endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.
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Artigo de método
Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitos receptores de sinalização importantes são internalizados através do processo bem estudado de endocitose mediada por clatrina (CME). Os ensaios biológicos celulares tradicionais, medindo as mudanças globais na endocitose, identificaram mais de 30 componentes conhecidos que participam da EMC, e estudos bioquímicos geraram um mapa de interação de muitos desses componentes. Está ficando cada vez mais claro, no entanto, que a CME é um processo altamente dinâmico, cuja regulamentação é complexa e delicada. Neste manuscrito, descrevemos o uso da microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (TIRF) para visualizar diretamente a dinâmica dos componentes da maquinaria endocítica mediada por clatrina, em tempo real em células vivas, no nível de eventos individuais que medeiam esse processo. Essa abordagem é essencial para elucidar as alterações sutis que podem alterar a endocitose sem bloqueá-la globalmente, como é visto com a regulação fisiológica. Vamos nos concentrar no uso dessa técnica para analisar uma área de interesse emergente, o papel da composição da carga na modulação da dinâmica de poços revestidos de clatrina (CCPs) distintos. Este protocolo é compatível com uma variedade de sondas de fluorescência amplamente disponíveis e pode ser aplicado para visualizar a dinâmica de muitas moléculas de carga que são internalizadas da superfície celular.
Introdução
O processo de endocitose mediada por clatrina (CME) é dependente da chegada oportuna dos diversos componentes da maquinaria de endocitose mediada por clatrina para recolher a carga e manipular a membrana plasmática para as vesículas 1-3. CME é iniciada por proteínas deformantes membrana e do adaptador de carga que se juntam em locais de nascentes de endocitose 1. Estas proteínas recrutar o clathrin capa protéica, que reúne em uma estrutura de gaiola que forma o poço revestido de clatrina (CCP) 4. Uma vez que o PCC está totalmente montados em uma forma esférica, cisão membrana, principalmente através da ação do grande GTPase, dynamin, ....
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Protocolo
1 Expressão de fluorescência Tagged CME Componentes em células cultivadas
HEK293 são células modelo útil que têm sido usados extensivamente para estudar biologia GPCR e endocitose, e, portanto, são utilizados como modelos neste protocolo. Usar qualquer protocolo de transfecção proporcionando expressão uniforme sem superexpressão e baixa citotoxicidade.
- Pega de toda a cultura de células numa câmara de fluxo laminar estéril. Encha 4 cavidades de uma placa de 12 poços com 1 ml de Dulbecco Modificado meio essencial (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). A partir de um frasco de T25 confluente de células HEK293 diluir 1:50, 1:....
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Resultados
Utilizando-de células vivas microscopia TIRF temos registada a dinâmica de endocitose do receptor μ--opióide (MOR), um receptor acoplado a proteína G (GPCR), e a sua endocitose proteína adaptadora β-arrestina. O constructo β-arrestina foi transitoriamente transfectado para uma linha celular que expressa estavelmente MOR utilizando o protocolo delineado na Figura 1, e fotografada 96 horas mais tarde. A MOR na linha celular estável é a N-terminal etiquetado com uma GFP sensível ao pH. Esta proteína fluore.......
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Discussão
Aqui descreve-se a utilização de TIRFM visualizar clatrina mediada por endocitose (CME) ao nível das CCP indivíduo em células vivas em tempo real. CME é um evento rápido e altamente dinâmica mediada pelo efeito cumulativo de muitas espacial e temporalmente distintos eventos individuais. A maioria dos ensaios que são usadas atualmente, como dosagens bioquímicas de internalização usando biotinila��o superfície ou de ligação do ligando, citometria de fluxo ou células ensaios de medição fixa quantidade de proteínas inte.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer aos Drs. C. Szalinski, H. Teng e M. Bruchez pela ajuda com Imaris, R. Vistein e D. Shiwarski pela ajuda e aconselhamento técnico, e ao Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin e Dr. W Almers pelos reagentes e discussão útil. O financiamento fornecido pela concessão T32 NS007433 para SLB e NIH DA024698 e DA036086 para MAP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM/Alta Glicose com L-glutamina e piruvato de sódio | Fisher Scientific | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), sem cálcio, sem magnésio | Gibco, por Life Technologies | 21600-010 | |
| Ácido Livre EDTA | Amresco | 0322-500G | |
| Soro Fetal Bovino | Gibco, por Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, sem Gibco vermelho de fenol | , por Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, da Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE da Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Reagente de transfecção | Effectene | Qiagen | 301425 |
| 25 mm Fisher | Scientific | 12-545-86 | |
| Frascos tratados com cultura de células Corning, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Placa de cultura de células de 6 poços | Greiner Bio-One, por VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sal de acetato de encefalina (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Kit | de Rotulagem de ProteínasLife Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Software de análise de imagem | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, para análise automatizada | |
| Microscópio invertido Nikon Eclipse Ti e acessórios necessários, incluindo cubos de filtro e filtros | Nikon | ||
| Braço TIRF Nikon com adaptadores necessários para Nikon Eclipse Ti | Nikon | Para ajustar o ângulo de incidência | |
| iXon+ EMCCD câmera e adaptadores | Andor |
Referências
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clath....
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Reimpressões e permissões
