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Artigo de método

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

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⸱

DOI:

10.3791/51805

⸱

20 de outubro de 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

Neste artigo

Resumo

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Resumo

Muitos receptores de sinalização importantes são internalizados através do processo bem estudado de endocitose mediada por clatrina (CME). Os ensaios biológicos celulares tradicionais, medindo as mudanças globais na endocitose, identificaram mais de 30 componentes conhecidos que participam da EMC, e estudos bioquímicos geraram um mapa de interação de muitos desses componentes. Está ficando cada vez mais claro, no entanto, que a CME é um processo altamente dinâmico, cuja regulamentação é complexa e delicada. Neste manuscrito, descrevemos o uso da microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (TIRF) para visualizar diretamente a dinâmica dos componentes da maquinaria endocítica mediada por clatrina, em tempo real em células vivas, no nível de eventos individuais que medeiam esse processo. Essa abordagem é essencial para elucidar as alterações sutis que podem alterar a endocitose sem bloqueá-la globalmente, como é visto com a regulação fisiológica. Vamos nos concentrar no uso dessa técnica para analisar uma área de interesse emergente, o papel da composição da carga na modulação da dinâmica de poços revestidos de clatrina (CCPs) distintos. Este protocolo é compatível com uma variedade de sondas de fluorescência amplamente disponíveis e pode ser aplicado para visualizar a dinâmica de muitas moléculas de carga que são internalizadas da superfície celular.

Introdução

O processo de endocitose mediada por clatrina (CME) é dependente da chegada oportuna dos diversos componentes da maquinaria de endocitose mediada por clatrina para recolher a carga e manipular a membrana plasmática para as vesículas 1-3. CME é iniciada por proteínas deformantes membrana e do adaptador de carga que se juntam em locais de nascentes de endocitose 1. Estas proteínas recrutar o clathrin capa protéica, que reúne em uma estrutura de gaiola que forma o poço revestido de clatrina (CCP) 4. Uma vez que o PCC está totalmente montados em uma forma esférica, cisão membrana, principalmente através da ação do grande GTPase, dynamin, gera vesículas revestidas por clatrina livres (ccvs) 5,6. Esta internalização desencadeia rápida desmontagem do revestimento de clatrina, permitindo que os componentes a serem re-utilizados para múltiplos ciclos de CME.

A descoberta e caracterização das proteínas envolvidas no CME foi enraizada na Bioch tradicionalemical, genéticos e técnicas de microscopia 4-6,8. Estes ensaios têm elucidado as funções e pontos de interação destes componentes endocíticas. Embora muito útil para a definição de componentes essenciais de máquinas tráfico, estes ensaios são muito limitados em capturar o comportamento dinâmico de componentes CME ou concentração de carga. Esta é uma limitação fundamental, uma vez CME é impulsionada pela montagem coreografada por conjuntos de módulos de proteína em etapas definidas, e uma vez que pequenas alterações na dinâmica dos eventos endocíticas individuais podem ter grandes conseqüências cumulativas sobre endocitose. Além disso, dados recentes indicam que as CPCs individuais podem diferir tanto na composição como no comportamento, o que sugere que a regulação fisiológica do presente processo é altamente espacialmente e temporalmente restrita 9-14. Visualizando eventos endocíticas individuais, portanto, é essencial para entender por que há várias proteínas redundantes envolvidas na CME e como essas proteínas podem ser controlados bsinais fisiológicos y para regular a internalização de carga.

Aqui descreve-se a utilização de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRFM) para observar o CME ao nível da dinâmica de CPCs individuais em células vivas. TIRFM baseia-se na diferença de índice de refracção entre a lamela de vidro e para o ambiente fluido de células 15,16. Quando a luz de excitação é dirigida para as células em mais do que o ângulo crítico, é reflectida internamente, gerando uma onda evanescente, que mantém uma área de iluminação fina que se estende, aproximadamente, de 100 nm acima da lamela. Isso garante que apenas as moléculas fluorescentes dentro desse estreito campo está animado. Na prática, isto permite a excitação de moléculas fluorescentes em ou perto da membrana do plasma, e minimiza a fluorescência a partir das partes interiores da célula. Isto proporciona uma resolução significativamente mais elevada relação sinal-ruído e do eixo z para visualizar os eventos na membrana plasmática, compared para modos mais habitualmente utilizados tais como epifluorescência convencional ou microscopia de fluorescência confocal. Descrevemos também, a um nível de introdução e prático, a utilização de uma plataforma de análise de imagem utilizada para analisar e quantificar características morfológicas simples e dinâmica dos fenómenos endocíticos cargas individuais.

