Artigo de método

Multimodal ópticos métodos de microscopia Revelar Polyp Tissue Morfologia e Estrutura em Caribe Reef construção Corais

DOI:

10.3791/51824

⸱

5 de setembro de 2014

 ,  ,  , 
1Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign

Neste artigo

Resumo

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Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia do pólipo e estrutura do tecido no corais do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescência, rosto bloco de série, e microscopia de varredura a laser confocal de dois fótons identificaram estrutura lobate, paredes de pólipos, e chromatophore estimado e densidades zooxanthellae e distribuições.

Resumo

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Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia tridimensional (3D) e estrutura celular dos tecidos dos pólipos que compreende os corais construtores de recifes do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Estas abordagens incluem a microscopia de fluorescência (FM), bloco de série rosto de imagem (SBFI), e microscopia de dois fótons de varredura a laser confocal (TPLSM). SBFI fornece imagens de tecidos profundos após a secção física; detalha o tecido da superfície de textura e visualização 3D em profundidades de tecido de mais de 2 mm. FM Complementar e rendimento TPLSM imagens de resolução ultra-alta de tecido estrutura celular. Os resultados: (1) identificar previamente não declarada morfologias tecido lobulados na parede externa de pólipos de corais individuais e (2) criou os primeiros mapas de superfície da distribuição 3D e tecido densidade de cromatóforos e endossimbiontes dinoflagellate zooxanthellae algas-like. Spectral ervilha absorçãoks de 500 nm e 675 nm, respectivamente, sugerem que M. annularis e M. faveolata conter tipos semelhantes de clorofila e cromatóforos. No entanto, M. annularis e M. faveolata apresentam diferenças significativas na densidade do tecido e 3D distribuição destes componentes celulares principais. Este estudo sobre métodos de imagem indica que SBFI é extremamente útil para a análise de amostras de grandes mm escala de tecidos corais descalcificadas. FM e TPLSM cortesia revelar mudanças de escala submillimeter sutis na distribuição celular e densidade em amostras de tecido coral nondecalcified. A técnica TPLSM proporciona: (1) preparação minimamente invasivo da amostra, (2) capacidade de corte óptico superior, e (3) a absorção de luz e dispersão mínima, enquanto continua a permitir imagiologia dos tecidos profundos.

Introdução

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O aquecimento global e as mudanças ambientais que o acompanha estão afetando diretamente a saúde e distribuição de corais marinhos tropicais 1-4. Múltiplos impactos estão sendo observados, incluindo branqueamento de corais e do surgimento de doenças infecciosas 5-6. No entanto, a previsão mais precisa do futuro resposta coral a estas ameaças ambientais, é necessário que a "linha de base" histológico ser estabelecida, que define a morfologia do tecido e composição celular e distribuição de corais "aparentemente saudáveis". Por sua vez, "impactado" corais podem então ser comparados quantitativamente. Além disso, deve ser estabelecido essa linha de base para os corais aparentemente saudáveis ​​sob uma variedade de condições ambientais, de modo que "a resposta saudável" também pode ser medido através de gradientes ambientais. Como passo inicial para estabelecer essa linha de base, um estudo 3D de alta resolução foi realizado de forma aparentemente saudável coral tecido pólipomorfologia e composição celular responde ao aumento da profundidade da água (WD), e diminuição de acompanhamento na luz solar irradiância. Os resultados podem então ser usados ​​para estabelecer um entendimento mecanicista mais abrangente de adaptação coral, bem como para obter insights sobre a evolução coral-simbionte ea melhoria da coleta de luz.

Corais duros (Scleractinia) são animais invertebrados marinhos coloniais que abrigam um complexo conjunto de outros microrganismos, colectivamente referidos como o coral holobiont 7-10. A pesquisa realizada no presente estudo procura usar um conjunto de tecnologias de imagem de última geração para monitorar simultaneamente alterações com o aumento da profundidade da água nos tecidos e pigmentos zooxantelas simbióticas de corais hospedeiros aparentemente saudáveis. Isto irá estabelecer o tecido celular comparativa "linha de base" necessária através de um gradiente batimétrico para corais aparentemente saudáveis ​​e funcionam como indicadores de coral health 10. Pigmentos Coral, chamados cromatóforos, agir no sentido de absorver, refletir, dispersão, refração, difração, ou de outra forma interferir com a radiação solar incidente 11. A relação endosymbiotic zooxantelas-chromatophore permitiu a co-evolução de otimização decolheita estrategicamente vantajoso e estratégias de crescimento do esqueleto, bem como plasticidade trófica (estratégias de alimentação deslocando para trás e para a frente de autotrofia para heterotrofia) para o animal coral 12.

