Artigo de método

Combinando Sorting magnética de células mãe e testes de flutuação para Analisar Genoma Instabilidade Durante Mitotic envelhecimento celular em Saccharomyces cerevisiae

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DOI:

10.3791/51850

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16 de outubro de 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute

Neste artigo

Resumo

As taxas de mutação em células de Saccharomyces cerevisiae jovens medidos por meio de testes de flutuação são usados ​​para prever frequências de mutação para células-mãe de diferentes idades replicadoras. Separação magnética e citometria de fluxo são usados ​​para medir freqüências de mutação reais e idade das células-mãe para identificar eventuais desvios de freqüências de mutação previstos.

Resumo

Saccharomyces cerevisiae tem sido um excelente sistema modelo para estudar mecanismos e consequências da instabilidade do genoma. As informações obtidas a partir deste modelo de levedura é relevante para muitos organismos, incluindo os seres humanos, uma vez que fatores de reparo de DNA e resposta a danos do DNA são bem conservada entre espécies diversas. No entanto, S. cerevisiae ainda não foi usado para resolver completamente se a taxa de acumulação de mutações alterações com o aumento da replicação (mitose) idade devido a limitações técnicas. Por exemplo, as medidas de levedura vida replicativo através de micromanipulação envolvem populações muito pequenas de células, que proíbem a detecção de mutações raras. Métodos genéticos para enriquecer de células-mãe em populações de induzir a morte de células-filhas têm sido desenvolvidos, mas os tamanhos das populações ainda são limitados pela frequência com que mutações aleatórias que comprometem os sistemas de seleção ocorrer. O protocolo atual aproveita sorti magnéticang de células mãe de levedura rotulada de superfície para obter grandes populações suficientes de envelhecimento de células-mãe para quantificar mutações raras através de seleções fenotípicas. As taxas de mutação, medidos por meio de testes de flutuação e frequências de mutação são, primeiro, para as células jovens e usado para prever a freqüência de mutações em células-mãe de várias idades replicadoras. Frequências de mutação são então determinados para células mãe ordenadas, e a idade das células-mãe é determinada por citometria de fluxo por coloração com um reagente fluorescente que detecta cicatrizes gemas formadas nas suas superfícies celulares durante a divisão celular. Comparação das frequências de mutação previstos com base no número de divisões celulares para as freqüências observados experimentalmente para células-mãe de uma determinada idade replicativo pode identificar se há mudanças relacionadas à idade na taxa de mutações que se acumulam. Variações deste protocolo básico de fornecer os meios para investigar a influência das alterações nas funções de genes específicos oucondições ambientais específicas sobre o acúmulo de mutação para abordar os mecanismos de instabilidade do genoma subjacente durante o envelhecimento replicativo.

Introdução

Os microrganismos, tais como a levedura Saccharomyces cerevisiae, são excelentes modelos para investigar as taxas de mutação, mas esses modelos não foram totalmente utilizados para investigar a acumulação de mutações durante o envelhecimento das células mitóticas. Acúmulo de mutação no genoma nuclear foi levantada a hipótese de contribuir para o envelhecimento por resultando em perda progressiva da (ou variação) das funções dos genes 1. A habilidade de usar um sistema microbiano para estudar os mecanismos e consequências da acumulação de mutações durante o envelhecimento pode acelerar consideravelmente a identificação de fatores genéticos e ambientais que influenciam este processo, por causa de sistemas genéticos fáceis ea facilidade de quantificar alterações fenotípicas raras em microorganismos. Fatores de reparo de DNA e proteínas de resposta de danos ao DNA estão bem conservados em diversas espécies 2 e semelhanças fundamentais no envelhecimento do organismo foram identificadas para organismos tão diversos como S. cerevisiae umd mamíferos 3, o que torna provável que os resultados obtidos a partir de estudos em levedura serão relevantes para o envelhecimento em muitos organismos.

Estudos de envelhecimento em S. cerevisiae fazer uso de dois modelos de envelhecimento que medem envelhecimento cronológico ou envelhecimento replicativo de células. Envelhecimento cronológico é caracterizada pela perda progressiva de viabilidade em populações de células de levedura, que estão num estado (fase estacionária) que não se dividem, devido ao esgotamento de nutrientes 3. O modelo de envelhecimento cronológico tem sido utilizado para demonstrar que acumulam mutações com o aumento da idade de 4 anos, uma vez que as populações de células grandes são facilmente obtidos neste modelo para executar selecções fenotípicos para células mutantes. Neste caso, a acumulação de mutação parece ser influenciada por vias de sinalização de crescimento e de stress oxidativo 5, e cada um destes factores é relevante para a compreensão do envelhecimento em eucariotas multicelulares 3. O modelo de envelhecimento replicativo explora o divisi assimétricaem entre S. mãe e filha células cerevisiae para a investigação de envelhecimento que ocorre com as sucessivas gerações de células 3. Levedura envelhecimento replicativo tem sido muitas vezes medido por meio de micromanipulação de pequenas populações de células mãe e filha, ou, mais recentemente, por meio de microscopia de vídeo de pequenas populações de células de levedura em dispositivos microfluídicos 6,7. Tamanhos populacionais limitados fazer essas abordagens pouco adequada para investigar o acúmulo de mutação durante o envelhecimento mitótico, a menos que a informação todo o genoma é obtido a partir de células individuais ou mudanças genéticas muito alta freqüência são medidos 8. Whole-seqüenciamento do genoma de células individuais fornece conjuntos de dados substanciais para a investigação de acúmulo de mutação, mas os sistemas de seleção fenotípica tem a importante vantagem de fornecer um meio de medir as taxas de mutação para estudar mecanismos de acumulação mutação subjacente. Estudos para analisar freqüências de mutação e taxas através de seleções fenotípicas em haploid cepas de leveduras durante o envelhecimento replicativo ainda não foram relatados.

As taxas de mutação são comumente medido por meio de testes de flutuação 9. Os valores de frequência de mutação reflecte o número total de células contendo uma mutação na sequência de um gene de uma população. Isto inclui as células nas quais ocorrem as mutações independentes e toda a descendência destas células que simplesmente herdam as mutações pré-existentes. Em contraste, as taxas de mutação medidos por meio de testes de flutuação representam o número de mutações independentes que recentemente surgem a cada geração celular. Esses testes envolvem tipicamente a inoculação de culturas em replicado em muitos densidades celulares baixas para reduzir a probabilidade da adição de células com mutações pré-existentes em uma sequência alvo, crescendo as culturas a próxima da saturação, e a identificação de células mutantes por crescimento em meio selectivo. Os números de células mutantes identificados nas populações replicados são então utilizados em um dos diversos modelos matemáticos para estimar o número de imutações ndependent que surgiram durante crescimento de 9. Comparando o número de mutações independentes para o tamanho médio da população dá uma medida da taxa de mutação. Em S. cerevisiae, freqüências de mutação e as taxas são freqüentemente medidos utilizando os genes URA3 e CAN 1, já que a perda de função mutações nestes genes produzem fenótipos selecionáveis. A perda da função URA3 torna as células resistentes a 5-fluoroor�ico ácido (5-FOA), uma vez que a proteína codificada pelo gene URA3 converte 5-FOA em uma molécula tóxica 10. A perda da função de CAN1 permite que as células se tornam resistentes à canavanina, um análogo da arginina tóxico, uma vez que a proteína codificada pelo CAN1 transporta arginina e canavanina em células 11.

