Introduction
O processo de endocitose mediada por clatrina (CME) é dependente da chegada oportuna dos diversos componentes da maquinaria de endocitose mediada por clatrina para recolher a carga e manipular a membrana plasmática para as vesículas 1-3. CME é iniciada por proteínas deformantes membrana e do adaptador de carga que se juntam em locais de nascentes de endocitose 1. Estas proteínas recrutar o clathrin capa protéica, que reúne em uma estrutura de gaiola que forma o poço revestido de clatrina (CCP) 4. Uma vez que o PCC está totalmente montados em uma forma esférica, cisão membrana, principalmente através da ação do grande GTPase, dynamin, gera vesículas revestidas por clatrina livres (ccvs) 5,6. Esta internalização desencadeia rápida desmontagem do revestimento de clatrina, permitindo que os componentes a serem re-utilizados para múltiplos ciclos de CME.
A descoberta e caracterização das proteínas envolvidas no CME foi enraizada na Bioch tradicionalemical, genéticos e técnicas de microscopia 4-6,8. Estes ensaios têm elucidado as funções e pontos de interação destes componentes endocíticas. Embora muito útil para a definição de componentes essenciais de máquinas tráfico, estes ensaios são muito limitados em capturar o comportamento dinâmico de componentes CME ou concentração de carga. Esta é uma limitação fundamental, uma vez CME é impulsionada pela montagem coreografada por conjuntos de módulos de proteína em etapas definidas, e uma vez que pequenas alterações na dinâmica dos eventos endocíticas individuais podem ter grandes conseqüências cumulativas sobre endocitose. Além disso, dados recentes indicam que as CPCs individuais podem diferir tanto na composição como no comportamento, o que sugere que a regulação fisiológica do presente processo é altamente espacialmente e temporalmente restrita 9-14. Visualizando eventos endocíticas individuais, portanto, é essencial para entender por que há várias proteínas redundantes envolvidas na CME e como essas proteínas podem ser controlados bsinais fisiológicos y para regular a internalização de carga.
Aqui descreve-se a utilização de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRFM) para observar o CME ao nível da dinâmica de CPCs individuais em células vivas. TIRFM baseia-se na diferença de índice de refracção entre a lamela de vidro e para o ambiente fluido de células 15,16. Quando a luz de excitação é dirigida para as células em mais do que o ângulo crítico, é reflectida internamente, gerando uma onda evanescente, que mantém uma área de iluminação fina que se estende, aproximadamente, de 100 nm acima da lamela. Isso garante que apenas as moléculas fluorescentes dentro desse estreito campo está animado. Na prática, isto permite a excitação de moléculas fluorescentes em ou perto da membrana do plasma, e minimiza a fluorescência a partir das partes interiores da célula. Isto proporciona uma resolução significativamente mais elevada relação sinal-ruído e do eixo z para visualizar os eventos na membrana plasmática, compared para modos mais habitualmente utilizados tais como epifluorescência convencional ou microscopia de fluorescência confocal. Descrevemos também, a um nível de introdução e prático, a utilização de uma plataforma de análise de imagem utilizada para analisar e quantificar características morfológicas simples e dinâmica dos fenómenos endocíticos cargas individuais.
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Protocol
1 Expressão de fluorescência Tagged CME Componentes em células cultivadas
HEK293 são células modelo útil que têm sido usados extensivamente para estudar biologia GPCR e endocitose, e, portanto, são utilizados como modelos neste protocolo. Usar qualquer protocolo de transfecção proporcionando expressão uniforme sem superexpressão e baixa citotoxicidade.
- Pega de toda a cultura de células numa câmara de fluxo laminar estéril. Encha 4 cavidades de uma placa de 12 poços com 1 ml de Dulbecco Modificado meio essencial (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). A partir de um frasco de T25 confluente de células HEK293 diluir 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, respectivamente, em cada um dos quatro poços.
- Alternativamente, as células semente de uma placa multi-poços de tamanho desejado, de acordo com as instruções do fabricante. Semente 0,4-2 x 10 4 células para uma placa de 12 poços. Crescer as células durante a noite em um estéril 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade.
NOTA: Considerando-se que o crescimento rates variam de acordo com as condições e linhas de células, pode ser preferível para semear vários poços para garantir confluência ideal para transfecção no dia seguinte ou a possibilidade de realizar transfections em duplicado.
- Alternativamente, as células semente de uma placa multi-poços de tamanho desejado, de acordo com as instruções do fabricante. Semente 0,4-2 x 10 4 células para uma placa de 12 poços. Crescer as células durante a noite em um estéril 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade.
- Na manhã seguinte, selecione um bem que é de aproximadamente 70% confluentes para transfecção (ver Figura 1B). Se nenhum bem chegou a este estado, esperar mais um dia.
