Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Resumo

A fim de explorar de forma abrangente a diversidade de glicanos ligados a O, um novo procedimento para eliminação de β redutora em gel, combinado com permetilação e um método de partição rápida de fase, é aplicado à análise de glicanos ligados a O diretamente liberados de glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE e passíveis de análise glicômica subsequente por espectrometria de massa.

Resumo

A separação de proteínas por SDS-PAGE seguida pela digestão proteolítica em gel de bandas de proteínas resolvidas produziu análise proteômica de alta resolução de amostras biológicas. Abordagens semelhantes, que permitiriam uma análise aprofundada dos glicanos transportados por glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE, requerem considerações especiais para maximizar a recuperação e a sensibilidade ao usar a espectrometria de massa (MS) como método de detecção. Um grande obstáculo a ser superado na obtenção de dados de alta qualidade é a remoção de contaminantes derivados de gel que interferem na análise de EM. O fluxo de trabalho da amostra apresentado aqui é robusto, eficiente e elimina a necessidade de limpeza de HPLC em linha antes da EM. Pedaços de gel contendo proteínas-alvo são lavados em acetonitrila, água e acetato de etila para remover contaminantes, incluindo fragmentos de acrilamida polimérica. Os glicanos ligados ao O são liberados das proteínas-alvo por eliminação de β redutora no gel e recuperados por meio de procedimentos de limpeza robustos e simples. Uma vantagem desse fluxo de trabalho é que ele melhora a sensibilidade para detectar e caracterizar glicanos sulfatados. Esses procedimentos produzem uma separação eficiente de glicanos permetilados sulfatados de glicanos permetilados não sulfatados (sialilados e neutros) por uma rápida partição de fase antes da análise de MS e, assim, aprimoram as análises glicômicas e sulfoglycomic de glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE.

Introdução

A glicosilação é uma modificação essencial de proteínas pós-tradução, contribuindo para a fisiologia do organismo, a patologia do tecido, e reconhecimento celular ^1-3. Apesar dos grandes avanços na glycoscience analítica, caracterizando a diversidade completa de glicanos em uma proteína específica continua a ser uma tarefa extremamente desafiadora, especialmente em proteínas isoladas de fontes biológicas primárias. No entanto, o microheterogeneidade de glicanos glicoproteína freqüentemente afeta as interações funcionais com outras proteínas. Portanto, a caracterização da diversidade de glicano é essencial para compreender o significado fisiológico de ^....

Protocolo

NOTA: Preocupações de segurança de laboratório

Em consonância com as melhores práticas de laboratório padrão, observe o seguinte. Guarde todos os solventes orgânicos em locais apropriados. Mantenha todos os materiais de resíduos em contentores de resíduos químicos com uma rotulagem clara de composições químicas. Como vários reagentes utilizados nestes protocolos são potenciais agentes cancerígenos ou gerar gases combustíveis voláteis, lidar com todos os reagentes em um exaustor com ventilação. Use equipamento de proteção individual, como luvas, jaleco e proteção para os olhos quando se trabalha com solventes orgânicos.

Resultados

Efeito de acetato de etilo Tratamento Antes de Na-gel redutiva β-Eliminação

Um espectro de massa representativo do permetilado amostras de glicano ligadas em O libertados de bovino usando mucina redutiva β-eliminação no-gel é mostrado na Figura 3. A lavagem de EtOAc dos pedaços de gel de SDS e remove eficazmente poliacrílicos contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS ^27.

