Artigo de método

Músculo liso da bexiga Faixa Contractility como um método para avaliar do trato urinário inferior Farmacologia

DOI:

10.3791/51807

⸱

18 de agosto de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito apresenta um simples, mas poderoso, método in vitro para a avaliação da contratilidade do músculo liso em resposta a agentes farmacológicos ou estimulação do nervo. As principais aplicações são triagem de drogas e fisiologia do tecido entendimento, farmacologia e patologia.

Resumo

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Descreve-se um método in vitro para medir a contractilidade do músculo liso da bexiga, e a sua utilização para a investigação de propriedades fisiológicas e farmacológicas do músculo liso, assim como as alterações induzidas pela patologia. Este método proporciona informação crítica para compreender a função da bexiga ao superar grandes dificuldades metodológicas encontradas em experimentos in vivo, tais como as manipulações cirúrgicas e farmacológicas que afetam a estabilidade ea sobrevivência das preparações, o uso de tecidos humanos, e / ou o uso de produtos químicos caros. Também proporciona uma forma a investigar as propriedades de cada componente da bexiga (por exemplo, músculo liso, mucosa, nervos) em condições saudáveis ​​e patológicas.

A bexiga é removida a partir de um animal anestesiado, colocada em solução de Krebs e cortada em tiras. As tiras são colocadas dentro de uma câmara cheia com solução de Krebs quente. Uma das extremidades é conectada a um tenso isométrican transdutor para medir a força de contracção, a outra extremidade está ligada a uma haste fixa. O tecido é estimulado pela adição de compostos diretamente para o banho ou por campo de eletrodos de estimulação elétrica que ativam os nervos, semelhante a provocar contrações da bexiga in vivo. Nós demonstramos a utilização deste método para avaliar a contractilidade do músculo liso espontânea durante o desenvolvimento e depois de uma lesão da medula espinal experimental, a natureza da neurotransmissão (transmissores e receptores envolvidos), os factores envolvidos na modulação da actividade do músculo liso, o papel dos componentes individuais da bexiga, e as espécies e as diferenças de órgãos em resposta a agentes farmacológicos. Além disso, poderia ser utilizada para investigar as vias intracelulares envolvidas na contracção e / ou relaxamento do músculo liso, drogas relações estrutura-actividade e da avaliação da libertação do transmissor.

O método in vitro a contractilidade do músculo liso tem sido usado extensivamente for mais de 50 anos, e forneceu dados que contribuíram significativamente para a nossa compreensão da função da bexiga, bem como para o desenvolvimento farmacêutico de compostos actualmente utilizados clinicamente para o controle da bexiga.

Introdução

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O músculo liso da bexiga relaxa para permitir o armazenamento da urina, e os contratos para provocar a eliminação de urina. Relaxamento é mediada por propriedades intrínsecas do músculo liso e pela liberação tônica de norepinefrina (NE) dos nervos simpáticos, que ativa os receptores adrenérgicos beta (β 3 AR em humanos) no detrusor. Anulação é conseguido através da inibição da entrada simpático e ativando os nervos parassimpáticos que liberam acetilcolina / ATP para contrair o músculo liso da bexiga 1. Diversas condições patológicas, incluindo cérebro e / ou lesão da medula espinhal, doenças neurodegenerativas, diabetes, obstrução da saída da bexiga ou cistite intersticial, pode alterar profundamente a função da bexiga, com grave impacto na qualidade de vida do paciente 2. Estas condições de alterar a contractilidade do músculo liso por afectar um ou mais componentes da bexiga: a musculatura lisa, o aferente ou nervos eferentes e / ou omucosa.

Vários in vivo e em métodos in vitro para estudar a função da bexiga têm sido desenvolvidos. In vivo, a cistometria é a medida primária da função da bexiga. Embora isto seja uma preparação intacta que permite a recolha de informação em condições próximas das condições fisiológicas, há um número de circunstâncias, em que é preferido o uso de tiras de músculo liso. Estes incluem situações em que as manipulações cirúrgicas e / ou farmacológicos que afectam a sobrevivência e estabilidade da preparação, in vivo, ou quando os estudos requerem a utilização de tecido humano ou de produtos químicos caros. Este método também facilita o exame dos efeitos de drogas, a idade e patologia em cada componente da bexiga, do músculo liso, ou seja, a mucosa, nervos aferentes e eferentes.