NOTA: 70% de confluência é ideal para células HEK293. Transfecção de células de que são resultados mais escasso em morte celular e toxicidade. Transfecção de células confluentes sobre-expressão resulta em fraca. - Adicionar 60 ul de tampão CE (kit de transfecção), 400 ng dos plasmídeos que codificam para os GPCRs etiquetado e / ou de componentes da maquinaria de clatrina e 2,4 ul de potenciadora no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como descrito no protocolo do fabricante. Vórtice durante 2 segundos para assegurar uma mistura suficiente, e girar numa microcentrífuga a 2000 xg durante 2 segundos para recolher o líquido, na parte inferior.
- Adicionar6 ul Effectene como descritos no protocolo do fabricante. Vortex durante 2 segundos, e rotação a 2.000 x g durante 2 segundos numa microcentrifuga para recolher o líquido, na parte inferior. Esperar durante 20 min para permitir a formação de micelas de complexos de transfecção.
- Aspirar mídia do bem a ser transfectada. Adicionar cuidadosamente 0,8 ml de DMEM com FBS a 10% para a mistura de reagente de transfecção e misturar por pipetagem para cima e para baixo, lentamente, para reduzir a quebra das micelas. Adicionar a mídia e mistura de transfecção para o bem muito lentamente de lado. Adicionar qualquer mistura de transfecção restante do tubo de microcentrífuga para o poço utilizando uma micropipeta.
NOTA: Se necessário, adicionar um extra de 0,5 ml de DMEM com FBS a 10% para o bem transfectado para dar as células de alimento extra resultando em transfecção suave e menor expressão transitória. - Retorne as células para o 37 ° C incubadora por 5 horas.
- Aspirar mídia contendo a mistura de transfecção. Substituir com 1 ml de DMEM com 10% de FBS. Permitiras células a crescer durante a noite.
- No dia seguinte, as células passam a lamelas não revestidos, previamente esterilizado em autoclave.
- Adicionar 0,5 ml de Tampão Fosfato Salino (PBS) com EDTA a 1 mM a cada poço. Alternativamente, usar 0,5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Deixar na incubadora durante 1 min.
- Coloque 3 round, estéreis 25 milímetros lamelas nas cavidades de uma placa de 6 poços. Encher cada poço com 2 ml de meio. Empurre a lamela para baixo para o fundo do poço, para evitar que as células que crescem na parte inferior da lamela.
- Agitar manualmente o bem para retirar as células a partir do fundo do poço. Adicionar 1 ml de DMEM com 10% de FBS para ressuspender. Distribua as células levantadas a partir de um poço de uma placa de 12 poços uniformemente entre os três lamelas. Alternativamente, placa células em 3 pratos com fundo de vidro.
- Permitir que as células crescem sobre as lamelas durante pelo menos 48 horas antes da imagiologia. Certifique-se de que as células estão espalhados e plana.
2.Imagem CCP e carga Dynamics Usando TIRFM
- Anticorpos anti-FLAG M1, conjugado com Alexa utilizando corantes Alexa Fluor kit de marcação de proteínas de acordo com o protocolo do fabricante. Alternativamente, os anticorpos pré-conjugados podem ser comprados.
- Pré-incubar células com os anticorpos a uma diluição de 1: 1.000 em 1 ml de meio pré-aquecido Leibovitz com FBS a 10%, ou de Opti-MEM com 50 mM de HEPES pH 7,4 e 10% de FBS durante 10 min a 37 ° C (imagiologia meio), para etiquetar GPCRs marcaram-FLAG na superfície da célula. Ir estes passos se proteínas fluorescentes geneticamente codificados, como GFP, são usados como marcas (veja a discussão para mais detalhes).
- Transfira a lamela para uma câmara de imagem ao vivo de células. Alternativamente, para pratos com fundo de vidro, aspirado media de rotulagem anticorpo e adicionar 700 mL de meio de imagens pré-aquecido.
- Utilizar um par de pinças e dobrar a ponta de uma agulha de calibre 25 num gancho.
- Segure um par de fórceps na mão dominante. Segure a agulha torta na other. Vire a agulha até que as curvas de gancho baixo em direção ao vidro. Suavemente arraste agulha, o lado do gancho para baixo, através da parte inferior de uma placa de 6 poços até que engancha na lamela. Tome cuidado para não arranhar a superfície da lamela, uma vez que irá retirar células. Suavemente elevar a lamela acima do fundo do poço. Equilibre a lamela contra a parede do poço para o apoio.
- Utilizar as pinças para agarrar perto da extremidade da lamela e mover o lado das células lamela até a câmara de imagem, e montar a câmara. Adicionar 700 mL (ou quantidade adequada) de meio de imagem pré-aquecido. Lidar com as lamelas com cuidado, sem pressão para evitar rachar ou quebrar.
- Transferir a câmara para o microscópio e manter a temperatura das células a 37 ° C utilizando um aquecedor de fase ou numa incubadora fechada.
- Traga células em foco usando um objetivo de imersão em óleo 100X ou 60X TIRF (1,45 NA ou acima). Imagem das células em epifluorescência convencional ou conmodos focais de iluminação (ou seja, não TIRFM) para identificar as células que expressam as construções adequadas. Fora de foco células são quase invisíveis na profundidade fina de iluminação TIRF tornando difícil encontrar o plano focal e células.