Discussão

A combinação da eliminação de β redutora em gel com a extração orgânico-aquosa aumenta a sensibilidade e a profundidade dos dados estruturais que podem ser adquiridos para caracterizar glicanos ligados a O sulfatados e não sulfatados colhidos de pequenas quantidades de glicoproteínas do tipo mucina resolvidas de outras proteínas por SDS-PAGE. Os avanços essenciais das abordagens técnicas apresentadas neste estudo são: (a) remoção fácil de contaminantes derivados de gel por etapas simples de lavagem; b) Recuperação quanti.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Água, água deionizada	Sigma-Aldrich	270733-4L	CHROMASOLV, para HPLC
Ácido acético, Glacial	Fisher	A38-500	Certificado ACS ≥ 99,7% p/p
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-4L-R	CHROMASOLV, para HPLC, ≥ 99,9%
Bicarbonato de amônio	Fluka	09830-500G	BioUltra, ≥ 99,5% (T), Etapa 1
Acetonitrila	Sigma-Aldrich	34998-4L	CHROMASOLV Plus, para HPLC, ≥ 99,9%, Etapa 1
Acetato de etila	Fluka	34972-1L-R	LC-MS CHROMASOLV, Etapa 1
Borohidreto de sódio	Aldrich	213462-25G	ReagentPlus, 99%, Etapa 2
Iodometano	Sigma-Aldrich	289566-100G	ReagentPlus, 99,5%,  Passo 6.  Armazene a 4 ° C até o uso.  Sente-se em temperatura ambiente antes de usar.
Solução de hidróxido de sódio, 50% p/p	Certificado Fisher	SS254-1	, Etapa 6
Dimetil sulfóxido, anidro	Sigma-Aldrich	276855-1L	Anidro, ≥ 99,9%, Etapa 6
Metanol, anidro	Sigma-Aldrich	322415-100ML	Anidro, 99,8%, Etapa 6
Diclorometano	Sigma-Aldrich	34856-4L	CHROMASOL®, para HPLC, ≥ 99,8%, contém amileno como estabilizador, Etapa 7
Forma de hidrogênio Dowex 50WX8 forma de hidrogênio 100-200  malha	Sigma-Aldrich	217506-500G	Step 3
AG 50W-X8 Resina	Bio-Rad	142-1441	Passo 3
BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Coluna de Extração em Fase Sólida, PP, Octadecil (C18) Fase Reversa	JT Baker	JT-7020-01	Passo 5 e 8
7.5% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado	Bio-Rad		Passo 1
Bio-Safe Coomassie Stain	Bio-Rad	161-0786	G-250, Kit de
Coloração de Prata Passo 1 para Espectrometria de Massa	Pierce	24600	Kit
Oligossacarídeos Etapa 1 (Maltotriose, Dp3: R474140)	Supelco	47265
Kit de Oligossacarídeos (Maltotetraose, Dp4: R474135)	Supelco	47265
Pipetas Pasteur Descartáveis, Vidro, Ponta Curta	VWR	14673-010	Lavar antes de usar
PYREX 13 x 100 mm Tubos de Cultura Roscados de Fundo Redondo Descartáveis	Corning	99447-13	Lavar antes de usar
PYREX 16 x 125 mm Tubos de Cultura Roscados de Fundo Redondo Descartáveis	Corning	99447-16	Lavar antes
de usar Tampas/Fechos Fenólicos com Revestimento de Borracha Revestido com PTFE	Kimble	45066C-13	Lave antes de usar
Tampas/Fechos Fenólicos com Revestimento de Borracha Revestido com PTFE	Kimble	45066C-15	Lave antes de usar
Seringa Hamilton HPLC	HAMILTON	81265	volume 500  μ l, tamanho da agulha 22 G
Seringa HPLC Hamilton		HAMILTON 81165	volume 250  μ l, tamanho da agulha 22 G
Seringa HPLC Hamilton		HAMILTON 81065	volume 100  μ l, tamanho da agulha 22s G
Seringa Hamilton HPLC	HAMILTON	80965	volume 50  μ l, tamanho da agulha 22s G
Seringas Calibradas Hamilton	HAMILTON	80300	volume 10  μ l, tamanho da agulha 26s G
Placa de Petri Vidro 100 mm x 15mm	GSC INTERNATIONAL INC	1500-4	Lave antes de usar, Etapa 1
Lâminas Cirúrgicas Bard-Parker	Fisher	371310	Etapa 1
Módulo de Aquecimento/Agitação Reacti-Therm	Pierce	18870	Etapa 1, 4 e 7
Blocos de Aquecimento	Fisher	125D	Etapa 2
Pyrex fibra de vidro borosilicato tamanho dos poros 8  μ m	Aldrich	CLS3950	Step 3 Cortador
de Sílica FundidaCortador de tubos	alltech	3194	Step 3
Multi-tube vortexers	VWR	444-7063	Etapa 6
Liofilizador 25EL Freezemobile	Virtis	25EL
Centrífuga	VWR	Clinical 50
LTQ Orbitrap Discovery	Thermo Fisher Scientific