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A glicosilação é uma modificação essencial de proteínas pós-tradução, contribuindo para a fisiologia do organismo, a patologia do tecido, e reconhecimento celular 1-3. Apesar dos grandes avanços na glycoscience analítica, caracterizando a diversidade completa de glicanos em uma proteína específica continua a ser uma tarefa extremamente desafiadora, especialmente em proteínas isoladas de fontes biológicas primárias. No entanto, o microheterogeneidade de glicanos glicoproteína freqüentemente afeta as interações funcionais com outras proteínas. Portanto, a caracterização da diversidade de glicano é essencial para compreender o significado fisiológico de 4,5 glicosilação celular e tecidual. A fim de compreender a contribuição de glicoproteína de glicosilação para a fisiologia e patofisiologia tecido, robusto, sensível e técnicas analíticas glycomic abrangentes tornaram-se cada vez mais importante. Na análise proteômica, identificações de proteína são geralmente alcançado por LC-MS/ MS de péptidos trípticos 6. Digestão de proteínas pode ser realizada utilizando uma proteína ou proteínas purificadas resolvidas por SDS-PAGE após digestão em gel com proteases tais como tripsina 7-9. Pré-enriquecimento da mistura de proteína por SDS-PAGE aumenta a profundidade e precisão de identificação de proteínas. O desenvolvimento de estratégias análogas para análise glycomic de glicoproteína glicosilação se encontra na vanguarda da glycoscience.
As duas principais classes de glicanos estão ligados a espinha dorsal de proteínas, quer através de ligação ou N-O-ligação. Glicanos ligados a N estão ligados a asparagina (Asn) resíduos encontrados como parte de um sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X é qualquer aminoácido excepto prolina), e pode ser libertado por digestão enzimática com N p�tido -glycanase (PNGaseF ou A), quer em solução, em gel, ou sobre-blot 10-12. Glicanos ligados a O estão ligados principalmente a serina (Ser) ou treonina (Thr) resíduos. No entanto, apenas uma enzima foi idenficada que é capaz de libertar os glicanos ligados em O de glicoproteína e tem uma especificidade de glicano extremamente limitada, libertando apenas os glicanos ligados em O mais simples. Estratégias de liberação química continuam sendo o método de escolha para a liberação completa de glicanos ligados em O de glicoproteínas. Β-eliminação redutiva ou não-redutora, ou hidrazinólise são técnicas de liberação química bem caracterizados e são atualmente as abordagens mais comumente usadas para a liberação glicanos ligados em O de glicoproteínas 13,14. Embora β-eliminação redutiva foi usado para libertar os glicanos ligados em O a partir de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, as abordagens anteriores necessária separação por HPLC para análise subsequente 15-17.
Análise multidimensional MS (MS n) fornece atualmente a mais rica fonte de dados estruturais para a caracterização de glicanos libertados de glicoproteínas isoladas nos valores esperados da maioria das fontes biológicas. A profundidade da EMcaracterização estrutural baseado é muito facilitada por permethylating os glicanos divulgados antes da sua análise. Permetilação aumenta ionização e tende a igualar as respostas sinal molares através de uma ampla gama de estruturas de glicano 18,19. Além disso, permetilação inequivocamente Tag metades monossacarídeos terminais e substituídos com massas distintas, aumentando assim elucidação estrutural 20-23. Por exemplo, glicanos ácidas são geralmente difíceis de detectar, como espécies não permetilado por MS. Embora glicanos ácidas pode ser detectado no modo de iões negativos por MS, é impossível detectar ambos os glicanos ácidas e neutras no mesmo modo de ião. Uma grande vantagem do permetilação glicano é que todos os grupos hidroxilo livres (OH) em substituintes de monossacárido de um glicano vai ser tapado com um grupo metilo (OCH3 ou OMe), assim taxas de sialilados de glicano são neutralizados, tornando-os como detectável como permetilado neutro (ásialo) glicanos. No entanto, os hidroxilos de metades de sulfato em sulfoglycans são resistentes a permetilação, resultando na retenção de carga aniónica, o qual suprime a ionização e diminui a sensibilidade. Esta supressão impede actualmente análise glycomic abrangente de glicoproteínas muito complexas tais como mucinas, que carregam uma alta abundância de glicanos sulfatados 24-26.
As recentes notícias sobre purificação sulfatada glicanos usado cobrado, cromatografia de fase reversa para purificar e glicanos permetilado separados antes da análise MALDI. Este método baseia-se na separação completa de glicanos sulfatados e não sulfatados com diferentes fases móveis para a eluição, o que temos encontrado para ser menos rigorosas do particionamento fase orgânica. Portanto, as novas técnicas adequadas para a detecção e enriquecimento de sulfoglycans são apresentados aqui. Estas técnicas permitem a recuperação quantitativa de glicanos sulfatados na fase aquosa de água seguinte: DCM (diclorometano)de extracção, que é realizado rotineiramente no final de reacções de glicano 27 permetilação. É importante ressaltar que esta separação robusto de sulfoglycans permetilado partir de uma mistura de glicanos não-sulfatados permetilado enriquece concomitantemente para espécies carregadas ao mesmo tempo, simplificando MS dois padrões de fragmentação. Também é apresentado um protocolo global para melhorar a análise de glicanos ligados-O em-gel. O protocolo melhorado aumenta a recuperação de glicano, aumenta a informação estrutural obtida através de análise de MS n glicanos permetilado, e melhora a sensibilidade das análises sulfoglycomic aplicadas às glicoproteínas essenciais isolados a partir de fontes biológicas.
Este protocolo destina-se a análise de glicano ligado em O de extractos de glicoproteínas integrais ou de uma glicoproteína específica de interesse resolvidas por SDS-PAGE e é composto por três procedimentos experimentais; A) gel de limpeza, B) redutora β-eliminação em gel, e C) permethy glycanlação. O objectivo é a obtenção de dados glycomic ligados a O abrangentes para glicoproteínas colhidas a partir de fontes primárias de interesse biológico (Figura 1). As glicoproteínas separadas por SDS-PAGE são visualizadas por coloração e as bandas de interesse são excisadas e a banda de gel resultante é cortado em pequenos pedaços. Os pedaços de gel são descorado e sujeito a lavagens de acetato de etilo para remover contaminantes de gel (Figura 2A). Libertação de glicano é conseguida por eliminação redutiva β-em-gel (Figura 2B) e os glicanos libertados são permetilado. Aquoso-orgânico de extracção seguinte permetilação quantitativamente particiona os aniónicos sulfatados glicanos longe de glicanos neutros não-sulfatados (Figura 2C). Em gel de redutiva-β-eliminação acoplado a extracção aquosa-orgânica permite a caracterização e de glicanos ligados em O sulfoglycans libertados a partir de pequenas quantidades de glicoproteína separadas por SDS-PAGE. A visão estratégica é summarized na Figura 1 e os detalhes estão apresentados na Figura 2. Além disso, uma porção dos pedaços de gel descorado e lavados pode ser utilizada para identificação da proteína por técnicas de proteómica LC-MS / MS padrão.