroma de nódulos linfáticos, que mantêm a expressão de várias moléculas da superfície.

Formar células do estroma linfonodo cadafalso do linfonodo e cumprir três funções principais: primeiro eles filtram líquidos do corpo para provar antígenos, patógenos e sua patógeno padrão molecul....

Protocolo

Nesta publicação de vídeo e protocolo, todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovados pela Autoridade Cantonal Basel-Stadt, Suíça.

1. Linfonodos Preparação e Digestão

1. Pré-aquecimento de água num copo a 37 ° C num agitador magnético com placa de aquecimento.
2. Prepare médio básico como se segue: DMEM (sem piruvato) suplementado com 2% de FCS, 1,2 mM _CaCl2 e Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 ug de estreptomicina).
3. Esterilizar todos os instrumentos de dissecção antes do uso.
4. Eutanásia camundongos linfonodo doadores por asfixia com....

Resultados

O presente protocolo é um protocolo de digestão modificada publicada por ligação et al., 2007 ⁶ com um menor tempo de digestão (45 minutos no máximo), devido à desagregação mecânica com uma pipeta multicanal automatizado. Além disso, o processo é mais padronizado, minimiza a degradação de marcadores de superfície em diferentes células do estroma de nódulos linfáticos e permite a manipulação de mais de uma amostra ao mesmo tempo.

Colagenase IV e colagenase D em links de pr.......

Discussão

O estudo das células do estroma dos nódulos linfáticos recentemente tornou-se um foco de investigação devido ao desenvolvimento de dois protocolos de digestão publicados ^6,13. Ambos os protocolos são adequados para obter único nó de linfa de células estromais, mas diferem na utilização de enzimas de digestão e tempo de digestão. Uma vez que as células estromais e seus marcadores de superfície são sensíveis à digestão enzimática e tensão mecânica, um protocolo optimizado é necessária.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	LifeTechnologies-Gibco	41965-039
FCS			Concentração final 2%
CaCl2	Sigma	499609	Concentração final 1,2 mM
Colagenase IV	Worthington Biochemical Corporation		>160 unidades por mg de peso seco, uso na concentração final de 1 mg/ml
de colagenase D	Roche	11088882001	uso a 3,5 mg/ml
de DNAse I	Roche	11284932001	uso em 40 e micro; g/ml
Ímãs de agitação	FAUST		5 mm de comprimento-2 mm ø
Tubos de fundo redondo de poliestireno 5 ml	Falcon-BD Bioscience
Agitador magnético com função de aquecimento	IKA-RCT-standard	9720250
placas de Petri 100 mm, agulhas estéreis	TPP	6223201
25 G	Terumo
anti-rato CD45 Ab	Biolegend		Clone 30-F11
anti-rato CD11c Ab	Biolegend		Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab	Biolegend		Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab	Biolegend		Clone MEC13.3
Eppendorf Xplorer plus, Multicanal	Eppendorf	4861 000.821/830	1.250 µ l volume máximo
anti-rato CD140a	Biolegend		Clone APA5
anti-rato CD80	Biolegend		Clone 16-10A1
anti-rato CD40	Biolegend		Clone 1C10
anti-rato I-Ab	Biolegend		Clone AF6-120.1
anti-rato CD274 (PD-L1)	Biolegend		Clone 10F.9G2
VIVO/MORTO corrigível Kit de coloração de células mortas de infravermelho próximo	Invitrogen	L10119