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Protocolo

1 Expressão de fluorescência Tagged CME Componentes em células cultivadas

HEK293 são células modelo útil que têm sido usados ​​extensivamente para estudar biologia GPCR e endocitose, e, portanto, são utilizados como modelos neste protocolo. Usar qualquer protocolo de transfecção proporcionando expressão uniforme sem superexpressão e baixa citotoxicidade.

  1. Pega de toda a cultura de células numa câmara de fluxo laminar estéril. Encha 4 cavidades de uma placa de 12 poços com 1 ml de Dulbecco Modificado meio essencial (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). A partir de um frasco de T25 confluente de células HEK293 diluir 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, respectivamente, em cada um dos quatro poços.
    1. Alternativamente, as células semente de uma placa multi-poços de tamanho desejado, de acordo com as instruções do fabricante. Semente 0,4-2 x 10 4 células para uma placa de 12 poços. Crescer as células durante a noite em um estéril 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade.
      NOTA: Considerando-se que o crescimento rates variam de acordo com as condições e linhas de células, pode ser preferível para semear vários poços para garantir confluência ideal para transfecção no dia seguinte ou a possibilidade de realizar transfections em duplicado.
  2. Na manhã seguinte, selecione um bem que é de aproximadamente 70% confluentes para transfecção (ver Figura 1B). Se nenhum bem chegou a este estado, esperar mais um dia.
    NOTA: 70% de confluência é ideal para células HEK293. Transfecção de células de que são resultados mais escasso em morte celular e toxicidade. Transfecção de células confluentes sobre-expressão resulta em fraca.
  3. Adicionar 60 ul de tampão CE (kit de transfecção), 400 ng dos plasmídeos que codificam para os GPCRs etiquetado e / ou de componentes da maquinaria de clatrina e 2,4 ul de potenciadora no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como descrito no protocolo do fabricante. Vórtice durante 2 segundos para assegurar uma mistura suficiente, e girar numa microcentrífuga a 2000 xg durante 2 segundos para recolher o líquido, na parte inferior.
  4. Adicionar6 ul Effectene como descritos no protocolo do fabricante. Vortex durante 2 segundos, e rotação a 2.000 x g durante 2 segundos numa microcentrifuga para recolher o líquido, na parte inferior. Esperar durante 20 min para permitir a formação de micelas de complexos de transfecção.
  5. Aspirar mídia do bem a ser transfectada. Adicionar cuidadosamente 0,8 ml de DMEM com FBS a 10% para a mistura de reagente de transfecção e misturar por pipetagem para cima e para baixo, lentamente, para reduzir a quebra das micelas. Adicionar a mídia e mistura de transfecção para o bem muito lentamente de lado. Adicionar qualquer mistura de transfecção restante do tubo de microcentrífuga para o poço utilizando uma micropipeta.
    NOTA: Se necessário, adicionar um extra de 0,5 ml de DMEM com FBS a 10% para o bem transfectado para dar as células de alimento extra resultando em transfecção suave e menor expressão transitória.
  6. Retorne as células para o 37 ° C incubadora por 5 horas.
  7. Aspirar mídia contendo a mistura de transfecção. Substituir com 1 ml de DMEM com 10% de FBS. Permitiras células a crescer durante a noite.
  8. No dia seguinte, as células passam a lamelas não revestidos, previamente esterilizado em autoclave.
    1. Adicionar 0,5 ml de Tampão Fosfato Salino (PBS) com EDTA a 1 mM a cada poço. Alternativamente, usar 0,5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Deixar na incubadora durante 1 min.
    2. Coloque 3 round, estéreis 25 milímetros lamelas nas cavidades de uma placa de 6 poços. Encher cada poço com 2 ml de meio. Empurre a lamela para baixo para o fundo do poço, para evitar que as células que crescem na parte inferior da lamela.
    3. Agitar manualmente o bem para retirar as células a partir do fundo do poço. Adicionar 1 ml de DMEM com 10% de FBS para ressuspender. Distribua as células levantadas a partir de um poço de uma placa de 12 poços uniformemente entre os três lamelas. Alternativamente, placa células em 3 pratos com fundo de vidro.
  9. Permitir que as células crescem sobre as lamelas durante pelo menos 48 horas antes da imagiologia. Certifique-se de que as células estão espalhados e plana.