Tiras de bexiga têm sido utilizados ao longo dos anos por muitos grupos para responder a uma série de questões científicas. Eles foram usados ​​para evamudanças luate em atividade espontânea miogênica induzida pela patologia. Acredita-se que esta atividade para contribuir para a urgência e frequência sintomas de bexiga hiperativa (OAB), e é, portanto, um alvo para drogas que está sendo desenvolvido para OAB 3-9. Tiras de bexiga também foram utilizados para investigar fatores miogênicos e neuronais que modulam tônus ​​da musculatura lisa, com o objetivo de descobrir os canais iônicos e / ou receptores e / ou vias intracelulares que poderiam ser direcionados para induzir qualquer relaxamento ou contração da musculatura lisa 3,10- 13. Outros estudos focaram-se na natureza da neurotransmissão, incluindo os transmissores e receptores envolvidos e as mudanças induzidas pela patologia 14,15. Além disso, o método tem sido usado para as comparações entre os tecidos a partir de diferentes espécies de 16 a 18, entre os órgãos de 19-21, e a avaliação das relações estrutura-actividade de drogas 22-24. Uma extensão deste método tem sido usado para MEASURÊ O efeito de drogas na liberação do transmissor de nervos eferentes 25. Além disso, uma variedade de tecidos (bexiga, uretra, tracto gastrintestinal, GI), colhidas a partir de animais ou seres humanos (a partir de cirurgias ou tecido do dador de órgãos aprovados para a pesquisa) e a partir de uma variedade de modelos animais, incluindo lesão da medula espinal (SCI), obstrução da saída da bexiga (BOO), ou cistite intersticial (IC) pode ser investigada usando esta técnica.

Neste trabalho, ilustramos o uso deste método, juntamente com protocolos experimentais necessárias, para solucionar diversas questões científicas mencionadas acima.

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Protocolo

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Todos os procedimentos aqui descritos são aprovados pelo comitê IACUC na Universidade de Pittsburgh.

1. Solutions

  1. Preparar a solução de Krebs de acordo com a receita. Composição em mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl2 1,9, MgSO4 1,2, NaHCO3 24,9, KH 2 PO 4 1,2, dextrose 11,7.
  2. Arejar Krebs com 95% de O2, 5% de CO 2 e coloque-o em um banho de 37 ° C a água para ser usado durante todo o experimento. Coloque lado ~ 200 ml de solução de Krebs arejada à temperatura ambiente até ser utilizado para a dissecção do tecido.
  3. Medir pH (~ 7,4) e osmolaridade (~ 300 mOsm) de aerado Krebs.

2. Experimental Set-up (esquemático Figura 1A)

  1. Encha gaseificado (95% O2, 5% de CO 2) câmaras com 10 ml de Krebs.
  2. Ligue a bomba de circulação de água para aquecer as câmaras a 37 ° C; ligar o equipamento necessário: amplificador (s), estimulador (s) e gravação de software.
  3. Calibração de transdutores com um peso de 1 g.

3 Tecido (Figura 1B)

Retire a bexiga de um adulto do sexo feminino ingênuo Sprague Dawley (200-250 g; ~ 10-12 semanas de idade) seguindo estes passos:

  1. Prepare área de dissecção e instrumentos necessários: máquinas de barbear, pinças com dentes, lâmina de bisturi, tesouras de dissecação, microtesouras, duas pinças de dissecação (autores preferem Dumont fórceps # 3), clips de tecido (ou fio de seda), um prato dissecção Sylgard revestido com Krebs e pinos de dissecação de tecidos.
  2. Anestesiar os animais com a inalação de isoflurano (4% em O 2) na câmara de indução. Use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura sob anestesia. Continuamente monitorizar o nível de anestesia mediante a observação da taxa de respiração, resposta a estímulos externos, e perda do membro posterior retirada reflexa.
  3. Quando o animal é anestesiado barbear a um menor abdominalrea. Expor os órgãos pélvicos através de uma incisão abdominal na linha média. Identificar a bexiga e uretra. Retirar a bexiga através do corte no colo da bexiga perto da uretra proximal. Colocar o tecido imediatamente no prato revestido Sylgard cheio com solução de Krebs arejada.
  4. Se for necessário, remover o tecido adicional neste momento: uretra, pedaços de gastrintestinais (GI) e / ou da próstata, etc
  5. Sacrificar o animal, utilizando métodos IACUC aprovados (por exemplo, por overdose do anestésico ou CO 2 asfixia seguida de um método secundário).
  6. Insira tecido dissecando pinos através da cúpula da bexiga, pescoço e ureteres, para estabilizar o tecido para posterior dissecação. Não estique o tecido. Remover o tecido adiposo, conjuntivo, uretra proximal e ureteres se presente.
  7. Abra a bexiga a partir da base de cúpula para criar uma folha plana, lado serosa baixo / lado luminal up (Figura 1B). Coloque dissecando pinos em cada canto do tecido. Remover dom bexigae tecido e pescoço.
  8. Se o objectivo da experiência é determinar a contribuição da mucosa (urotélio e lâmina própria - ver diagrama Figura 1C) para a contracção do músculo liso, comparar as propriedades das tiras do detrusor, com e sem a mucosa ligada. Por isso, antes de cortar o tecido em tiras, retire cuidadosamente a camada mucosa usando íris primavera tesouras e pinças finas sob um microscópio de dissecação. No final da experiência, para fixar as tiras de coloração de H & E para confirmar a remoção completa da mucosa. Note-se que este procedimento é mais fácil em rato bexiga do que em bexiga de ratos.
  9. Cortar o tecido longitudinalmente a partir da base de cúpula em tiras de ~ 2 x 8 mm (Figura 1B). Amarre ou anexar um clipe de tecido para ambas as extremidades de cada tira.
    Observação: Uma bexiga de rato pode normalmente ser cortado em tiras de 4, mas o número de tiras pode aumentar ou diminuir de acordo com o tamanho do animal / bexiga.
  10. Transfira as tiras para o expercâmaras imental. Anexar uma extremidade de cada tira de um transdutor de força, que mede a contracção do tecido, e a outra para uma vareta de vidro / metal fixo.
    NOTA: câmaras do tecido variam em tamanho (0,2 ml a 20 ml ou maiores). Câmaras típicas para bexigas de roedores são 5-20 ml, as quais proporcionam uma altura suficiente para que as tiras ser completamente submerso na solução. Algumas câmaras vêm com alto-eletrodos de estimulação, outros não. Cuidados devem ser tomados para garantir que todas as conexões dos eletrodos estão em boas condições, caso contrário, a estimulação campo elétrico não é confiável.
  11. Aplicar uma quantidade definida de força para cada tira de tecido que se estende suavemente até que a tensão da linha de base atinge um g (~ 10 min). Inicialmente, o tecido tende a relaxar, que é registrado como uma diminuição da tensão da linha de base. Tecido de lavagem aproximadamente a cada 15 min, utilizando a quente de Krebs gaseificado e ajustar a tensão da linha de base de 1 g após cada lavagem. Permitir que o tecido equilibrar durante ~ 1-2 horas ou até que a tensão da linha de base é estável (ou seja, não mais relaxamento do tecido).
  12. Teste de viabilidade do tecido pela adição de KCl (80 mM) directamente para o banho de ~ 5 minutos, ou até que uma resposta de patamar é atingido. As respostas às elevadas concentrações de KCI, também pode ser repetida durante a experiência ou no fim da experiência e utilizada para normalizar as respostas a outras drogas ou entre as tiras (ver normalização na secção de análise de dados).
  13. Tecidos de lavagem várias vezes (3-5x) com a quente de Krebs gaseificado para permitir que o tecido para voltar às condições de pré-tratamento.