Ambas as estratégias de ordenação genéticos e físicos têm sido empregados com sucesso para obter maiores populações de S. células-mãe cerevisiae para facilitar as investigações do envelhecimento replicativo. Estratégias genéticas incluem abordagens inteligentes que selecionam contra a sobrevivência da célula filha em uma população. O programa de enriquecimento de mãe (MEP) envolve a indução de beta-estradiol de Cre recombinase expressão apenas em células-filhas, levando à interrupção específica e filha de dois genes essenciais que foram projetados para conter sítios loxP 12. Estirpes MEP podem ser cultivadas normalmente na ausência do indutor, mas apenas as células mãe continuarão a dividir após a indução, enquanto que as células filhas vai prender no M-fase, tipicamente, durante a sua primeira progressão através do ciclo celular 12. Embora este sistema não tem sido amplamente utilizada para estudar a acumulação de mutação durante o envelhecimento, ele tem sido utilizado para estudar a perda de heterozigosidade, uma forma relativamente frequente de instabilidade do genoma em estirpes de levedura diplóide, bem como as alterações bioquímicas nas células mãe envelhecimento 13,14. Da mesma forma, o sistema de pára-raios-filha envolve a expressão específica de filha de S. cerevigene SIAE URA3 15. Cepas Filha-de pára-raios crescem normalmente até 5-FOA é adicionado ao meio, no qual as células ponto filha expressando URA3 vai morrer, enquanto as células-mãe continuam a crescer 15. São sistemas úteis para enriquecer de células-mãe, mas eles dependem de manutenção das funções dos genes que constituem o sistema de seleção. Mutações aleatórias em um ou mais componentes do sistema de seleção pode resultar em células-filhas que escapam a seleção e proliferam de forma exponencial. Durante o desenvolvimento das cepas MEP, os tamanhos das populações adequadas estavam determinados a evitar o aparecimento de células filhas mutantes que poderia escapar a seleção de 12. No entanto, este limite no tamanho da população compromete a detecção de formas raras de instabilidade do genoma durante o envelhecimento replicativo. Esta restrição no tamanho da população pode ser parcialmente superado usando cepas de leveduras diplóides com duas cópias de cada gene contribui para o sistema de seleção, já que a maioriamutações provavelmente seria recessivo 12. No entanto, o uso de estirpes diplóides constrange os tipos de eventos mutacionais que pode ser facilmente detectado em comparação com aquelas que podem ser facilmente detectado em células de levedura haplóides.

Estratégias de ordenação físicos incluem o isolamento de células-mãe com uma superfície de células marcadas a partir de células-filhas não marcados para enriquecer para grandes populações de células-mãe. A observação de que as proteínas da superfície da célula (proteínas da parede celular) de S. cerevisiae são células filhas recém-sintetizada durante a floração foi explorada para marcar as células mãe sem marcação das células filhas que produzem 16. Por exemplo, uma população inicial de células de levedura marcadas na sua superfície com biotina podem ser cultivadas e, em seguida, isolados das suas células filhas utilizando microesferas anti-biotina e de triagem magnética 16, porque as células filhas gerados pela população inicial não contêm biotina sobre a sua superfície . Crescimento de série eordenação possibilita populações progressivamente mais antigas de células-mãe a serem obtidos e analisados. Este procedimento tem sido utilizado com sucesso para examinar as mudanças na fisiologia celular e expressão gênica durante o envelhecimento replicativo de fermento 13,14,17,18. O actual método se adapta esta rotulagem biotina e técnica de triagem magnética para enriquecer células-mãe com a finalidade de medir o acúmulo de mutações potencialmente raros ou outras formas de instabilidade do genoma ensaiadas pelas seleções fenotípicas. Crescimento de série e rearranjo físico permitir a análise da acumulação de mutações em células mãe progressivamente mais velhos, bem como em suas populações de células-filhas. Determinação das taxas de mutação por geração permite uma freqüência de mutação previsto para ser calculado para células-mãe que tenham sido submetidos a um determinado número de divisões celulares. Como os valores de frequência previstos são baseados no aumento esperado devido a rodadas adicionais de divisão celular, desvios substanciais nos Mutati observadosem frequências em comparação com os valores previstos fornecem evidências de mudanças específicas por idade na taxa de mutações que se acumulam. Usando este protocolo, coloração fluorescente de cicatrizes broto que correspondem a locais de divisões celulares em células-mãe, juntamente com a análise por citometria de fluxo pode ser usado para determinar rapidamente a distribuição etária da população ordenados e não ordenados. Os reagentes fluorescentes adicionais, tais como os utilizados para a detecção de espécies reactivas de oxigénio, podem também ser utilizados durante este protocolo. No geral, este protocolo permite a análise eficiente de alterações dependentes da idade em instabilidade do genoma com o potencial de correlação para celulares alterações fisiológicas relacionadas à idade em um organismo modelo bem adequado para estudar os fatores genéticos e ambientais que influenciam a instabilidade do genoma relacionadas com o envelhecimento.

Protocolo

1 Preparação de Mídia e Soluções

  1. Cultivar células utilizando extrato de levedura-peptona-glucose (YPD) meio rico para o protocolo padrão. Prepara-se uma de bacto-peptona 2%, 1% de extracto de levedura, 2% de solução de glucose para meio YPD e adicionar 2% de bacto-agar para meio sólido 19. Autoclave para esterilizar. Utilizar um meio alternativo, se necessário, para testar uma condição particular de crescimento ou estirpe mutante de levedura.
  2. Faça médio completo sintético sólido falta arginina com 60 mg / L canavanina (SC-arg + canavanina) para selecionar para mutantes resistentes canavanina. Prepara-se uma solução que é 0,67% de bacto-levedura base de azoto sem aminoácidos, 2% de glucose, 0,2% de mistura de suplemento completo sem arginina (mistura deleção), e 2% de bacto-agar 19. Autoclave e arrefecer antes de se adicionar canavanina de uma solução de estoque de 20 mg / ml (filtro-esterilizado, armazenada a 4 ° C) 19.
    1. Adicione meio completo sintético sólido contendo ácido 5-fluoroor�ico (5-FOA). Prepare 500ml de uma solução que é 1,34% de bacto-levedura base de azoto sem aminoácidos, 4% de glucose, 0,4% de suplemento de mistura completa, e 0,2% de 5-FOA e esterilizar-filtro 19. Autoclave a 500 ml de uma solução de bacto-agar de 4%, brevemente fresco e, em seguida misturar com a solução nutritiva esterilizada por filtração de 500 ml. Use a mídia alternativa apropriada para outros ensaios de mutação.
  3. Para a marcação de biotina, fazer 500 ml de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 137 mM de cloreto de sódio, cloreto de potássio 2,7 mM, 10,14 mM de fosfato de sódio dibásico, e 1,77 mM de fosfato dibásico de potássio, pH 8 Armazenar a 4 ° C e em manter gelo durante o uso.
  4. Faça um novo estoque biotina 5 mM em estéril, água ultrapura.
  5. Para saciar a rotulagem biotina, fazer 500 ml de 1x PBS, 100 mM de glicina. Armazenar a 4 ° C e manter em gelo durante o uso.
  6. Dependendo do número de células utilizadas e a duração da experiência, fazer 1-2 L de tampão de rotulagem talão contendo 1x PBS, EDTA 2 mM, 0,5% bovialbumina sérica ne. Filtro de esterilizar e tampão de-gás. Armazenar a 4 ° C e manter em gelo durante o uso.
  7. Prepara-se uma solução de 0,4% de azul de tripano em 1x PBS, filtro de esterilizar, e armazenamento à temperatura ambiente para utilização na medição da viabilidade celular.
  8. Alíquotas pequenas volumes (~ 100 ul) de uma aglutinina de gérmen de trigo (WGA) conjugado fluorescente para armazenar a -20 ° C em folha enrolado (ou opacas) tubos de microcentrífuga para utilização na determinação da idade das células.