2.Imagem CCP e carga Dynamics Usando TIRFM

  1. Anticorpos anti-FLAG M1, conjugado com Alexa utilizando corantes Alexa Fluor kit de marcação de proteínas de acordo com o protocolo do fabricante. Alternativamente, os anticorpos pré-conjugados podem ser comprados.
  2. Pré-incubar células com os anticorpos a uma diluição de 1: 1.000 em 1 ml de meio pré-aquecido Leibovitz com FBS a 10%, ou de Opti-MEM com 50 mM de HEPES pH 7,4 e 10% de FBS durante 10 min a 37 ° C (imagiologia meio), para etiquetar GPCRs marcaram-FLAG na superfície da célula. Ir estes passos se proteínas fluorescentes geneticamente codificados, como GFP, são usados ​​como marcas (veja a discussão para mais detalhes).
  3. Transfira a lamela para uma câmara de imagem ao vivo de células. Alternativamente, para pratos com fundo de vidro, aspirado media de rotulagem anticorpo e adicionar 700 mL de meio de imagens pré-aquecido.
    1. Utilizar um par de pinças e dobrar a ponta de uma agulha de calibre 25 num gancho.
    2. Segure um par de fórceps na mão dominante. Segure a agulha torta na other. Vire a agulha até que as curvas de gancho baixo em direção ao vidro. Suavemente arraste agulha, o lado do gancho para baixo, através da parte inferior de uma placa de 6 poços até que engancha na lamela. Tome cuidado para não arranhar a superfície da lamela, uma vez que irá retirar células. Suavemente elevar a lamela acima do fundo do poço. Equilibre a lamela contra a parede do poço para o apoio.
    3. Utilizar as pinças para agarrar perto da extremidade da lamela e mover o lado das células lamela até a câmara de imagem, e montar a câmara. Adicionar 700 mL (ou quantidade adequada) de meio de imagem pré-aquecido. Lidar com as lamelas com cuidado, sem pressão para evitar rachar ou quebrar.
  4. Transferir a câmara para o microscópio e manter a temperatura das células a 37 ° C utilizando um aquecedor de fase ou numa incubadora fechada.
  5. Traga células em foco usando um objetivo de imersão em óleo 100X ou 60X TIRF (1,45 NA ou acima). Imagem das células em epifluorescência convencional ou conmodos focais de iluminação (ou seja, não TIRFM) para identificar as células que expressam as construções adequadas. Fora de foco células são quase invisíveis na profundidade fina de iluminação TIRF tornando difícil encontrar o plano focal e células.
    NOTA: Alguns sistemas utilizam os mesmos lasers para TIRFM a imagem em epifluorescência convencional, movendo o ângulo de incidência do laser acima do ângulo crítico. Como uma importante medida de segurança, sempre estar ciente do ângulo do feixe de laser, e sempre dirigi-la longe do observador.
  6. Concentre-se para baixo para a superfície de fundo de uma célula que expressa até o contorno da membrana plasmática em torno da célula desaparece e o centro da célula aparece. Isto é mais aparente com uma proteína da membrana plasmática de carga localizada, tal como o receptor μ-opióide (ver Figura 2A).
  7. Mudar para TIRF imagem.
    1. Se utilizar os mesmos lasers para formação de imagens de epifluorescência convencional, aumentar o ângulo de incidência dalaser de fluorescência até que fora de foco no interior da célula desaparece, e sem contorno da membrana plasmática em torno da célula é visto. (Compare Figura 2C às Figuras 2A e 2B)
      NOTA: Em TIRFM, movendo-se no plano focal faz com que a imagem para ir completamente fora de foco e / ou fraca, e os níveis globais de fluorescência diminui devido à menor profundidade de iluminação. Por isso, um método alternativo para a alternar a iluminação TIRFM é primeiro foco no centro da célula de epifluorescência confocal / convencional, então, aumentar o ângulo de incidência até perder a maior parte da fluorescência, e depois concentrar-se para baixo para a membrana plasmática.
    2. Uma vez em TIRFM, garantir a laser de excitação reflete de volta através do objectivo e não é visível acima do objetivo. Confirme isso verificando se o ponto de laser é visível.
      NOTA: Nos modos de epifluorescência ou confocal convencional, a iluminação laser é visível acima do objetivo,tal como no teto.
    3. Limitar o foco para obter uma imagem nítida. Os principais componentes da maquinaria endocítica, como clathrin, será visível nos pontos lacrimais. Ajuste o foco no bem, por isso os pontos lacrimais são tão redonda quanto possível.
      NOTA: Para carga localizada à membrana, ajustar o foco bem até que o filopodia aparecer distintos.
    4. Use um programa de aquisição de salvar todos os parâmetros de imagem, como espelhos e ângulo TIRF. Faça isso para todos os comprimentos de onda necessários.
  8. Digitalizar torno da lamela para encontrar as células que expressam todos os marcadores de endocitose desejadas: o receptor μ-opióide e o adaptador β-arrestina, no exemplo mostrado na Figura 3A. Selecione as células que estão expressando, mas não sobre-expressão. Veja a discussão para mais detalhes.
  9. Uma vez que as células são identificadas, adquirir imagens a cada 3 s por 10 min. Isso é suficiente para captar a vida de uma CCP, uma vez que o tempo médio de vida de um CCP em células HEK293 fotografada nessas condições é around 40 seg 10-11. Isso permite que cerca de 12-14 quadros para observar o PCC. Por exemplo, ver filme 1. Repita todas as etapas de imagem células adicionais.