NOTA: Alguns sistemas utilizam os mesmos lasers para TIRFM a imagem em epifluorescência convencional, movendo o ângulo de incidência do laser acima do ângulo crítico. Como uma importante medida de segurança, sempre estar ciente do ângulo do feixe de laser, e sempre dirigi-la longe do observador. - Concentre-se para baixo para a superfície de fundo de uma célula que expressa até o contorno da membrana plasmática em torno da célula desaparece e o centro da célula aparece. Isto é mais aparente com uma proteína da membrana plasmática de carga localizada, tal como o receptor μ-opióide (ver Figura 2A).
- Mudar para TIRF imagem.
- Se utilizar os mesmos lasers para formação de imagens de epifluorescência convencional, aumentar o ângulo de incidência dalaser de fluorescência até que fora de foco no interior da célula desaparece, e sem contorno da membrana plasmática em torno da célula é visto. (Compare Figura 2C às Figuras 2A e 2B)
NOTA: Em TIRFM, movendo-se no plano focal faz com que a imagem para ir completamente fora de foco e / ou fraca, e os níveis globais de fluorescência diminui devido à menor profundidade de iluminação. Por isso, um método alternativo para a alternar a iluminação TIRFM é primeiro foco no centro da célula de epifluorescência confocal / convencional, então, aumentar o ângulo de incidência até perder a maior parte da fluorescência, e depois concentrar-se para baixo para a membrana plasmática. - Uma vez em TIRFM, garantir a laser de excitação reflete de volta através do objectivo e não é visível acima do objetivo. Confirme isso verificando se o ponto de laser é visível.
NOTA: Nos modos de epifluorescência ou confocal convencional, a iluminação laser é visível acima do objetivo,tal como no teto. - Limitar o foco para obter uma imagem nítida. Os principais componentes da maquinaria endocítica, como clathrin, será visível nos pontos lacrimais. Ajuste o foco no bem, por isso os pontos lacrimais são tão redonda quanto possível.
NOTA: Para carga localizada à membrana, ajustar o foco bem até que o filopodia aparecer distintos. - Use um programa de aquisição de salvar todos os parâmetros de imagem, como espelhos e ângulo TIRF. Faça isso para todos os comprimentos de onda necessários.
- Se utilizar os mesmos lasers para formação de imagens de epifluorescência convencional, aumentar o ângulo de incidência dalaser de fluorescência até que fora de foco no interior da célula desaparece, e sem contorno da membrana plasmática em torno da célula é visto. (Compare Figura 2C às Figuras 2A e 2B)
- Digitalizar torno da lamela para encontrar as células que expressam todos os marcadores de endocitose desejadas: o receptor μ-opióide e o adaptador β-arrestina, no exemplo mostrado na Figura 3A. Selecione as células que estão expressando, mas não sobre-expressão. Veja a discussão para mais detalhes.
- Uma vez que as células são identificadas, adquirir imagens a cada 3 s por 10 min. Isso é suficiente para captar a vida de uma CCP, uma vez que o tempo médio de vida de um CCP em células HEK293 fotografada nessas condições é around 40 seg 10-11. Isso permite que cerca de 12-14 quadros para observar o PCC. Por exemplo, ver filme 1. Repita todas as etapas de imagem células adicionais.
3 Análise de endocítica Dynamics por verificação manual
Embora a verificação manual do PCC vidas é muito limitado pelo número de câmaras de compensação que podem ser detectados, ainda continua a ser um meio preciso de detecção implacável pelas mudanças globais na imagem e detecção de artefatos. Veja a discussão para mais detalhes.
- Abra o arquivo no ImageJ. As imagens são armazenadas como uma única pilha de arquivos TIFF com canais intercalados. Converta imagens para hyperstacks. Vá em Image> Hyperstacks> pilha para hyperstack. Digite o número de canais adquiridos (ou seja, se as imagens β-arrestin eo receptor μ-opióide, digite 2), Digite 1 para a pilha Z (TIRFM é um único plano), eo número de quadros do filme (ou seja, a 10 min filme em um quadro a cada 3 s is 200) na janela pop-up.
- O formato hyperstack produz uma janela com duas barras de rolagem. Use a barra superior para percorrer os canais e parte inferior para mover através do tempo. Vá até o canal da proteína cuja vida útil será analisada.
- Mover para enquadrar 10 ou 15 do filme para reduzir a inclusão de CCPs pré-existente cujo tempo inteiro não são visíveis. Desenhe uma caixa de ROI em torno de um ponto escolhido ao acaso.
- Conte o número de quadros de um local é visível.
NOTA: Ver Figura 3B e 3C para exemplos de três categorias morfológicas de eventos endocíticas 10,11,16-19.