2 Determinação da taxa de mutação e Freqüência

  1. Estabelecer uma taxa de mutação de base por geração de células por meio de testes de flutuação para as células cultivadas em condições de cultura padrão. Grow sete a onze replicar 1 ml de uma cultura inicial de densidade 1,000-5,000 células / ml de fase estacionária precoce (~ 10 8 células / ml).
    1. Para cada cultura replicar, diluir as células 1: 2000 e espalhou 1-4 uL em meio não selectivo (YPD) determinar--unidades formadoras de colónias / ml. Pellet restantes células em ~ 2.400 xg durante 1 min numa microcentrífuga e ressuspender em 100 mL de água para se espalhar para o meio selectivo para identificar mutantes. Incubar as placas durante três dias a 30 ° C antes da contagem de colónias (ajustar o tempo de incubação conforme necessário com base na taxa de crescimento de células).
    2. Determinar o número de mutações independentes (m) que ocorreram no estudo com base no número de colónias mutantes (r) obtidos em meio selectivo. Use o estimador mediana Lea-Coulson para encontrar m substituindo o número médio de colónias mutantes para r na fórmula abaixo de 9. Em seguida, substitui os valores para m até que o lado esquerdo da equação é virtualmente zero.
      figure-protocol-1
    3. Para determinar a taxa de mutação, em primeiro lugar calcular a média do número de células viáveis, distribuídos para o meio selectivo por multiplicação da média--unidades formadoras de colónias / ml das culturas réplica e o volumeda cultura na propagação ml para o meio selectivo. Dividir o valor m do passo 2.1.2 por este número médio de células viáveis ​​para se obter a taxa de mutação, por geração celular.
  2. Individualmente calcular o número de células viáveis, distribuídos para o meio selectivo para cada cultura de replicação de um ensaio tal como descrito no passo 2.1.3. Dividir o número de colónias mutantes (r) obtidos por cultura de um ao número de células viáveis, distribuídos para o meio selectivo para obter a frequência de mutação. Use a média ou a mediana das frequências de mutação individuais das culturas réplica na etapa 2.1 como uma freqüência de mutações de base.
  3. Faça medições de frequência antes e depois de células de rotulagem biotina (passos 3.2 e 3.4) para determinar se os resultados da etapa de rotulagem em qualquer alteração na frequência de mutações que precisam ser considerados ao testar para mudanças específicas por idade no acúmulo de mutação.

3. Biotina Labeling

  1. Streak S. cerevisiae a partir de um stock de glicerol a -80 ° C em meio YPD e incubar a 30 ° C durante 1-3 dias.
  2. Usando uma pipeta estéril, as células de transferência da placa raia de 1 ml (ou mais) de manutenção de água em mente que 1-1,5 cm de uma parte densamente cultivadas da raia vai dar aproximadamente 10 8 células. Determinar a densidade celular exacta usando um hemocitómetro.
  3. Rotular 10 8 células por estirpe (ou condição de tratamento) por ponto de coleta em que a freqüência de mutações será determinada ou um tamanho de população suficiente para obter pelo menos 5-10 colónias mutantes por amostragem em meio seletivo (com base na freqüência de mutação do passo 2.2). Incluir um adicional de 10 8 células para quantificações por tensão / condição.
  4. Marcador de biotina de acordo com o procedimento padrão a partir do fabricante, excepto o uso de um reagente de biotina estoque 5 mM e agitar suavemente durante a incubação. Rotação por 5 min a 4 ° C a 3000 xg durante todos os passos de centrifugação, sesde girando a temperaturas superiores a 4 ° C pode levar ao aumento da perda de células. Após a lavagem final, suspender as células a uma concentração de 10 8 marcadas células / ml em água.
  5. Verificar a viabilidade das células utilizando uma coloração com azul de tripano. Dilui-se 10 ul de células com 23 ul de água e 67 ul de 0,4% de azul de tripano em PBS 1x. Incubar durante pelo menos 40 minutos à temperatura ambiente antes de marcar células vivas (não coradas) e mortos (manchadas) utilizando um hemocitômetro.
  6. Meça os valores de base para a instabilidade do genoma, idade celular, e outras características relevantes (ver secções 5, 6 e 7).
  7. Transferir as células marcadas com biotina para 20 ml de meio YPD 10 por 8 células em um balão de Erlenmeyer (cerca de 5 x 10 6 células / ml). Crescer a cultura (s) de 16-18 horas a 20 ° C para uma densidade aproximada de 10 células / ml 8 (4-5 gerações de células), mas não permitem que as células para alcançar a fase estacionária. Usar um tempo de incubação mais curto para o crescimento a 30 ° C. Mantenha marcada com biotina cells, a 4 ° C durante várias horas antes da adição ao meio, se necessário, para optimizar o tempo do período de crescimento e colheita.