4. Estimulação Protocolos

  1. Para investigar os efeitos da patologia sobre a actividade miogénica espontânea ou tom do músculo liso, usar tiras de músculo liso a partir de modelos de animais diferentes, tais como a SCI, BOO, ou recém-nascidos. Figura 2 ilustra a utilização deste método para investigar mudanças na actividade da bexiga e espontânea durante o desenvolvimento após SCI. Além disso, os agentes farmacológicos podem ser usados ​​para modular spontaneous actividade. Figura 3 ilustra o efeito dos moduladores de canais KCNQ, a flupirtina e XE991, sobre a actividade espontânea e tonicidade do músculo liso.
  2. Para a estimulação do músculo construção de curvas de concentração-resposta lisas farmacológicas por adição de compostos a partir de soluções de reserva concentradas directamente para o banho em intervalos de tempo definidos. Uso de drogas e veículos em faixas paralelas para dar conta de veículos e tempo efeitos.
    1. Faça soluções estoque de compostos de teste desejados em 1000x a concentração de trabalho final. Para carbacol (CCh), um agonista do receptor muscarínico, preparar seguintes unidades: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 ~ 4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. As concentrações finais no banho é de 10 ~ 8 M a 10 -5 M (Figuras 4C, D). Para neuromedina B (NMB), um receptor bombesina subtipo 1 agonista, preparar seguintes unidades populacionais: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M e as concentrações finais no banho são 10 -11 M a 10 -6 M. Ambos CCh e NMB são esperados para aumentar a contratilidade do tecido.
    2. Para um banho de tecido de 10 ml, adicionar 10 ul de cada solução de estoque CCh, logo que a resposta atinge um platô (Figura 4C, D). Em tiras paralelas adicionar quantidades iguais de veículo (água). Da mesma forma, adicionar 10 ul de cada solução de estoque neuromedina B cada ~ 5 min.
      NOTA: Observe o efeito excitatório do NMB e CCh no tônus ​​da musculatura lisa em tiras de diferentes espécies na Figura 4.
    3. Investigar as propriedades de relaxamento da musculatura lisa em tecido pré-contraído com um agente excitatório, geralmente CCh ou KCl.
    4. Para bloquear uma resposta agonista, o pré-tratamento de tecidos durante 10-20 minutos com o antagonista para permitir a penetração do tecido, antes da estimulação agonista.
  3. Para stim neuraismento do músculo liso, também chamado de estimulação campo elétrico (EFS) siga os passos de 1-3,13 e continuar como descrito abaixo. EFS destina-se a activar selectivamente nervos, contra o músculo liso. Parâmetros para a estimulação deve ser cuidadosamente escolhido para evitar a estimulação direta do músculo liso.
    1. Estabelecer parâmetros de estimulação: tipo de estímulo (pulsos individuais ou trens), duração (duração do pulso ea duração de trem), frequência e intensidade, conforme descrito nas etapas a seguir e ilustrado nas Figuras 5A, B.
      1. Para a estimulação único pulso, duração de pulso set, intervalo inter-estímulo e número de estímulos desejados. Parâmetros de duração estimulação usuais são pulsos únicos de 0,05-0,3 mseg de duração entregue em intervalos desejados (Figura 5A). Siga o passo 4.3.1.4 para a intensidade do estímulo.
      2. Para a estimulação trem, definir a duração do trem e inter intervalo de trem. Os valores típicos para o tecido da bexiga são 3-10 seg entregue pelo menos 1 mem separado (Figura 5B). Se ocorrer fadiga tecido (ou seja, EFS contrações diminuir durante o período de controle), aumente o intervalo entre trem.
      3. Estabelecer a freqüência de estímulos de trem (número de pulsos em um trem - A Figura 5B). Executar uma curva de resposta de freqüência que varia 0,5-50 Hz. Frequências típicas para bexiga são 10-20 Hz, que dão contrações reprodutíveis e estáveis ​​mediadas pelo ATP e acetilcolina. Observe as respostas dependentes de freqüência à estimulação EFS em tiras rato bexiga na Figura 5 que demonstram como este método pode ser utilizado para avaliar a contribuição de mecanismos colinérgicos e purinérgicos a neurotransmissão.
      4. Estabelecer intensidade do estímulo: aumentar sistematicamente a intensidade (voltagem) do estímulo até que a amplitude da contração atinge um patamar (se estiver usando trens manter constante a freqüência).
      5. Definir a intensidade do estímulo, dependendo doobjetivo do experimento. Se o objectivo é o de aumentar as contracções evocadas por neuralmente, em seguida, utilizar a intensidade sub-máxima tal que a amplitude da contracção é de ~ 50% da contracção máxima. Se o objetivo é diminuir as contrações evocadas por Neurally, em seguida, definir a intensidade de ~ 80% da amplitude máxima para evitar a fadiga dos tecidos.
    2. Uma vez que os parâmetros de estimulação (duração, frequência e intensidade) são estabelecidos, permitir ~ 20-30 min para EFS- evocado contrações para estabilizar antes de testes de drogas.
      NOTA: Para verificar a seletividade de EFS para a transmissão neural, transmissão neural bloco com o bloqueador do canal de Na +, a tetrodotoxina (TTX; 0,5-1 mM). Executar este passo, no início da experiência, enquanto TTX lava relativamente fácil. Além disso, esta realização, no final da experiência (ver o passo 4.3.5. Abaixo).
    3. Preparar soluções estoque de 1000X as concentrações de trabalho finais para: alfa, beta-metileno ATP (ABMA; um ativador do receptor purinérgicoe dessensibilizante) 10 -2 M, atropina (um antagonista do receptor muscarínico) 10 -3 M (Figura 5C). Observar outros exemplos na Figura 6. O agonista do receptor 5HT4, cisaprida (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 ~ 4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), aumenta a contractilidade do tecido e SB-203186 (3 x 10 -3 M), um antagonista do receptor 5HT4, inverte os efeitos de cisapride.
    4. Para testar os efeitos da ABMA e atropina sobre EFS (Figura 5C), realizar duas curvas de resposta de freqüência de controle. Adicionar 10 ul de 10 -2 M ABMA para o banho para uma concentração final de 10 uM. Isto irá contrair o tecido devido a estimulação directa do receptor purinérgico do músculo liso. Após a resposta retorna à linha de base, repita as curvas de resposta de freqüência. Adicionar 10 ul de 10 -3 M de atropina para um final de concentratião de 1 uM. Após cerca de 10 min (necessário para a atropina para bloquear os receptores muscarínicos), curvas de resposta de freqüência de repetição. Em tiras paralelas adicionar 10 ul de veículo, água, em cada passo.
      NOTA: Para outros exemplos na Figura 6, adicionar 10 ul de cada solução de cisaprida em intervalos definidos de tempo (~ 15 min cada, ver a discussão), seguidos por 10 ml de SB-203186 solução estoque directamente para o banho e monitorizar o seu efeito em EFS contração induzida. Em tiras paralelas adicionar 10 ul de veículo, DMSO. Observar os efeitos de cisaprida, um agonista do receptor 5HT4, em contrações EFS-evocados em bexiga e íleo tecidos humanos na Figura 6. Além disso, observar o efeito do DMSO, o veículo para a cisaprida, a EFS evocados contrações na bexiga humana e tecidos íleo .
    5. No final do protocolo de EFS verificar a selectividade de EFS, bloqueando a transmissão nervosa com o bloqueador do canal de Na +, a tetrodotoxina (TTX; 0,5-1 &# 181; M). Se contracções resistentes TTX estão ainda presentes, recomenda-se a ajustar a duração e intensidade do estímulo em experiências subsequentes.
  4. Para determinar os efeitos das drogas em locais pré ou pós-sináptica (Figura 7A) siga os passos de 1 a 4.3.2. Estabelecer respostas reprodutíveis ao carbacol e EFS, em seguida, adicione X. droga
  5. No final da experiência, ou desatar desencaixe das tiras, apagá-las cuidadosamente sobre um pedaço de papel de tecido para eliminar o fluido extra e medir o peso de cada tira utilizando uma balança. Também medir o comprimento do tecido, utilizando um paquímetro para determinar a área transversal. Esta informação é usada para a normalização dos dados (ver secção 5.4).