3 Análise de endocítica Dynamics por verificação manual

Embora a verificação manual do PCC vidas é muito limitado pelo número de câmaras de compensação que podem ser detectados, ainda continua a ser um meio preciso de detecção implacável pelas mudanças globais na imagem e detecção de artefatos. Veja a discussão para mais detalhes.

  1. Abra o arquivo no ImageJ. As imagens são armazenadas como uma única pilha de arquivos TIFF com canais intercalados. Converta imagens para hyperstacks. Vá em Image> Hyperstacks> pilha para hyperstack. Digite o número de canais adquiridos (ou seja, se as imagens β-arrestin eo receptor μ-opióide, digite 2), Digite 1 para a pilha Z (TIRFM é um único plano), eo número de quadros do filme (ou seja, a 10 min filme em um quadro a cada 3 s is 200) na janela pop-up.
  2. O formato hyperstack produz uma janela com duas barras de rolagem. Use a barra superior para percorrer os canais e parte inferior para mover através do tempo. Vá até o canal da proteína cuja vida útil será analisada.
  3. Mover para enquadrar 10 ou 15 do filme para reduzir a inclusão de CCPs pré-existente cujo tempo inteiro não são visíveis. Desenhe uma caixa de ROI em torno de um ponto escolhido ao acaso.
  4. Conte o número de quadros de um local é visível.
    NOTA: Ver Figura 3B e 3C para exemplos de três categorias morfológicas de eventos endocíticas 10,11,16-19.

4 Análise de endocítica Dynamics pelo reconhecimento objectivo

Objectivo reconhecimento permite a detecção de praticamente todos os CCPs fotografada em uma célula, mas pode ser sujeita a erros, devido à detecção de estruturas espúria erróneos. Veja a discussão para mais detalhes, pesando as vantagens e desvantagens do emétodo ach. Vários programas, incluindo algoritmos de custom-built, pode ser usado para detectar objetivamente CCPs. Este protocolo descreve o reconhecimento objetivo de CCPs usando Imaris, um software de análise de imagens (ver Materiais).