4 Bead Rotulagem e classificação Magnetic

  1. Após a fase de crescimento, dilui-se uma alíquota de cultura para determinar a densidade de células utilizando um hemocitómetro. Células por centrifugação durante 5 min a 4 ° C a 3.000 x g. Decantar o sobrenadante.
  2. Lave as células em vortex para suspender o pellet em 30 ml de tampão de rotulagem talão, em seguida, centrifugar e decantar o sobrenadante como na seção 4.1. Repita lavagem.
  3. Totalmente células ressuspender em tampão rotulagem talão 50 ul por 10 8 células totais em vórtice. Adicionar 2 mL esferas magnéticas por 10 8 total de células e do vortex brevemente para misturar. Incubar em gelo por 10 min, invertendo periodicamente para misturar (modificado a partir de um protocolo on-line em http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
  4. Lave as células três vezes com 30 ml de tampão de rotulagem talão.
  5. Adicionar 0,5 ml de tampão de rotulagem talão por 10 8 células totais e brevemente vortex pellet em configuração média apenas até que as células são suspensas. Derrame através de um filtro de células 40 um para um tubo de 50 mL para remover quaisquer aglomerados de células restantes. Se necessário, deixar as células em gelo durante 1-2 horas antes do carregamento na coluna.
  6. Siga o protocolo recomendado pelo fabricante para as colunas magnéticas para ligar, lavar, e eluir as células mãe com rótulo de contas magnéticas. Para aumentar a recuperação de células marcadas, utilizar, pelo menos, uma coluna por 2 x 10 9 células totais.
    1. Remova todas as bolhas que ocorrem durante o carregamento de colunas, como eles vão bloquear o fluxo. Remover e substituir a coluna no separador entre lavagens para evitar que as células fiquem presos entre as esferas (modificado a partir de um protocolo on-line em http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
    2. Salvo fluir através de ligação e de lavagem passos para analisar células jovens produzidos pelas células-mãe, se desejado. Concentra-se as células tal como descrito no passo 4.7.
    3. Utilize separadores várias colunas para o processamento de várias amostras ao mesmo tempo. Eluir várias colunas da mesma amostra no mesmo tubo de recolha para reduzir o tempo de manipulação e reduzir a perda de células.
  7. Concentra-se as células mãe eluídas por centrifugação a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar todo mas 1 ml de tampão por 10 8 células marcadas com biotina originais. Vortex brevemente a suspender as células em tampão restante.
  8. Dilui-se uma alíquota de células e corar com azul de tripano para determinar a densidade das células e a viabilidade das células utilizando um hemocitómetro (ver passo 3.5). Calcula-se o número total de células recuperado.
    1. Se o número de células é substancialmente maior do que o esperado, fazer passar a amostra de eluição através de uma outra coluna para tentar remover a contaminação de células jovens.Se o número de células é substancialmente menor do que o esperado, passar o fluxo salvos, mediante a amostra através de outra coluna para tentar melhorar o rendimento das células-mãe.
  9. Use células para análises posteriores, conforme descrito nas seções 5 e 6 Alternativamente, as células crescem em caldo YPD de novo para aumentar sua idade replicativo (passo 3.7) e siga pela rotulagem talão e triagem (passos 4.1-4.8.1), sem a necessário repetir a rotulagem biotina.

5 Determinação da Idade replicativa

  1. Gire as células durante 2 min a 5000 xg à temperatura ambiente para todas as etapas nesta seção. Colocar 25 mL de células recuperadas (8 ~ 10 células / ml) para um tubo de centrífuga de 1,5 ml e lava-se duas vezes com 1 ml de PBS 1x. Aspirar o sobrenadante.
    1. Descongelar uma alíquota de WGA-conjugado, vortex para misturar, e girar rapidamente para eliminar os agregados de proteína. Suspender as células em 180 ul de 1x PBS e 20 ul de WGA conjugados com uma molécula fluorescente para rotular bud cicatrizes na superfície de thcélulas e. Cobrir o tubo de centrífuga de 1,5 ml, com tiras e incubar com agitação suave a 30 ° C durante 30 min.
    2. Lavar três vezes com 1 ml de PBS 1X.
  2. Para a microscopia de fluorescência, as lâminas de rótulo e montar o protocolo habitual utilizando um agente anti-desbotamento. Totalmente curar lâminas no escuro (até poucos dias) antes de lamela de vedação para evitar o movimento celular durante o exame. Contagem de cicatrizes broto em pelo menos 50 células por amostra para obter uma medida representativa da idade da célula. Armazenar os slides para até um mês para ver broto cicatrizes, se necessário.
    1. Alternativamente, a determinação da intensidade do sinal fluorescente a partir do conjugado de WGA-efectuando citometria de fluxo em células em suspensão em 1 ml de 1x PBS após o passo 5.1.2. Use um laser de excitação 405 nm e 530/30 nm filtro de emissão com um filtro de passe longo de 505 nm para WGA-Alexa 488 Incluir um controle sem mácula para cada ponto de coleta.
  3. Gráfico bud cicatrizes em células jovens e células envelhecidas contados por microscopia noeixo Y contra a média geométrica normalizada (média geométrica corados / não corados média geométrica) da fluorescência WGA-conjugado do as mesmas populações de células no eixo-x. Obter a equação de uma linha de tendência linear para este relacionamento. Para as experiências ulteriores, substituir o meio geométrico normalizado de WGA-conjugado de intensidade de fluorescência de uma população de células por x na equação para resolver e y para determinar a idade média de células de uma amostra.

6. Mutação Frequency

  1. Espalhe classificados células mãe ressuspensas em tampão do passo 4.7 em meio YPD e meio selectivo, como descrito no passo 2.1.1. Use de 1 ml de células mãe para as células ressuspensas médias e rotação selectiva em 5.000 xg durante 1 min.
    NOTA: Espalhe volumes maiores de células diluídas em meio de YPD como células aumentam de idade para compensar o aumento do número de células não viáveis ​​e senescentes em populações idosas.
    1. Incubar meio YPD e placas de meio selectivoo passo 6.1, a 30 ° C durante 3 a 4 dias, respectivamente. Aumentar tempo de incubação até uma semana para as células muito antigas ou estirpes de crescimento lento. Calcular a frequência de mutação, tal como descrito na etapa 2.2.

7 Cálculo Prevista Mutação de frequência para um replicativa Idade Dado

  1. Calcula-se o aumento médio na idade replicativa das células marcadas com biotina ao longo do experimento, subtraindo a média de idade da população inicial de células a partir da idade média das células-mãe ordenados para o tipo relevante. Use as idades de células calculadas no passo 5.2 ou o passo 5.2.2.
  2. Multiplicar a taxa de mutação obtido no passo 2.1.3 pelo aumento da idade média das células calculadas no passo 7.1. Adicionar este valor para a frequência de mutação de linha de base para a população inicial calculada no passo 2.2 para determinar a frequência de mutação previstas para as células da idade replicativo relevante.