Análise de Dados 5.

Analisar dados usando o software adequado (por exemplo, Windaq, LabChart).

  1. Para a atividade espontânea, selecione uma janela de pelo menos 30 segundos antes e no pico da resposta induzida por drogas e meamplitude asure e frequência de atividade miogênica (Figura 3).
    1. Use a análise de transformação rápida de Fourier para determinar o espectro de freqüências que contribuem para respostas contráteis e se há diferenças entre as diferentes partes da bexiga (por exemplo, a cúpula vs. pescoço) ou com o desenvolvimento, patologia e medicamentos 8.
  2. Para efeitos no tônus ​​da musculatura lisa selecionar uma janela de pelo menos 10-30 segundos antes e no pico da resposta induzida por drogas e medir a amplitude de contração.
  3. Para efeitos sobre as contracções evocadas neuralmente medem a amplitude, a duração e a área sob a curva de contracções (pelo menos 3), antes e no pico da resposta induzida por drogas.
    NOTA: É necessário medir a amplitude e área sob a curva de contracções induzidas por EFS, porque os componentes purinérgicos e colinérgicos têm diferentes cinéticas. O componente purinérgico é rápida e transiente (ATP activa purinergic canais ionotrópicos como P2X1, que permitem o influxo rápido de cálcio, em seguida, eles dessensibilizar), contribuindo, assim, mais para o pico de resposta de amplitude e menos para a área sob a curva. O componente colinérgica é mais lenta e sustentada (ACh activa receptores muscarínicos metabotrópicos, que necessitam de mais tempo para activar vias de sinalização intracelular que em última análise, activam os canais iónicos que despolarizar o músculo liso para induzir uma contracção). Assim, o componente muscarínico é capturado melhor através da medição da área sob a curva.
  4. Normalizar os dados para poder comparar resultados entre tiras e tratamentos farmacológicos. O parâmetro escolhido para a normalização não deverá ser influenciada por os compostos de teste, estudou condição patológica ou desenho experimental. Entre estes parâmetros, a utilização de peso tira, a área de corte transversal, as respostas de KCl (Figura 4B),% da resposta máxima (Figura 7B) ou% da resposta máxima para um outro agente contráctil(Por exemplo, CCh) ou agentes relaxantes (por exemplo, papaverina).