4 Análise de endocítica Dynamics pelo reconhecimento objectivo
Objectivo reconhecimento permite a detecção de praticamente todos os CCPs fotografada em uma célula, mas pode ser sujeita a erros, devido à detecção de estruturas espúria erróneos. Veja a discussão para mais detalhes, pesando as vantagens e desvantagens do emétodo ach. Vários programas, incluindo algoritmos de custom-built, pode ser usado para detectar objetivamente CCPs. Este protocolo descreve o reconhecimento objetivo de CCPs usando Imaris, um software de análise de imagens (ver Materiais).
- Para começar, abra o arquivo de imagem RAW no software de análise de imagens. Por padrão, aparece uma imagem de cor mesclada. Use a janela "Ajuste de Display" para ajustar o brilho de um canal. Clique sobre o nome de um canal para alterar a cor exibida. Desmarque a caixa ao lado do canal para evitar a sua exposição (veja a Figura 4A).
- Criar "spots", clicando no ícone com manchas laranja. Veja a figura 4B. Selecione uma região de interesse (ROI) em torno da célula. Ver Figura 4C. Use um ROI para excluir áreas que irão detectar incorretamente bordos de ataque brilhantes e placas. Analisar várias células com diferentes níveis de expressão separadamente.
- Meça o diâmetro de um local para proviestimativas iniciais para o algoritmo de. Alternar para o modo "Slice", e clique em extremidades polares de um ponto para medir seu diâmetro. Ver Figura 4E. Faça isso por 4 ou 5 pontos redondos que parecem indicativo de uma CCP, no auge de sua estabilidade, após a formação e antes de cisão. Use essas medidas para calcular o diâmetro médio até o décimo mais próximo de um mícron.
- Detectar pontos. Voltar ao modo "Superar". Selecione o canal apropriado para a detecção. Digite o diâmetro médio medido, geralmente 0,3 ou 0,4 m. Clique na seta azul para a frente para quantificar as manchas. Ver Figura 4E. Se o diâmetro dos pontos é subestimada, pontos espúrios de fluorescência será identificado como Spots. Se o diâmetro for demasiado grande, os verdadeiros Spots serão ignorados. Quando em dúvida, estimar um pouco menor, e filtrar as detecções incorretas depois.
- Filtre Spots de Qualidade. Ajuste o filtro para capturar o maior número de pontos possível sem voltachão. O filtro de qualidade é selecionado por padrão 20. Ver Figura 4F.
- Use a curva de "qualidade" como um guia para definir um limiar adequado. Mova o limite inferior do filtro com o botão esquerdo do mouse para este primeiro mergulho na curva. Este é um bom ponto de partida para o filtro, pois esta posição normalmente refina detecção de Spots apenas visíveis. Ver Figura 4F.
- Spots detectados aparecem no filme como esferas ou centro de pixels. Usando a aba "Cores", ajustar a cor das manchas de uma cor contrastante para torná-lo mais fácil de vê-los. Percorra o filme para rever os pontos em cada quadro. O objetivo é detectar o maior número de pontos possível para a totalidade de suas vidas.
- Elimina Pontos dimmer ou manualmente conectá-los em faixas contínuas, mais tarde, como eles não são detectados bem com o curso de suas vidas.
- Remover placas brilhantes com um fil "Intensidade"ter, se necessário. Clique no sinal de mais verde para adicionar um novo filtro. Ver Figura 4F. Criar um filtro de Intensidade para filtrar ou reduzir Spots de uma dada sinais de fluorescência. Use a curva gerada Intensidade, (análoga à curva de qualidade discutido em 4.5) para definir o limite. Use o botão esquerdo do mouse para remover o extremo esquerdo da curva que representa os pontos mais brilhantes.
NOTA: As grandes estruturas de placas são geralmente entre os elementos mais brilhantes do celular, e eles são facilmente excluídos com este filtro. - Percorrer o filme para assegurar que as CPCs são detectadas como pontos mais brilhantes e as placas não são mais detectadas. Figura 3D mostra uma célula em que a detecção de PCC (denotado por esferas brancas) foi optimizado com o filtro de qualidade, e as placas foram excluídos com a qualidade filtro.
- Reduzir as arestas de células vivas com o filtro de qualidade. Objectos brilhantes ainda pode necessitar de ser removidas manualmente, na etapa seguinte. Continue com o azularrow.
- Remover manchas anormais na tela Spots Editar. Mudar para "Selecionar" mode. Clique no local. Ele vai se transformar amarelo. Clique em "Excluir". Clique na seta azul para continuar a construir o algoritmo. Ver Figura 4G.
- Faixas medida. Jogo de pistas "movimento Browniano." O CCP não devem exibir qualquer movimento dirigido, só deriva mínima, através da membrana plasmática. Este algoritmo é o mais adequado para esse movimento. Ver Figura 4H.
- Defina a Distância Máxima para um pequeno valor como 0,7 m. Ver Figura 4H.
NOTA: A definição de uma distância pequena minimiza ligação de pontos adjacentes e ainda permite monitoramento contínuo de um ponto célula através CCP ou movimento celular. - Defina Max Gap Tamanho para 1 Isso permite uma faixa para continuar se houver falta na sucessão apenas um quadro. Clique na seta azul para calcular as faixas. Ver Figura 4H.