Resultados

Um diagrama de fluxo da Figura 1 mostra os passos gerais do processo, incluindo os pontos em que as taxas de mutação, as frequências, e a idade das células são medidos. Com precisão determinar a frequência e taxa de mutações (ou outra forma de instabilidade do genoma) em populações de células jovens é um primeiro passo importante, uma vez que é necessário para escolher um tamanho de população adequada para a rotulagem e classificação magnética. Os valores de taxa pode ser estabelecida por meio de testes de flutuação 9. Exemplos de resultados para as amostras de levedura no fundo genético BY4741 20 seleccionado de mutações no gene que confere resistência CAN1 canavanina ou mutações no gene URA3, que confere resistência ao 5-FOA são mostrados na Figura 2. Células foram cultivadas a 20 ° C durante representante experiências de taxa, e a 20 ° C e 30 ° C para as experiências de frequência representativos. Estas temperaturas foram usadas porque as populações de células cultivadas iniciaisa 30 ° C foram então cultivadas a 20 ° C para as experiências subsequentes de triagem representativos. Os valores de taxa de ensaios independentes foram comparáveis ​​para a população de células inicial e células após marcação biotina para uma cepa que tem o gene CAN1 a sua localização normal, no cromossoma V, cerca de 32 pares kilobase do braço esquerdo do telômero ( www.yeastgenome.com ) ( Figura 2A, colunas de lavanda). A taxa de mutação de CAN1 foi substancialmente mais elevada em populações iniciais de uma segunda estirpe de levedura que apresenta uma deleção do gene CAN1 a partir da sua localização normal, no cromossoma V e uma inserção de CAN1 no braço direito do cromossoma VIII, aproximadamente, 25 pares de quilobases do telómero 21 (Figura 2B). frequências de mutação gene CAN1 também foram comparáveis ​​para as populações de células iniciais e células marcados com biotina em qualquer temperatura de crescimento (Fi2A figura, colunas azuis). No entanto, as frequências de mutação obtida a 20 ° C revelaram-se mais elevada do que as frequências de mutação a 30 ° C. Para testar se o efeito da temperatura foi limitada ao gene CAN1, medimos as mutações no gene URA3 por selecção de resistência ao 5-FOA usando a estirpe de levedura que tem CAN1 inserido no cromossoma VIII. Esta estirpe também tem uma deleção de URA3 a partir do seu local normal de no cromossoma V e uma inserção do gene URA3 no braço direito do cromossoma VIII, cerca de 40 pares de quilobases do telómero 21. Frequências de mutação eram também superiores a 20 ° C durante URA3 neste local cromossómico (Figura 2C). No geral, isso demonstra que o crescimento da temperatura podem afetar a freqüência de mutações, mas rotulagem biotina parece não afetar a freqüência de mutações. Portanto, as taxas de mutação e frequências para as populações iniciais precisam ser determinados ao mesmo tempe crescimentotura que será utilizado para rondas de crescimento e de triagem. É aconselhável verificar se a rotulagem biotina não influencia a instabilidade do genoma antes de usar o protocolo para investigar outros tipos de mutações ou rearranjos genômicos.

Como esperado, os valores da taxa de mutação mostrados na Figura 2A são várias vezes mais baixa do que as medições de frequência correspondentes. Esta diferença ocorre porque a taxa de mutação mede o aparecimento de células com novas mutações com cada ciclo de divisão celular, enquanto que as medidas de frequências de mutação cumulativa do número de células mutantes na população no final do período de crescimento. As taxas e os intervalos de confiança de 95% para estes ensaios mostram que boa reprodutibilidade dos resultados pode ser obtido através de sete culturas réplica por julgamento, que é o número mínimo de repetições sugerida para este protocolo.

Uma vez que os valores de frequência e velocidade inicial são determinados, um tamanho da população deve ser chosen que garante que as células adequadas estão presentes após várias rodadas de triagem para determinar com fiabilidade frequências de mutação. Rotular uma população de 10 8 culas por ponto de tempo que é para ser analisado durante o envelhecimento é apropriado quando as frequências e as taxas são semelhantes aos mostrados na Figura 2A. Esta decisão também depende de quão eficientemente marcado células mãe são recuperados após cada rodada de classificação. A eficiência da recuperação de células mãe marcadas podem ser rapidamente e simplesmente avaliada utilizando um hemocitómetro para determinar o número de células eluídas a partir das colunas para cada tipo e para examinar a morfologia das células. Dois pontos principais são ilustradas pelos dados de eficiência exemplo de recuperação (Figura 3A): os números recuperados de células pode aparecer maior do que o esperado após a primeira espécie, e uma pequena perda progressiva de células é esperado com a classificação constante. Quanto maior do que o esperado número de células em algumas experiências, após o primeiro tipo poderiam result da rotulagem de botões em células da população inicial. Uma célula de levedura com um botão que normalmente podem ser classificadas como uma única célula, quando a determinação do número de células para etiquetar com biotina. Etiquetagem dos gomos presentes na população inicial, no entanto, seria permitir que as células que se desenvolvem a partir desses botões igualmente ser retida em colunas de triagem. A influência desta ocorrência na determinação da eficiência da recuperação depende da fracção de células enxertadas na população de células inicial. Uma segunda razão potencial para o número de células mais elevada após uma espécie é que tende a ser mais grandes células enxertadas neste ponto de tempo, que pode ser de completar a divisão celular, durante a triagem. Como resultado, grandes botões ainda ligadas às suas células-mãe pode ser resolvido, mas, em seguida, as células aparecem como distintas quando as células eluídas são analisados. Enquanto alguma perda de células é observada com cada ronda de crescimento e de triagem, o protocolo pode resultar na retenção fiável de 80-90% das células após cada ronda de sOrting. Vale a pena o esforço para a prática do processo para assegurar que 80% ou mais das células marcadas são isolados para evitar a necessidade de marcar uma população inicial de células desnecessariamente grande. O tratamento de células com um estresse leve, depois do primeiro tipo (1 mM de peróxido de hidrogênio em meio YPD por 30 min) não impediu a recuperação eficiente de células com continuação rodadas de crescimento e de triagem, embora houvesse alguma variabilidade na recuperação para a primeira espécie após a o stress (Figura 3A).

Inspeção da morfologia e viabilidade celular também são úteis tanto para a confirmação de isolamento de células-mãe e para ajustar as diluições / volumes utilizados ao espalhar as células em meio não selectivo para determinar a densidade de unidades formadoras de colônia. As células mãe se tornar cada vez maior e mais uma forma irregular com a idade, em comparação com as células filhas (Figura 3B). As amostras de células mãe deve, portanto, consistem principalmente de grande, irrcélulas egularly forma como a experiência progride através de cada rodada de classificação. A presença de muitas pequenas células ovais de forma regular pode indicar que as células-mãe não estão sendo adequadamente separados das células-filhas. Viabilidade das células-mãe também deve diminuir progressivamente a cada rodada de crescer e triagem, no entanto, pode não haver muita mudança durante os primeiros 5-10 gerações de células. O número de células capazes de colónias formando pode diminuir muito mais dramática do que o número de células que são determinados para serem viáveis ​​por alguma forma de marcação directa para a integridade celular, devido à formação de células senescentes. Quando a viabilidade de um método de coloração directa primeiro começa a diminuir (cerca de 80% ou menos), pode ser necessário ajustar as diluições e volumes utilizados para medir a densidade de unidades formadoras de colónias em antecipação a uma diminuição mais drástica na capacidade das células viáveis ​​para formam colônias (um de dois a vários diminuição vezes).

Aidades replicadoras das populações classificadas e as populações de controle precisam ser determinada antes que os dados de freqüência de mutação de células-mãe podem ser analisados ​​para mudanças específicas por idade na taxa de mutações que se acumulam. Isto pode ser conseguido por meio de contagem manual do broto cicatrizes em células-mãe (Figura 4) ou por meio de citometria de fluxo para quantificar o sinal para o reagente de detecção broto cicatriz (Figura 5). Bud cicatrizes podem ser marcados com o sinal de fundo relativamente baixa utilizando WGA-fluorescentes conjugados (Figura 4C). Figura 4A mostra que a maioria das células do fluxo por meio de amostras do processo de triagem tem zero ou um broto cicatriz. As células eluídas das colunas são em sua maioria células mãe idosa (Figuras 4B e 5). Tipicamente,> 90% das células são eluídas células mãe, o qual pode ser visto mais facilmente a partir do resultado de citometria de fluxo na Figura 5. Células com relativamente poucas cicatrizes broto (<6) obtained elevação depois de mais de duas rodadas de classificação pode representar células contaminantes que não foram marcados com biotina, que passou por algumas rodadas de divisão celular durante a rodada relevante de crescimento, ao contrário de células-mãe que se dividem muito lentamente. A variação na idade de células pode aumentar com ciclos subsequentes de triagem, se não todas as células da população está a crescer de forma uniforme.