  1. Para começar, abra o arquivo de imagem RAW no software de análise de imagens. Por padrão, aparece uma imagem de cor mesclada. Use a janela "Ajuste de Display" para ajustar o brilho de um canal. Clique sobre o nome de um canal para alterar a cor exibida. Desmarque a caixa ao lado do canal para evitar a sua exposição (veja a Figura 4A).
  2. Criar "spots", clicando no ícone com manchas laranja. Veja a figura 4B. Selecione uma região de interesse (ROI) em torno da célula. Ver Figura 4C. Use um ROI para excluir áreas que irão detectar incorretamente bordos de ataque brilhantes e placas. Analisar várias células com diferentes níveis de expressão separadamente.
  3. Meça o diâmetro de um local para proviestimativas iniciais para o algoritmo de. Alternar para o modo "Slice", e clique em extremidades polares de um ponto para medir seu diâmetro. Ver Figura 4E. Faça isso por 4 ou 5 pontos redondos que parecem indicativo de uma CCP, no auge de sua estabilidade, após a formação e antes de cisão. Use essas medidas para calcular o diâmetro médio até o décimo mais próximo de um mícron.
  4. Detectar pontos. Voltar ao modo "Superar". Selecione o canal apropriado para a detecção. Digite o diâmetro médio medido, geralmente 0,3 ou 0,4 m. Clique na seta azul para a frente para quantificar as manchas. Ver Figura 4E. Se o diâmetro dos pontos é subestimada, pontos espúrios de fluorescência será identificado como Spots. Se o diâmetro for demasiado grande, os verdadeiros Spots serão ignorados. Quando em dúvida, estimar um pouco menor, e filtrar as detecções incorretas depois.
  5. Filtre Spots de Qualidade. Ajuste o filtro para capturar o maior número de pontos possível sem voltachão. O filtro de qualidade é selecionado por padrão 20. Ver Figura 4F.
    1. Use a curva de "qualidade" como um guia para definir um limiar adequado. Mova o limite inferior do filtro com o botão esquerdo do mouse para este primeiro mergulho na curva. Este é um bom ponto de partida para o filtro, pois esta posição normalmente refina detecção de Spots apenas visíveis. Ver Figura 4F.
    2. Spots detectados aparecem no filme como esferas ou centro de pixels. Usando a aba "Cores", ajustar a cor das manchas de uma cor contrastante para torná-lo mais fácil de vê-los. Percorra o filme para rever os pontos em cada quadro. O objetivo é detectar o maior número de pontos possível para a totalidade de suas vidas.
    3. Elimina Pontos dimmer ou manualmente conectá-los em faixas contínuas, mais tarde, como eles não são detectados bem com o curso de suas vidas.
    4. Remover placas brilhantes com um fil "Intensidade"ter, se necessário. Clique no sinal de mais verde para adicionar um novo filtro. Ver Figura 4F. Criar um filtro de Intensidade para filtrar ou reduzir Spots de uma dada sinais de fluorescência. Use a curva gerada Intensidade, (análoga à curva de qualidade discutido em 4.5) para definir o limite. Use o botão esquerdo do mouse para remover o extremo esquerdo da curva que representa os pontos mais brilhantes.
      NOTA: As grandes estruturas de placas são geralmente entre os elementos mais brilhantes do celular, e eles são facilmente excluídos com este filtro.
    5. Percorrer o filme para assegurar que as CPCs são detectadas como pontos mais brilhantes e as placas não são mais detectadas. Figura 3D mostra uma célula em que a detecção de PCC (denotado por esferas brancas) foi optimizado com o filtro de qualidade, e as placas foram excluídos com a qualidade filtro.
    6. Reduzir as arestas de células vivas com o filtro de qualidade. Objectos brilhantes ainda pode necessitar de ser removidas manualmente, na etapa seguinte. Continue com o azularrow.
    7. Remover manchas anormais na tela Spots Editar. Mudar para "Selecionar" mode. Clique no local. Ele vai se transformar amarelo. Clique em "Excluir". Clique na seta azul para continuar a construir o algoritmo. Ver Figura 4G.
  6. Faixas medida. Jogo de pistas "movimento Browniano." O CCP não devem exibir qualquer movimento dirigido, só deriva mínima, através da membrana plasmática. Este algoritmo é o mais adequado para esse movimento. Ver Figura 4H.
    1. Defina a Distância Máxima para um pequeno valor como 0,7 m. Ver Figura 4H.
      NOTA: A definição de uma distância pequena minimiza ligação de pontos adjacentes e ainda permite monitoramento contínuo de um ponto célula através CCP ou movimento celular.
    2. Defina Max Gap Tamanho para 1 Isso permite uma faixa para continuar se houver falta na sucessão apenas um quadro. Clique na seta azul para calcular as faixas. Ver Figura 4H.
      NOTA: Gtamanhos ap de mais de 3 faixas diferentes causas para ser incorretamente ligados entre si.
    3. Mudar de faixa de visualização para "Dragon Tail." Percorra o filme observando a qualidade de detecção. Se manchas adjacentes estão ligados, diminuir a distância máxima inferior a 0,7 ^ m. Se Spots estão sendo divididos muito rapidamente, aumentar a Max Gap Size. Clique na seta azul para criar faixas. Isto leva à tela de faixas de filtro. Ver Figura 4H.
  7. Filtro faixas e dados de exportação. Use um "Intensidade" filtro para remover placas brilhantes adicionais. Use um "deslocamento" filtro para remover endosomes que entram no campo TIRF. Tenha cuidado, como manchas mais longos terão deslocamentos mais longos também. Clique na seta dupla verde para completar o protocolo. Ver Figura 4I.
    1. Use a guia editar faixas, com o ícone de lápis, para remover detecções de falsos positivos de faixas que não puderam ser removidos através de filtros. Verifique se há discontinuities ou ligações falsas. Para conectar duas faixas, selecione-os usando Ctrl-botão esquerdo do mouse, em seguida, clique em "Connect" na caixa de edição Tracks. Para desligar faixas em pontos separados, selecionar uma faixa e clique em "Disconnect". Selecionar vários pontos com Ctrl + botão esquerdo do mouse e clique em "Connect" para criar uma nova faixa. O método é o mesmo para os pontos de edição, descritas em 4.5.7. Ver Figura 4J.
    2. Para exportar os dados, vá para a guia Estatísticas. Clique no ícone de um disquete para exportar a estatística selecionada. Clique no ícone que se parece com uma série de disquetes para exportar todas as estatísticas. A estatística "Track Duração" contém o comprimento das faixas de endocitose. Ver Figura 4K.