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Resultados

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Espontâneo Atividade Miogênica

Atividade miogênica espontâneo é uma importante característica do músculo liso que sofre alterações com o desenvolvimento pós-natal 6-9 e patologia (por exemplo, SCI, BOO) 3-5. Porque se acredita que essa atividade contribui para os sintomas de bexiga hiperativa (OAB) 2, uma avaliação de receptores, vias intracelulares e agentes farmacológicos que modulam, é de grande interesse para o desenvolvimento de...

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Discussão

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Neste artigo descrevemos um simples método in vitro contratilidade do músculo liso que pode ser usada para abordar uma série de questões científicas importantes relacionados à fisiologia e patologia da bexiga, bem como auxiliando na descoberta de novos medicamentos para tratar disfunções de bexiga. Ilustramos o uso deste método para avaliar as propriedades de desenvolvimento, patológicos e farmacológicos da contractilidade do músculo liso da bexiga (Figuras 2-4), modulação da neurotransmissão <...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este estudo foi financiado pelo NIH R37 e R01 DK54824 DK57284 subvenções a LB.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EquipmentSistema de Banho de
Tecidos com ReservatórioRadnoti, LLC159920banhos de tecidos isolados
Bomba recirculadora de água quenteKent Scientific Corporation TPZ-749para manter os banhos de tecido em 37 ° C
Sistema de aquisição de dadosde
Amplificador de transdutor TransbridgeWorld Precision InstrumentsSYS-TBM4MAmplificador de transdutor
Estimulador de gramaGrass TechnologiesModelo S88
Estimulador Sistema de anestesiaKent Corporação Científica ACV-1205SPara anestesiar o animal
Caixa de anestesiaAparelho de Harvard500116Para anestesiar o animal
Máscaras de anestesiaKent Scientific Corporation AC-09508Para anestesiar o animal
Materiais e Instrumentos Cirúrgicos
SylgardDow Corning Corp184 SIL ELAST KITPara fixar, dissecar e cortar tecido
Placa de PetriCorning3160-152Para dissecar/cortar tecido
Alfinetes de insetosENTOMORAVIA Austerlitz Pinos de insetosTamanho 5Para fixar tecido
Almofada de BancoVWR International56617-014Almofadas de bancada absorventes
cirúrgico para ratosKent Scientific Corporation INSRATKITPara remover e dissecar tecido
2 Fórceps Dumont #3 KentScientific Corporation INS500064Para remover e dissecar tecidos
Pinças de TecidosKent Scientific Corporation INS500092Para remover e dissecar tecidos
BisturiKent Scientific Corporation INS500236Para remover e dissecar tecido
Lâmina de bisturiKent Scientific Corporation INS500239Para remover e dissecar tecidos
Clipper Profissional Braintree Scientific, Inc.CLP-223  45Para remover o fio de sutura de pele
Ferramentas Fine Science18020-50Amarrar o tecido
Clipes de tecidoRadnoti, LLC158802Anexar o tecido à haste/transdutor
Peso de 1 g  11119525 Mettler ToledoPara calibração
Chemicals
Krebs Solution:
Cloreto de sódio
Cloreto de potássio
Fosfato de potássio monobásico
Sulfato de magnésio
Dextrose
Bicarbonato de sódio
Cloreto de cálcio
Cloreto		de magnésio 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		 
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		Para preparar a solução de Krebs
IsofluranoHenry Schein029405Para anestesiar o animal
  Tanque de oxigênioMatheson Tri Gasox251Para usar com sistema de anestesia
Tanque de carbogênio (95% de oxigênio; 5% de dióxido de carbono) Matheson Tri GasMoxn00hn36DPara arejar soluções Krebs
computador DataQ Instruments DI-710-UH Para visualizar, registrar e analisar dados Kit do transdutor

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

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