Uma população de células maior pode ser usado mais rapidamente avaliar a idade das células se uma relação linear é estabelecida entre as intensidades de sinal de WGA-fluorescência e do número de cicatrizes bud por célula. Para esta análise, a normalização de todas as intensidades de sinal de WGA-fluorescência é realizado pela divisão do sinal de células coradas pelo sinal obtido para a população de células não coradas apropriado (filha ou mãe) para ter em conta o aumento da fluorescência de fundo nas células mais velhas. Figuras 4 e 5 mostra a análise das mesmas populações celulares representativas.Contagem manual estabelecido replicativas idades médias de 0,95 e 11,4 para a célula-filha (Figura 4A) e populações de células mãe (Figura 4B), respectivamente. Normalizados WGA-sinais para estas duas populações e as três populações adicionais (idade média de 3,0, 6,9 e 14,4) foram comparados com a média do número de broto cicatrizes para cada população (Figura 5B). Esta relação linear pode então ser utilizado com a mesma estirpe e reagentes em futuras experiências para determinar a idade média de células de WGA-sinal normalizado obtido por meio de citometria de fluxo, o que permite a identificação rápida e precisa de idade celular. A população de controle ainda deve ser incluída para verificar a eficiência de coloração semelhantes entre os ensaios.

A influência da idade sobre o acúmulo de mutações pode ser abordada uma vez que as etapas anteriores de obtenção de valores de taxa de mutação, de forma eficiente triagem células e determinar as idades celulares são realizadas. O number de pontos no tempo em que a frequência pode ser determinado depende do tamanho da população de células marcadas com biotina e o número de células que precisam de ser espalhadas no meio selectivo para obter resultados fiáveis. Se alterações na taxa de mutação com a idade, então as freqüências de mutações observada para o envelhecimento de células-mãe deve diferentes do esperado baseado unicamente em rodadas adicionais de divisão celular. Comparação da frequência de mutação observada a freqüência de mutação previu pode identificar diferenças relacionadas à idade na taxa de mutações que se acumulam. Como descrito no capítulo 7 do protocolo, a frequência prevista pode ser obtido a partir do produto da taxa de mutação de base para a população de células inicial e o aumento da idade de replicação das células-mãe adicionados à frequência de mutação para a população inicial. Aumentos na freqüência de mutação CAN1 foram observadas com o aumento da idade média de células em uma linhagem com CAN1 a sua localização normal, no cromossoma V(Figura 6A) e de uma estirpe com CAN1 no braço direito do cromossoma VIII (Figura 6B). Uma vez que as freqüências de mutação observada em células-mãe na Figura 6A são semelhantes ou um pouco abaixo das freqüências previstas, os dados não fornecem nenhuma evidência para uma mudança específica da idade na taxa de mutação. Em contraste, as freqüências de mutação para células-mãe da cepa com CAN1 no cromossomo VIII foram maiores do que as frequências previstas (Figura 6B). Note-se que as frequências previstas no gráfico, não parecem aumentar muito, porque uma escala logarítmica tinha de ser utilizada para o eixo y, devido ao grande aumento na frequência de mutação observada. Portanto, os resultados na Figura 6B fornecem evidências que suportam um aumento específico da idade na taxa de mutações que se acumulam. A diferença nos resultados para os conjuntos de dados na Figura 6A e 6B é provavelmente devido à dife aluguel de locais genômicas do CAN 1. Estes tipos de observações fornecem um ponto de partida para o desenvolvimento de hipóteses para estudar mecanismos que afetam as taxas de mutação como as células envelhecem e desenvolver modelos para explicar a acumulação mutação com a idade replicativo.

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Figura 1 Fluxograma do procedimento geral para examinar acumulação mutação durante levedura envelhecimento replicativo. Texto preto e setas indicam as principais etapas do procedimento. A seta curva reflete que rodadas adicionais de rebrota e ordenação das mesmas células são utilizados para obter células progressivamente mais velhos. Flechas e texto roxos indicam passos a que as medições estabelecidas são feitas. Freq - frequência.

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Figura 2 Determinação da frequência de mutação e taxa nas populações de células jovens. (A) as colónias mutantes foram seleccionados por espalhamento em células SC-arg + canavanina forma a seleccionar para a perda de função de mutações no gene CAN1 e em comparação com o número total de células viáveis ​​espalhadas em meio selectivo para calcular as taxas de frequências /. As células a partir de populações iniciais antes da marcação de biotina (IP) ou depois de biotina rotulagem (PB) foram cultivadas usando meio YPD a partir de uma densidade inicial de 5000 células / ml para próximo da saturação. Lavanda colunas indicam medições da taxa e colunas azuis representam medições de freqüência feitas a temperaturas indicadas (20 ° C e 30 ° C). Conjuntos de sete culturas réplica foram cultivadas por cada tentativa e 2-5 ensaios independentes foram realizados. Os valores de taxa individual calculada para testes independentes são mostradas, e barras de erro para estes ensaios representam intervalos de confiança de 95% determinard usando uma calculadora on-line 22. Freqüências representam médias e desvios-padrão. Taxas (B) mutação CAN1 obtido e representado como descrito por peça usando uma cepa com CAN1 no braço direito do cromossomo VIII. Freqüências A (C) Mutação obtidos após a seleção para colónias mutantes em 5-FOA usando uma estirpe com o gene URA3 localizado no braço direito do cromossoma VIII. Métodos não fosse como para a parte A, e as médias e desvios-padrão para três ou quatro ensaios independentes são mostrados.