NOTA: Gtamanhos ap de mais de 3 faixas diferentes causas para ser incorretamente ligados entre si. - Mudar de faixa de visualização para "Dragon Tail." Percorra o filme observando a qualidade de detecção. Se manchas adjacentes estão ligados, diminuir a distância máxima inferior a 0,7 ^ m. Se Spots estão sendo divididos muito rapidamente, aumentar a Max Gap Size. Clique na seta azul para criar faixas. Isto leva à tela de faixas de filtro. Ver Figura 4H.
- Defina a Distância Máxima para um pequeno valor como 0,7 m. Ver Figura 4H.
- Filtro faixas e dados de exportação. Use um "Intensidade" filtro para remover placas brilhantes adicionais. Use um "deslocamento" filtro para remover endosomes que entram no campo TIRF. Tenha cuidado, como manchas mais longos terão deslocamentos mais longos também. Clique na seta dupla verde para completar o protocolo. Ver Figura 4I.
- Use a guia editar faixas, com o ícone de lápis, para remover detecções de falsos positivos de faixas que não puderam ser removidos através de filtros. Verifique se há discontinuities ou ligações falsas. Para conectar duas faixas, selecione-os usando Ctrl-botão esquerdo do mouse, em seguida, clique em "Connect" na caixa de edição Tracks. Para desligar faixas em pontos separados, selecionar uma faixa e clique em "Disconnect". Selecionar vários pontos com Ctrl + botão esquerdo do mouse e clique em "Connect" para criar uma nova faixa. O método é o mesmo para os pontos de edição, descritas em 4.5.7. Ver Figura 4J.
- Para exportar os dados, vá para a guia Estatísticas. Clique no ícone de um disquete para exportar a estatística selecionada. Clique no ícone que se parece com uma série de disquetes para exportar todas as estatísticas. A estatística "Track Duração" contém o comprimento das faixas de endocitose. Ver Figura 4K.
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Representative Results
Utilizando-de células vivas microscopia TIRF temos registada a dinâmica de endocitose do receptor μ--opióide (MOR), um receptor acoplado a proteína G (GPCR), e a sua endocitose proteína adaptadora β-arrestina. O constructo β-arrestina foi transitoriamente transfectado para uma linha celular que expressa estavelmente MOR utilizando o protocolo delineado na Figura 1, e fotografada 96 horas mais tarde. A MOR na linha celular estável é a N-terminal etiquetado com uma GFP sensível ao pH. Esta proteína fluorescente fluoresce apenas no fluido extracelular neutro. Além disso, o MOR apenas endocytoses uma vez activada por um agonista, e continua a ser de outro modo uniformemente distribuído através da membrana plasmática. Concentrando-se na membrana plasmática aderente que está sentado sobre o vidro de cobertura no resultado de modo confocal em uma célula que é preenchido com uma fluorescência fraca. Isto é diferente de uma focagem sobre o centro da célula, onde a membrana plasmática só é visto como um anel em torno de fluorescência na célula. Compare a esquerdae painéis direita na Figura 2A. Alternando a epifluorescência convencional ou com um ângulo TIRF incorrecta provoca fora de foco fluorescência se tornar aparente nas mesmas células, como mostrado na Figura 2B. Quando o ângulo TIRF é correta a membrana plasmática é muito nítido, claro e brilhante e fora de foco de fluorescência não atrapalha a imagem. Comparar a Figura 2C com as Figuras 2A e 2B.
A imagem é clara e nítida, porque a MOR está na membrana plasmática aderente, que é em grande parte dentro do campo TIRF. Em contraste, β-arrestina permanece numa piscina citosólica quando ainda não recrutados para pontos lacrimais endocítica, e parece opaca ou fora de foco porque não se encontra no campo TIRF. Uma vez que a MOR é activada por um agonista, β-arrestina é recrutada para a membrana do plasma, e ambos β-arrestina e redistribuir o receptor para as CCP (Figura 3A e um filme , Β-arrestin em verde, MOR em vermelho, sobreposição é amarelo).
Os tempos de vida desses aglomerados pode ser quantificada manualmente usando os três parâmetros para endocitose completado como representado na Figura 3B. As manchas que denotam CCPs podem desaparecer completamente (ver também Figura 3C), "pisca" ligado e desligado ou "beliscar fora" uma estrutura maior. As duas últimas condições representam eventos que são espacialmente muito juntos a serem resolvidos como eventos separados. O algoritmo de detecção de ponto de Imaris também é útil para quantificar as CCP, como descrito na Figura 4. Figura 3D indica CPCs detectada usando Imaris, após filtração para remover as estruturas de placa não dinâmicas. Esferas brancas sobrepostas denotar manchas detectadas. Dimmer pontos que não poderiam ser detectados por suas vidas inteiras também foram excluídos com a "qualidade" do filtro.