A ilha caribenha de Curaçao sul (que fazia parte das Antilhas Holandesas) fica a cerca de 65 km ao norte da Venezuela dentro da tensão leste-oeste Aruba-La Blanquilla arquipélago (Figura 1A). A costa 70 quilômetros de comprimento sul de Curaçao contém um contínuo moderno e Mioceno-Plioceno-Pleistoceno-Holoceno antigo franjas recife de coral trato 13,14. SST média anual em Curaçao varia aproximadamente de 3 ° C anually, variando de um mínimo de 26 ° C no final de janeiro para um máximo de 29 ° C no início de setembro, com uma temperatura média anual de 27,5 ± 0,5 º C (NOAA SST conjuntos de dados, 2000-2010). O recife de coral em Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), encontrando-se perto da ponta noroeste da Curaçao (Figura 1A), foi escolhida por amostragem, porque tem sido previamente bem estudado eo ecossistema marinho neste local é banhado em fresco nonpolluted 7,15-19 água do mar. . Duas espécies de coral escleractíneos intimamente relacionados, M. annularis e M faveolata, foram escolhidos para a experimentação e análise neste estudo, pois cada espécie: (1) as distribuições batimétricas exposições distintas e não sobrepostas sobre o trato recife no que diz respeito à quebra da plataforma e do ambientes de sedimentação de carbonato sedimentares associados (intervalo annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatagama = 10-20 m WD 20; Figuras 1B, 2A, e 2B); (2) é um coral comum construtor quadro recife ao longo do Mar do Caribe 21; e (3) tem bem estudado ecológica, fisiológica e relações evolutivas 22.

Amostragem de campo para o presente estudo foi realizado utilizando técnicas de mergulho com cilindro padrão no mar de Playa Kalki em Curaçao. A batimétrica água rasa transecto-a-fundo foi estabelecido que correu pela prateleira, sobre a quebra da plataforma, e nos ambientes profundos recifes tona de água. Aparentemente corais saudáveis ​​foram identificados por amostragem ao longo do transecto batimétrico, incluindo: (1) três indivíduo ~ 1 m corais diâmetro de M. annularis, todos os quais foram a 5 m de profundidade de água (WD); e (2) três individuais ~ 1 m corais diâmetro de M. faveolata, todos os quais foram a 12 m WD. Radiação fotossinteticamente ativa (PAR) foi medido como 33-36% PAR a 5 m WD e 18-22% PAR 10 m WD. A amostragem foi realizada em janeiro, quando o SST foi de 26 ° C, nas profundidades de água de ambos os 5 m e 12 m. Cada uma dessas seis cabeças de coral foi coletada em triplicata em posições espaciais equivalentes (ie., Cerca de 45 ° N de latitude em cada um dos seis cabeças de coral hemisféricas). Cada amostra individual consistia em um 2,5 cm de diâmetro coral núcleo biópsia de tecido-esqueleto que foi coletado com arco soco limpo. Três biópsias de tecidos-esqueleto de coral foram amostrados em SCUBA padrão com as mãos enluvadas de cada uma das cabeças de coral (9 de M. annularis colônias em 5 m WD e 9 de M. faveolata a 12 m WD). Imediatamente após a recolha em profundidade, cada amostra de biópsia do núcleo foi colocado num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno estéril, selado com tampa de rosca, e retornado para a superfície. A água do mar foi decantado a partir de cada tubo de centrifugação e cada biópsia foi então imerso, armazenados e transportados em paraformaldeído a 4%.