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Figura 3 Exemplo de classificação da eficiência através do cálculo do número de células eluídas após cada ronda de triagem. (A) O número total de células em cada população de partida após a marcação de biotina foi ajustado para um, e o t otal número de células presentes nas amostras de fluido a partir de cada ronda de separação de células magnético foi dividido por estes valores iniciais para obter a fracção de células marcadas. Número total de células foram determinadas a partir das contagens de células obtidas utilizando um hemocitómetro. Colunas laranja representam a média eo desvio padrão para três ensaios independentes, seguindo o protocolo padrão. Colunas azuis representam a média e desvio padrão para dois ensaios independentes em que as células foram tratadas com 1 mM de peróxido de hidrogénio durante 30 minutos imediatamente após o primeiro tipo. (B) Dimensão e morfologia das células após a marcação de biotina (pós-biotina) e células-mãe recuperado após a terceira rodada de classificação magnética (SORT 3 células-mãe) mostrado usando microscopia de campo claro padrão e objetiva de 20x. Linhas brancas nas origens são as linhas que limitam os menores quadrados visíveis em um hemocitômetro padrão.k "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4 Determinação da idade replicativo utilizando o manual de contagem bud cicatriz. Microscopia confocal foi usado para contar as cicatrizes de gemas em células individuais marcados com um conjugado WGA-fluorescente (excitação a 488 nm e detecção com passa-banda 458/543 nm e 505 nm passe longo combinação de filtros). (A) Manual de broto cicatriz contagens de células do fluxo através (células-filhas), após a terceira rodada de classificação magnética (n = 62). (B) broto manual cicatriz contagens de células eluídas (células-mãe), após a terceira rodada de classificação magnética (n = 54). (C) Células mãe retidas após a terceira rodada de classificação magnética fotografada usando uma objectiva de imersão em óleo de 63X com 3X zoom após coloração sagacidadeha conjugado WGA-fluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5 Determinação de idade replicativo utilizando citometria de fluxo. Amostras de 10.000 células coradas com um conjugado de WGA-fluorescentes foram analisadas por citometria de fluxo, utilizando excitação a 488 nm e com um detecção de passagem de banda de 530/30 e 505 de comprimento conjunto de filtro passa. (A histogramas) representando o número de células com intensidades WGA-fluorescência específicos para uma população de células filha ou o fluido (células-mãe), após três rodadas de triagem magnética. Populações correspondem aos analisados ​​na Figura 4. Linhas verticais azuis indicam a posição correspondente à maioria da daucélulas ghter sobre o histograma de células mãe. (B) A média geométrica normalizado para o sinal de fluorescência de cada população mostrado em A e três populações de células adicionais (idade média de 3,0, 6,9 e 14,4) foi calculada como a razão da média geométrica da as células coradas e a média geométrica da população de células não coradas apropriado. Estes valores estão representados em comparação com o número médio de cicatrizes broto para cada população total (Figura 4 e dados não mostrados). O valor de R 2 para a linha de tendência desta comparação é dada no gráfico.

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Figura 6 Comparação entre freqüências de mutação previstos e observados durante o envelhecimento replicativo. Células com mutações no gene CAN1 foram selecionados como descrito para a Figura 2 usinestirpes g CAN1 com a sua localização normal, no cromossoma V (A) ou no braço direito do cromossoma VIII (B). As células foram cultivadas em meio sólido, a 30 ° C antes da marcação de biotina e a 20 ° C em seguida. Valores de freqüência observados são mostrados com colunas de laranja (OBS) e freqüências previstos para células envelhecidas são mostrados com colunas marrons (PRE). A primeira coluna para cada gráfico apresenta a média eo desvio padrão da frequência de mutação inicial após marcação biotina para quatro ensaios independentes (PB). Números abaixo as colunas indicam o número médio de broto cicatrizes para cada população (Idade celular). Valores previstos independentes foram determinados como descrito no capítulo 7 do protocolo utilizando cada um dos valores da taxa de iniciais mostrados na Figura 2A (colunas IP) e 2B. Estes valores foram independentes então a média. Os valores observados são meio de três ensaios. As barras de erro indicam o desvio padrão.

Discussão

Este protocolo combina vários métodos para activar os recursos e as abordagens disponíveis em Saccharomyces cerevisiae sistema modelo para ser eficientemente aplicada ao estudo de instabilidade do genoma durante o envelhecimento celular mitótico. Uma grande variedade de ensaios para quantificar as diferentes formas de instabilidade do genoma com a seleção fenotípica poderia ser combinada com a classificação magnética para estudar possíveis mudanças específicas por idade na acumulação de formas particulares de mutações ou rearranjos cromossômicos. Enquanto as abordagens todo o genoma de seqüenciamento poderia fornecer mais informações sobre os tipos gerais das mudanças que ocorrem em um genoma com a idade, a capacidade de usar os sistemas de seleção fenotípica para obter medições da taxa de mutação e isolar preferencialmente tipos específicos de mudanças genéticas são vantagens importantes para o estudo mecanicista aspectos relacionados com a instabilidade do genoma do envelhecimento. Racionalizar a fixação da idade da célula eo potencial para fazer medições paralelas de physiologimudanças cal por fluxo de citometria fornecer meios eficientes para correlacionar a instabilidade do genoma com outras alterações celulares durante a faixas etárias específicas. Determinação das alterações, dependentes da idade potenciais nas taxas de mutações que se acumulam requer: 1) determinação das taxas de cuidado em populações de células jovens, 2) a determinação precisa da idade da célula, e 3) a capacidade para enriquecer suficientemente confiavelmente grandes populações de células mãe para medir de forma reprodutível instabilidade do genoma na velhice. Esta abordagem permite que o sistema modelo de levedura de contribuir para a definição de mecanismos subjacentes responsáveis ​​pelas alterações dependentes da idade das taxas e / ou frequências de instabilidade do genoma nas células por mitose ativos. Além disso, fatores genéticos e ambientais podem ser rapidamente avaliado por contribuições para o genoma instabilidade dependente da idade. Em última instância, essas caracterizações pode levar ao desenvolvimento de modelos que representam a maneira pela qual as mutações se acumulam durante o envelhecimento replicativo.

Este método depende da capacidade para detectar mutações ou outros tipos de instabilidade do genoma através do aparecimento de fenótipos seleccionáveis ​​para medir as taxas de tais acontecimentos. No entanto, a criatividade no design de ensaio pode permitir que muitos aspectos da instabilidade do genoma a ser investigado. Por exemplo, o gene URA3 e CAN1 genes podem ser colocados em diferentes locais genómicos para testar quaisquer influências sobre a localização genómica nos resultados. Reversão de alelos específicos de genes não-funcionais para alelos de genes funcionais poderia testar determinados processos de mutação. Além disso, a introdução de vários alelos inactivos do gene de um ou flanqueando um gene com as sequências de repetição podem ser utilizados para examinar através de eventos de recombinação restauração ou perda da função do gene, respectivamente. Testes de flutuação são o método padrão para a determinação das taxas desses vários eventos de instabilidade do genoma 9. O protocolo é feito com a Lea-Coulson estimador mediana bem aceito e relativamente simples para determinar mutataxa ção para torná-lo mais acessível a diversos pesquisadores, embora o método de MSS-estimador de máxima verossimilhança é considerada a melhor abordagem para determinar as taxas de mutação 9. O estimador MSS-máxima probabilidade foi anteriormente analisado em detalhe 9, e pode ser utilizado como um método alternativo, mas requer cálculos mais sofisticados. Alternativamente, software livre para calcular as taxas de mutação com este método foi disponibilizado 22. A obtenção de medidas reprodutíveis de taxas de mutação requer atenção para alguns aspectos do design experimental, incluindo o uso de culturas réplica suficientes, inoculando culturas em densidades celulares iniciais bastante baixas que o tamanho da população aumenta em volumes de cultura apropriados 10.000 vezes ou mais, e escolher para que o todo população de células pode ser transmitida para o meio selectivo. Para o último ponto, uma fórmula anteriormente descrita pode ser utilizada para ajustar a taxa de mutação com base na fracção de cultura tested 9. Variação na taxa de crescimento das culturas pode complicar a determinação de uma taxa de mutação reprodutível, e um estimador baseado em mediana modificado que pode produzir resultados mais reprodutíveis em tais situações, tem sido recentemente descritos 23.