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Figura 1: Fluxograma do Processo de transfecção. (A) Em primeiro lugar, as sementes de uma variedade de diluições (1:50, 01:25, 01:16, 01:10) para uma placa de 12 poços. Permitir que as células crescer durante a noite. No dia seguinte, procure um bem que é de cerca de 70% confluentes, e uniformemente distribuído, como descrito. Este é o bem que serão transfectados. (B) Adicionar 60 ul de tampão de CE e 400 ng de ADN para um tubo de microcentrífuga. Vortex durante 10 segundos e girar o líquido para o fundo do tubo. Adicionar 2,4 mL de Intensificador. Vórtice durante 2 segundos e girar o líquido para o fundo do tubo. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Adicionar 6 ul de Effectene. Vórtice durante 2 segundos e girar o líquido para o fundo do tubo. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. (C) misturar lentamente 0,8 ml de DMEM com FBS a 10% com a transfecção. Adicionar às células previamente seleccionadas bem. Incubar as células durante 5 horas a 37 ° C. Substitua por frescoDMEM com 10% de FBS.
Figura 2: Encontrar o campo TIRFM. (A) A membrana plasmática fotografada em confocal. O painel esquerdo mostra células em confocal com um foco no centro da célula. A membrana plasmática só é visto como um "anel" em torno da célula. Concentrando-se para baixo para a membrana do plasma da base, adjacente à lamela faz com que a célula a ser preenchido com uma fluorescência fraca. A membrana plasmática "anel" não deve ser visível no campo TIRF mais fino. (B) A membrana plasmática basal com um ângulo raso TIRF produzindo iluminação epifluorescência convencional através da amostra. Este ilumina toda a célula e muito fora do foco de fluorescência a partir do topo da célula está presente. (C) A membrana plasmática em TIRF. Focando filopodia ajuda para encontrar o avião. Observe que éum único plano liso. Barras de escala são 10 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização e Quantificação eventos endocíticas em TIRF. (A) Uma célula que expressa o receptor μ-opióide (MOR) e β-arrestina antes e após a adição de um agonista que induz endocitose. O agonista provoca redistribuição de ambas as proteínas para pontos lacrimais endocítica. Barra de escala é de 10 m. (B) Três tipos de eventos endocíticas, vistos através da visualização dinâmica arrestina, consistente com morfologias descritas anteriormente. "Firme", um sinal constante que desaparece rapidamente. Este é o tipo principal, indicando que o PCC tinha brotado e deixou o campo TIRF. "Blink", um sinal de que pisca para um sinal mais baixo e reaparece ao mesmo ponto devido à montagem de uma segunda PCC no mesmo local. "Beliscar fora", uma projeção tubular sai um local, quando duas CCPs são muito próximos uns dos outros para ser resolvido como pontos distintos, e um é endocitado. A caixa é de 2 x 2 m. (C) A visualização de endocitose mediada por clatrina de MOR na resolução das ocorrências singulares. Dois exemplos que representam a maior fração do MOR eventos endocíticas são mostrados. Os quadros são cada 3 s. A caixa é de 2 x 2 m. (D) de detecção de eventos de endocitose individuais usando Imaris. Esferas brancas denotam CCPs detectados como Spots. Detecção de ponto foi otimizado através de "Qualidade" do filtro. Manchas dimmer que não possam ser detectados pela totalidade das suas vidas foram também excluídos com o filtro de qualidade. Estruturas de placas grandes que são mostrados como sendo detectado foram omitidos usando uma "intensidade" do filtro."target =" ig3large.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Objetivo Reconhecimento da Dinâmica Eventos endocíticas usando Imaris. (A) A janela de Ajustamento de exibição, que serve para ajustar a visualização da imagem, tal como descrito no passo 4.1. (B) de abertura da "mancha" algoritmo construtor. O construtor é exibido na janela abaixo. (C) O primeiro passo do algoritmo construtor Spots. Marque a opção "Spots Pista (com o tempo)." Check "Segmento apenas uma região de interesse", se necessário. Tela (D) seleção ROI. Veja o Passo 4.2 para detalhes. (E) As várias janelas necessárias para definir o diâmetro de um ponto medido. Painéis representam: a mudança de Ultrapasse ao modo Slice usando o Navigação Bar no topo, clicando nas extremidades polares de um ponto, em que o diâmetro medido exibida, normalmente no lado mais à direita, onde para entrar no diâmetro medido. Consulte Janela pontos (G) Editar descrito em 4.5.7 Passos 4,3-4,4. (F) O local de filtro de qualidade descrita na 4.5-4.5.3. (H). Faixas medir e visualizar faixas janelas, descritas em 4.6. (I) janela de filtro Tracks descrito no 4.7. (J) editar faixas janela descrita em 4.7.1. tela de dados (K) Save descrito em 4.7.2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1 .