imagem SBFI já foi realizado em uma grande variedade de amostras biológicas, incluindo todo o cérebro e tecidos humanos de coração inteiro, os embriões intactos rato, embriões de peixe zebra, e vários tipos de amostras de animais com ossos intactos 23-30. A maioria destes estudos utilizaram microscopia óptica / light ou com fluorescência ou técnicas de campo brilhantes. No entanto, estudos têm sido realizados no ultra-grandes ampliações utilizando eletrônica de varredura bloco de série rosto de imagem no passado 31. No presente estudo, um protocolo modificado SBFI foi desenvolvido e aplicado para a corais, pela primeira vez. Porque M. annularis e M. corais faveolata são de 1-2 mm de espessura, nenhuma das técnicas de microscopia de luz de rotina seria capaz de penetrar em toda a espessura do tecido de coral pólipo. Portanto, temos SBFI protocolo de preparação da amostra projetado especificamente para amostras de coral. Além disso, temos projetado um suporte estereoscópico, Que tem um motor para mover em ambas as direcções x e y. Este aparelho tem as imagens da face do bloco de amostra, em vez de recolher as secções utilizando um micrótomo regular em frente do microscópio. Nós também introduzido um outro de dois fotões técnica de microscopia óptica não-linear de imagem das mesmas os pólipos em toda a espessura dos tecidos de coral. Isto ultrapassa as limitações impostas pela SBFI em termos de descalcificação e a possibilidade de alterações na morfologia do tecido e volume (encolhimento) que podem ser induzidas, por uma preparação de amostra (desidratação) e protocolos de processamento. Além disso, os perfis de emissão dos corais foram espectralmente resolvido para identificar as suas emissões de pico e variações entre os cromatóforos e as zooxantelas fotossintética. Estes resultados foram avaliados no contexto do método utilizado e as suas vantagens em relação a cada tempo de aquisição, a análise do tempo, e a capacidade de resolver os detalhes estruturais finos sem comprometer structural integridade do tecido de coral.

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Protocolo

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NOTA: Reagentes para estar preparado para Face Serial Bloco de imagens de amostras de coral

1. Preinfiltration Wax

  1. Melt 3,6 g de flocos de estearina de uma proveta de vidro. Misture bem em uma placa quente (60-70 ° C).
  2. Adicionar 400 mg de Sudan IV (para minimizar cera fluorescência de fundo). Misturar bem e esperar até que uma solução de vermelho translúcido é alcançado.
  3. Adicionar 96 ml de parafina fundida a quente (100%) e misturar bem.

1.2) Embedding Wax

  1. Melt 7,2 g de flocos de estearina de uma proveta de vidro e misturar bem em uma placa quente (60-70 ° C).
  2. Adicionar 0,8 g de Sudan IV. Misturar bem e esperar até que uma solução de vermelho translúcido é alcançado.
  3. Adicionar grânulos de parafina (162 g) e misture até parafina derrete completamente.
  4. Adicionar 30 g de branco granular Vybar e derreter completamente no mesmo copo; uma vez derretido, misturar.
  5. Genericamente fechar o frasco de vidro com tampa. Coloque a garrafa de vidro em um 60 ° C convecção oven para manter os ingredientes no estado líquido. Realizar todas as infiltrações neste forno.
  6. Dividir o volume total de 200 mL a cera vermelha em duas garrafas de vidro de 100 ml cada. Use uma alíquota para a infiltração e o outro para a incorporação final.

1.3) Incorporação de Coral Os tecidos para o Bloco de série cara Imagem

  1. Lave os pólipos de coral coletadas em campo (SI vídeo 1) e armazenados (3-6 meses em 4-5 ° C em paraformaldeído) em tampão fosfato (3x 5 min) e descalcificação quando estiver pronto para ser trabalhada. Descalcificação dos pólipos em solução Excal por 24 horas ou até que os pólipos são totalmente desprovidos de CaCO3. Incubar vários corais descalcificadas como um único bloco de uma série 25, 50, 75, e 100% de etanol, seguido por 1x substituto de xileno para desidratar as amostras.
  2. Coloque os pólipos processados ​​em forno pré-aquecido a 65 ° C, contendo 100% substituto xileno. Incubar durante 30 minutos duas vezes por Changing a solução fresca. Orientar os pólipos de tal maneira que a parte superior dos pólipos está voltado para baixo e a superfície superior é tão plana quanto possível.
  3. Adicione soluções de 2: 1, 1: 1 e 1: 2 e xileno substituto de cera preinfiltration (passo 1.1) em 50 mL de tubos Falcon.
  4. Incubar os pólipos com estes três concentrações crescentes de cera preinfiltration, seguido por incubação em 3x 100% preinfiltration cera durante 30-60 min de cada vez.
  5. Nota: Dependendo da espessura das amostras, os passos 1.3.1-1.3.5 pode ser aumentado com períodos mais longos de tempo.
  6. Mova as amostras para a incorporação de cera (veja o passo 1.2.6) após incubação 3x em 100% preinfiltration cera.
  7. Remover a cera incorporação após 30 min. Substituir com cera incorporação fresca e continuar a incubação durante um período mínimo de 4 horas a 65 ° C.