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Resultados

Utilizando-de células vivas microscopia TIRF temos registada a dinâmica de endocitose do receptor μ--opióide (MOR), um receptor acoplado a proteína G (GPCR), e a sua endocitose proteína adaptadora β-arrestina. O constructo β-arrestina foi transitoriamente transfectado para uma linha celular que expressa estavelmente MOR utilizando o protocolo delineado na Figura 1, e fotografada 96 horas mais tarde. A MOR na linha celular estável é a N-terminal etiquetado com uma GFP sensível ao pH. Esta proteína fluore...

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Discussão

Aqui descreve-se a utilização de TIRFM visualizar clatrina mediada por endocitose (CME) ao nível das CCP indivíduo em células vivas em tempo real. CME é um evento rápido e altamente dinâmica mediada pelo efeito cumulativo de muitas espacial e temporalmente distintos eventos individuais. A maioria dos ensaios que são usadas atualmente, como dosagens bioquímicas de internalização usando biotinila��o superfície ou de ligação do ligando, citometria de fluxo ou células ensaios de medição fixa quantidade de proteínas inte...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos Drs. C. Szalinski, H. Teng e M. Bruchez pela ajuda com Imaris, R. Vistein e D. Shiwarski pela ajuda e aconselhamento técnico, e ao Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin e Dr. W Almers pelos reagentes e discussão útil. O financiamento fornecido pela concessão T32 NS007433 para SLB e NIH DA024698 e DA036086 para MAP.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM/Alta Glicose com L-glutamina e piruvato de sódioFisher Scientific 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), sem cálcio, sem magnésioGibco, por Life Technologies21600-010
Ácido Livre EDTAAmresco0322-500G
Soro Fetal BovinoGibco, por Life Technologies10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, sem Gibco vermelho de fenol, por Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, da Life Technologies
HEPESCellPURE da Fisher ScientificBP2937-100
Reagente de transfecçãoEffecteneQiagen301425
25 mm FisherScientific12-545-86
Frascos tratados com cultura de células Corning, 25 cm2Fisher Scientific10-126-28
Placa de cultura de células de 6 poçosGreiner Bio-One, por VWR82050-896
Monoclonal ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sal de acetato de encefalina (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 Kitde Rotulagem de ProteínasLife TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Software de análise de imagemBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris, para análise automatizada
Microscópio invertido Nikon Eclipse Ti e acessórios necessários, incluindo cubos de filtro e filtrosNikon
Braço TIRF Nikon com adaptadores necessários para Nikon Eclipse TiNikonPara ajustar o ângulo de incidência
iXon+ EMCCD câmera e adaptadoresAndor
SH3024301

Referências

  1. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
  3. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
  4. Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
  5. Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
  6. Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
  7. Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
  8. Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
  9. Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
  10. Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
  11. Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
  12. Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
  13. Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
  14. Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
  15. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
  16. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
  17. Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
  18. Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
  19. Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
  20. Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  21. Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
  24. Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
  25. Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
  26. Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
  27. Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
  28. Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
  29. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
  30. Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).

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