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Discussion
Aqui descreve-se a utilização de TIRFM visualizar clatrina mediada por endocitose (CME) ao nível das CCP indivíduo em células vivas em tempo real. CME é um evento rápido e altamente dinâmica mediada pelo efeito cumulativo de muitas espacial e temporalmente distintos eventos individuais. A maioria dos ensaios que são usadas atualmente, como dosagens bioquímicas de internalização usando biotinila��o superfície ou de ligação do ligando, citometria de fluxo ou células ensaios de medição fixa quantidade de proteínas internalizadas, ou elétron microscópico localização de proteínas, monitorar as alterações do conjunto de localização de proteínas em pontos fixos de tempo . Estes métodos existentes têm sido muito úteis na identificação de proteínas que são necessárias para a CME, mas não possuem a resolução espacial e temporal que coincide com as escalas fisiológicas da CME ou outros processos de tráfico de membrana dinâmica. Isso é importante, pois evidências recentes sugerem que as CCPs são heterogêneos em sua composição proteínas e dinâmica 9-12, e como CME é provável rapidamente regulada de forma espacialmente discreta. TIRFM células vivas fornece a capacidade de analisar CME ao nível do espacialmente separados único CCPs, em tempo real, em células vivas.
A aplicação bem sucedida desta poderosa ensaio depende de dois fatores principais: a boa saúde das células e análise profunda dos parâmetros da CME. Para o ex-expressão, adequada de proteínas marcadas e técnicas de microscopia minimizando fototoxicidade são críticos. As linhas celulares de forma estável que expressam as proteínas de interesse são ideais, como os níveis de expressão pode ser estimado com segurança. Nós rotulamos os receptores com ou epitopo FLAG N-terminal ou SPH marcas 21-25. Embora não seja estritamente necessário, ambos os sistemas de etiquetagem facilitar TIRFM de CME vez que os receptores podem ser detectados selectivamente sobre a membrana de plasma no início da experiência. Os componentes endocíticos adicionais desejados podem também ser transientemente transfectados para estas linhas de células estáveis. O trprotocolo ansfection notado aqui é otimizado para imagens CME usando TIRFM. Primeiro, ela é adaptada para regular e moderado níveis de expressão. Pobre expressão requer maior potência de laser para a detecção e aumenta o risco de tanto a fototoxicidade e foto-branqueamento. Além disso, uma vez que este ensaio registra o desaparecimento do ponto lacrimal como CPCs internalizados, sinais fracos e fotobranqueamento são prejudiciais também para análise. Sugere-se que, sob estas condições, o tempo total e / ou a frequência da imagem ser reduzida. Em segundo lugar, a curta incubação dos reagentes de transfecção nas células, o intervalo entre a transfecção e da experiência, e a passagem de fresco de células transfectadas para lamelas antes de imagiologia, de tudo, assegurar que as células são fotografadas em saúde óptimo. Em terceiro lugar, o que garante que a maioria das estruturas são clathrin CCPs e folhas não planas de placas clathrin ou clatrina. Em quarto lugar, este protocolo minimiza a sobre-expressão de componentes CME transfectadas, que tem sido mostradon alterar CME dinâmica 20,26.
Para imagens com baixa fototoxicidade, é importante para otimizar o sistema de imagem para melhor resolução e sensibilidade máxima. A ampliação do objetivo e do tamanho detector câmera deve ser combinado para minimizar ampliação sub ou sobre-amostragem e vazio. A abertura numérica elevada (1,45 ou acima) TIRF objectivo deve ser utilizada para recolher o máximo de luz possível. Nós adquirir imagens com uma câmera dispositivo de acoplamento de carga multiplicação de elétrons em alta eficiência quântica, os tempos baixos de exposição, e velocidades de leitura rápida. Além disso, para assegurar a integridade das células, que são gravadas em meios de Leibovitz, o qual é tamponado independente de CO 2, e é complementado com 10% de FBS, numa câmara totalmente fechado definido como 37 ° C. Porque TIRFM é altamente sensível e os objectivos de abertura numérica altos usados podem detectar a luz ambiente, mesmo mínima, é fundamental para criar um ambiente de imagem fechada livreda luz externa e vibrações que podem atrapalhar o plano focal bem.
É importante notar que o tempo de vida absolutos e dinâmica da maior parte dos componentes do CME variar fortemente em função dos tipos de células, os níveis de expressão de proteínas, a temperatura, dias após o plaqueamento, e outras variações em condições de cultura 7,10,14,17,20, 25,27. Isso se reflete nas grandes variações nos prazos e distribuições observadas entre os diferentes grupos que utilizam esta técnica, uma clara limitação deste ensaio. Além disso, é possível que as CCP sobre a superfície de fundo da célula, trabalhada em TIRFM, comportam-se de forma diferente a partir da superfície superior 23,25. Embora seja discutível como a que representa com precisão a superfície de uma célula 'típico' rodeado por componentes da matriz extracelular em um tecido, as interpretações da dinâmica do PCC visto por esta técnica precisa considerar essa diferença de potencial. A verdadeira força de ensaio, portanto, encontra-se em comparação com alterações em dynamics de CPCs, nas mesmas células sob condições de cultura idênticas, após manipulações agudas, incluindo a agregação de moléculas de carga, tais como os GPCRs em resposta à activação. Esta comparação permite a normalização das alterações à mesma célula, controlando assim para todos os parâmetros mencionados acima, que pode induzir variações no comportamento do CCP.