1.4) Incorporação em Red Wax

  1. Fotografe o bloco (a bandeja de aço inoxidável onde a cera branca é colocado e em cima do que o sample é colocado). Isto é necessário porque uma vez incorporado na cera, o local da amostra irá tornar-se invisível, como a cera é a incorporação de vermelho opaco.
  2. Coloque pequenas gotas de cera ponto alto ponto de fusão em torno do novo aço inoxidável pré-aquecido molde a incorporação e deixe-o esfriar. Despeje uma pequena quantidade de cera derretida de embutir recém segundo recipiente como indicado no passo 1.2.6.
  3. Posicionar o pólipo coral voltado para baixo rapidamente através da cera de ponto branco, em seguida, colocar num suporte de amostras de plástico no tabuleiro de aço inoxidável e despeje cera mais de incorporação de modo a que a cera vem para a superfície do molde de plástico.
  4. Leve toda a configuração de 65 ° C forno e deixe esfriar em um banco ou uma superfície fria até que a cera endurece completamente.
  5. Isto pode demorar até 6 horas ou dois dias. Colocar o bloco dessecada no frigorífico a 4 ° C, protegida da luz, para o armazenamento a longo prazo.

1.5) Seccionamento da série de configuração do bloco de Rosto

  1. Trim o bloco e cortada 1 mM seções usando um micrótomo. Não coletar as seções como eles vão se tornar como pó. Lembre-se, nós estamos imaginando apenas o rosto bloco. A amostra é exibida quando a cera branca começa a desaparecer.
  2. Captar imagens da face do bloco liso que contém a amostra de cada vez que uma secção é removida. Continue até que o pólipo coral desaparece como em SI Video 2.
  3. Record / capturar as imagens com uma câmera monocromática utilizando um filtro fluorescente FITC para pegar a auto-fluorescência do cromatóforos / coral pólipo. Imagem 3-4 núcleos descalcificados de cada espécie.

2. de imagem Corais Sob Dois fótons de microscopia de fluorescência

  1. Corrigir núcleos de pólipos de coral, cada um contendo cerca de 10-12 pólipos cerca de uma polegada de diâmetro, em paraformaldeído a 4% no local de coleta (beira-mar), assim que eles são colhidos sob a água.
  2. Manter as amostras a 4 ° C até à imagiologia. Núcleos lavados são colocados em poe mesma solução de cabeça para baixo em um prato fundo de vidro da tampa (0.17 mm de espessura).
  3. Usando um laser de dois fótons em 780 nm de excitação, imagem 3-4 pólipos em duas ampliações diferentes (zoom digital) com um (NA 0.3) objetiva de 10X. A forma pólipo coral ea altura varia entre as amostras (geralmente 1-2 mm) e profundidade de imagem também é limitada pela distância de trabalho do objetivo da imagem.
  4. Use o modo de digitalização telha de recolher cerca de 25-100 (5 x 5 ou 10 x 10 telhas) imagens por plano focal em xy e 50-100 imagens através do eixo z no intervalo de 10 ou 20 um, totalizando cerca de 5.000-10.000 images / pólipo coral.
  5. Imagem 3-4 áreas de pólipos para representar um núcleo e coral espécie. NOTA: A imagem tempo de aquisição varia entre 2-5 horas / área de pólipo.
  6. Armazenar todas as imagens no formato de dados brutos no disco rígido do sistema como LSM 5 de renderização 3D em uma análise de imagens 3D e software de renderização.

Volume Rendering 3 3D e Visualization de SBFI e de dois fótons de fluorescência espectral de dados

  1. Cortar os dados 2D para reduzir o tamanho do arquivo, concentrando-se em um único pólipo usando a ferramenta de corte quadrado no programa e compilar em um único arquivo TIFF (reduzir o tamanho do arquivo também por salvar o arquivo no formato de 8 bits) no software de aquisição.
  2. Abra os arquivos montados dos dados SBFI (recolhidas no passo 1.5.1) ou os azulejos vários z pilhas de secções ópticas de dois fótons (recolhidas no passo 2.1.4) no programa Imaris Ultrapasse módulo sob algoritmo volume.
  3. Projetar os dados SBFI prestados em 3D usando uma projeção de sombra. Criar um modo isosuperfície onde os voxeis são limiarizados para criar um padrão de superfície sólida (SI vídeo 3).
  4. Visualize as projeções em 3D usando um algoritmo de plano de corte em xy, xz e modos ortogonais yz para revelar estrutura 3D e forma dos corais.
  5. Animar as projeções usando um módulo de chave quadro de animação no mesmo programa Imaris (SI Videos 3-7).
  6. Gerar arquivos de vídeo em 5% de compressão e gerar um clips de vídeo em formato AVI com volumes (SI Vídeos 4 e 6), 3D e isosuperfície modalidades (SI Vídeos 5 e 7).