Nós normalmente empregam ambas as análises manuais e automatizados, descritas acima, para analisar a duração dos eventos endocíticas: verificação manual e reconhecimento objectivo usando o software de análise de imagem Imaris. A verificação manual é trabalhoso e demorado, uma vez que é limitado pelo número de CCPs um usuário pode contar, mas é, sem dúvida, a técnica mais precisa disponível. Um olho humano treinado pode facilmente continuar a acompanhar a CCP através do movimento celular, e mudanças na forma ou foco, excluindo placas com precisão e pixels defeituosos. Ele também pode detectar alterações morfológicas no CCP indicativo de véspera concluídaes, como mostrado é Figura 3B e 3C. É imperativo, no entanto, que a análise continua a ser mais objetivo possível dentro dessas limitações. Isso exige a definição de critérios específicos que são usados de forma consistente em todos os conjuntos de dados. Além disso, tipicamente analisar imagens de uma forma em dupla ocultação, em que os nomes de imagem são misturados de modo a que as condições permanecem desconhecidos para a pessoa analisar as imagens. Detecção automática, por exemplo, utilizando os "pontos" e de "Track Duração" algoritmos em Imaris, pode ser utilizado para detectar a maioria dos pontos de endocitose em um dado filme, gerar um número elevado de amostras. Enquanto muitas opções, incluindo algoritmos altamente complexos feitos sob medida 3,14,23,26,27, estão sendo gerados, a fiabilidade destes métodos para detectar eventos endocíticas corretos, evitando detecção espúrio continua a ser a maior preocupação. Por exemplo, em Imaris, movimento celular criar bordas líderes brilhantes, placas, e fora daquadros de foco pode facilmente jogar fora o algoritmo de detecção de local, já que tem uma tendência a detectar estruturas brilhantes como sendo composto completamente de manchas. Para evitar que esses locais sejam conectados em uma faixa, todos eles devem ser removidos. Spots aberrantes individuais que não estão em grandes estruturas, tais como placas podem ser removidas com o Editar Spots guia, enquanto Spots ligados podem ser removidos mais tarde usando o Edit tab faixas. Os pontos aberrantes podem também ser removidos com filtros personalizados. Por exemplo, a Figura 3D mostra um filtro de intensidade usado para limitar a evitar a inclusão de placas na detecção CCP. O filtro de qualidade é outro filtro muito útil para excluir pontos errados. "Qualidade" é uma medida do brilho cumulativa e forma encontrado tomando a intensidade de fluorescência da mancha e filtragem gaussiana ¾ do comprimento do raio do ponto 20. A curva de Qualidade é encontrado embaixo os filtros selecionados. Ele mostra o número de pontos (y) detectadoquando a qualidade de um certo valor (x). Quanto menor a qualidade, mais pontos detectados. Se o filtro de qualidade é muito baixa, os pontos vão ser detectado, onde não há nenhuma fluorescência visível, por outro lado, se o filtro de qualidade é muito alto, apenas os pontos brilhantes será detectado. Siga ao longo da curva para valores maiores (x); o número de pontos detectados (y) normalmente vai cair drasticamente. Mover o limite inferior para este ponto. Este é o ponto mínimo para colocar o limiar inferior. Outros grandes contribuintes para pontos falsos no campo TIRF são endosomes que se movem para a periferia da célula e entrar no campo TIRF. Um critério robusto para remover estes é a mobilidade de pontos, isto é, o deslocamento de pontos ao longo do tempo. CCPs mover muito pouco, a menos que, como parte do movimento de toda a célula, enquanto endosomes apresentam rápido movimento browniano ou dirigida. Algoritmos mais recentes, enquanto significativamente melhorado, ainda estão sendo refinados e otimizados 3,14,23,26,27. Como estes metcochos se tornam mais sofisticados e fiável, que possa analisar centenas ou milhares de manchas, sem ter que verificar-los manualmente em cada ponto. Atualmente, no entanto, sugerimos que estas duas análises ser usados em conjunto para se complementam para a exatidão.
O protocolo que descrevemos pode ser facilmente adaptado para responder a muitas perguntas sobre a endocitose de carga. Ele pode ser usado para realizar a co-localização simples de cargas com componentes CME, e utilizado para mostrar alterações em componentes específicos da maquinaria de endocitose, devido a determinados estímulos. O ensaio também pode ser adaptado facilmente para qualquer processo de endocitose, tal como caveolas 28, que mostram que as concentrações de componentes discretos e revestimento de carga, e para o estudo de tais processos fundamentais em tipos de células especializadas. No futuro, como a edição genoma torna-se mais mainstream 20,29,30, prevemos que ele se tornará o método preferido para a marcação de componentes, e que a dinâmica eo comportamento of vários componentes serão ainda mais refinado. Considerando que nossa compreensão dos processos celulares foi em grande parte impulsionada pela identificação de genes, modificações de proteínas e interactomes, o ensaio descrevemos aqui representa uma das próximas fronteiras da investigação, viz. a definição da dinâmica espaço-temporais destes processos e mecanismos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
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