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Resultados

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Um aparelho de SBFI personalizados (fabricado especificamente para o presente estudo, a Figura 3) produziu os primeiros detalhadas em 3D de mapas digitais de elevação (MDEs) da textura da superfície exterior e morfologia do M. annularis e M. pólipos de coral faveolature (Figura 4 e SI Vídeos 1-2). Isto produziu imagens de lóbulos empilhados previamente undescribed de tecido de coral concentricamente irradiando para fora a partir do centro de c...

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Discussão

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Pesquisa recife de coral é um esforço de pesquisa altamente interdisciplinar, envolvendo análise da simultânea físicos, químicos e fenômenos biológicos que atuam no ambiente marinho. O estudo dos ecossistemas de recifes de coral complexos é, portanto, melhor concluída dentro de "Powers of Ten" quadro contextual (Figura 10). Este gráfico ilustra que a compilação do ecossistema coral abrange uma ampla gama de dimensões espaciais (10 -9 a 10 5 m). Além disso, este exercício ...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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Agradecemos a Donna Epps, histologista do Instituto de Biologia Genômica da Universidade de Illinois Urbana-Champaign (UIUC), por sua competente assistência técnica na preparação e seccionamento de amostras. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa para B.W. Fouke do Escritório de Pesquisa Naval (N00014-00-1-0609). Além disso, C.A.H. Miller recebeu doações do Departamento de Geologia da UIUC Wanless Fellowship, do fundo Leighton do Departamento de Geologia da UIUC e do fundo de trabalho de campo Roscoe Jackson do Departamento de Geologia da UIUC. As interpretações apresentadas neste manuscrito são de responsabilidade dos autores e podem não representar necessariamente as das instituições concedentes. Também agradecemos ao laboratório de Pesquisa e Gestão da Biodiversidade do Caribe (Carmabi) em Curaçao por seu apoio e colaboração na coleta das amostras de biópsia de tecido de coral. Agradecemos a Claudia Lutz, especialista em comunicação de mídia da IGB, por sua hábil correção de linguagem.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Esqueleto de Tecido de2,5 cm Biópsia de habitat natural
Arch Punch Coring DeviceC.S. Osborne and CompanyNo. 149Para coleta de biópsia
Microscopia EletrônicaParaformaldeídoCiências RT 1570016% Pré-diluído
Histoclear/Safeclear IIMicroscopia EletrônicaCiências RT 64111-04Não tóxico alternativo ao xileno, desidratação e desparafinização
xileno e etanolFisher ScientificDesidratação
Cera de parafinaRichard Allen ScientificTipo H REF 8338Solução de infiltração
VybarThe Candle MakerComponente da Red
Wax StearinThe Candle MakerComponente da Red Wax
Sudan IVFisher ChemicalS667-25Fundo Vermelho Cera-Opaco
Aglutinina de Gérmen de Trigo (WGA)Life TechnologiesW32466Para rotulagem  Coral Mucus
Prolong GoldLife TechnologiesP36095Mídia de montagem anti-desbotamento
Prato de FluoroWorld Precision InstrumentsFD-35-100Para imagem de dois fótons
XY Motor, Driver e ControladorLin Engineering211-13-01R0, R325, R256-ROXY Movimento Translacional
Placa QuenteCorningDC-220Derretendo todas as ceras
Forno de ConvecçãoYamatoDX-600Processador de Tecidos de Infiltração e Incorporação
LeicaASP 300Desidratação,
MicrótomoLeicaRM2055Facas descartáveis
Microscópio EstéreoCarl ZeissStereolumar V 121.5x (30 mm WD)
Microscópio de Fluorescência Objetiva com ApoTomeCarl ZeissAxiovert M 200, ApoTome I Sistemade imagem Seção fina de um pólipo: Zooxanthellae
Câmera AxiocamCarl ZeissMRmCâmera monocromática 1388x1040 pixels
Software AxiovisionCarl ZeissVersão 4.8Programa de aquisição
de imagem Espectros de laser de dois fótonsMaitaieHP, laser pulsado (70 fs)Com módulo DeepSee
Microscópio de varredura a laserCarl ZeissLSM 710 com detector espectral DetecçãoPMT de 34 canais
Zen SoftwareCarl Zeiss2010 ou superiorpara aquisição de imagens espectrais e de dois fótons
Imaris Suite SoftwareBitplane, Inc.,Versão 7.0 ou superior3D Volume, Renderização de Iso-superfície, Visualização
Coral de coral de de Infiltração

Referências

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