A capacidade de medir com precisão a idade celular é outro fator que é importante para estabelecer se as frequências de instabilidade do genoma em células velhas são diferentes dos valores esperados, devido à taxa de eventos em células jovens. Foram encontradas manchas WGA ser preferível calcoflúor coloração branca, tanto em termos de flexibilidade e de fundo, uma vez que está disponível WGA conjugado com diferentes moléculas fluorescentes. Essa flexibilidade pode oferecer mais oportunidades para medições simultâneas de outras características celulares com reagentes fluorescentes. O trabalho inicial para estabelecer uma relação entre a intensidade do sinal para a coloração de WGA e o número correspondente de broto cicatrizes nas células podem, então, levar a uma maiora determinação rápida da idade da célula através de citometria de fluxo. Esta abordagem também permite a utilização de tamanhos da população maior do que seria normalmente examinadas por microscopia para melhorar a reprodutibilidade das medições. Enquanto todas as determinações de idade poderá ser feita através de exame microscópico das células, nós sentimos que a citometria de fluxo abordagem facilita a rápida triagem de fatores que influenciam genoma instabilidade dependente da idade.

Além de medir a idade das células de forma fiável, a consideração deve ser dada para o número de divisões celulares de células-mãe são permitidos para sofrer com cada ronda de crescimento sucessivo e triagem de células. Use de um tamanho de populao inicial menor ou um maior volume de cultura pode permitir que as células se submeter a mais divisões celulares antes de atingir a densidade de células desejada. Por exemplo, outros pesquisadores usaram apenas duas rodadas de classificação para a obtenção de células de levedura muito antigos 16, que tem a vantagem óbvia de obtenção de células velhas com menos experimeetapas ntal. Ao estudar a possibilidade de aumentar o volume de cultura para permitir que as células para completar mais divisões celulares antes da ordenação, tenha em mente o limite do número total de células que podem ser processados ​​em uma única coluna. O uso de um volume de cultura maior pode exigir a utilização de várias colunas para ordenar uma população de células. Além disso, se as células sofrem menos ciclos de divisão celular entre os pontos tipos / colecção, então há mais oportunidades para observar desvios de freqüências de mutação esperados em momentos distintos durante a vida útil. Por exemplo, a amostragem apenas no início e final dos pontos de tempo durante a vida útil pode produzir dados que indicam um aumento constante na freqüência de mutação, mas amostragem em tempos intermédios adicionais durante a vida útil pode mostrar que a freqüência de mutação aumenta rapidamente e planaltos. No entanto, uma vez que este protocolo isola células-mãe antigas, há uma oportunidade para obter uma medida mais direta das mudanças nas taxas de mutação com a idade. Testes de flutuação poderia be realizado utilizando células-mãe de idades diferentes para determinar se a taxa de mutação serão diferentes dos obtidos utilizando a taxa de células jovens. Enquanto as culturas para estes testes de flutuação será uma mistura de células jovens e velhos à medida que crescem, quaisquer desvios taxas obtidas a partir de células jovens pode ser atribuído à utilização de uma população mais velha de partida.

A capacidade de se obter de forma reprodutível uma grande população suficiente de células-mãe com idade para medir com precisão a instabilidade do genoma é essencial para o sucesso desta abordagem. Embora o protocolo descreve o uso de um sistema de triagem magnética especial para este fim, outros grupos foram classificados células mãe de levedura com sistemas alternativos 14,18 (ver Tabela de Materiais). Tais sistemas alternativos também deve trabalhar com este método, embora alguns otimização de protocolos dos fabricantes pode ser necessária. Independentemente de o sistema específico utilizado, o tamanho da população requeremdifere D em função da frequência do tipo de mutação ou rearranjo do genoma escolhidas para estudo. No mínimo, deve haver células mãe suficiente para se obter pelo menos um mutante de colónias por população para calcular uma frequência de mutação. Na prática, os resultados podem ser bastante variável, se apenas de zero a cinco colónias mutantes são esperados a partir do tamanho da população, e mesmo um pequeno aumento na dimensão da população, de modo que 5-10 colónias mutantes são esperados, pode melhorar significativamente a reprodutibilidade. Quando a identificação de uma população de biotina de partida, a eficiência de recuperação para cada tipo tem de ser tida em conta para ajudar a identificar o tamanho da população adequado necessário para medir a frequência de mutação em células-mãe de idade. Com a recuperação de 90% das células-mãe depois de cada espécie, apenas 59% da população original seria recuperado após cinco rodadas de crescimento e ordenação. Esta cai para ~ recuperação de 33% da população original, depois de cinco rodadas de crescimento e classificação se apenas 80% das células-mãe são rotulados recuperared durante cada espécie. Medir e maximizar a recuperação é crucial ao medir eventos de baixa freqüência, uma vez que duas a três vezes diminuição no tamanho da população poderia facilmente levar a números não confiáveis ​​de colónias mutantes por população.

Existem inúmeras opções para expandir ou modificar este protocolo para obter uma compreensão mais ampla de instabilidade do genoma durante o envelhecimento celular mitótico. Exemplos simples incluem analisar como alterações nas funções dos genes, mudanças de mídia ou outras mudanças de condição ambiental alterar o acúmulo de mutações com a idade. As taxas de mutação de células jovens com a função do gene alterado, ou na condição apropriada seria medido e utilizado para determinar se as mutações se acumulam de forma diferente do que o previsto pelos valores da taxa e de forma diferente do que nas populações de células de controlo. Populações de células em diferentes pontos durante o envelhecimento replicativo poderá estar exposto a estressores específicos, tais como as espécies reativas de oxigênio ou de DNA agentes prejudiciais. Aexposição transitória e leve ao estresse oxidativo não alterou substancialmente a capacidade de realizar a triagem de células (Figura 3), mas as tensões severas podem dificultar a recuperação das células. Seria necessário experiências preliminares para verificar que as células-mãe podem ainda ser recuperados eficientemente depois de tensões específicas. Além disso, as características celulares de células mãe isoladas podem ser analisados ​​em detalhe, incluindo os níveis de espécies reativas de oxigênio, morfologia mitocondrial e vacuolar e outras características fisiológicas que estão associadas com o envelhecimento 3. Além disso, as células-mãe pode ser uma população de partida para um novo tratamento, ou manipulação. Como as células mãe e filha estão fisicamente separados durante o procedimento, as células filhas também ainda estão disponíveis para análise. Por exemplo, alterações nas características fisiológicas das células filhas ou a herança assimétrica de macromoléculas danificadas entre mãe e filha células de levedura 24 pode ser comparado com o tempo de quaisquer mudanças interessantes em mutação frequências / taxas. Frequências de mutação de populações de células filha também pode ser obtida a fim de tentar modelar se existe herança assimétrica de mutações durante o envelhecimento replicativo. Em resumo, a combinação de enriquecimento de células-mãe por meio de triagem de células magnético com testes de flutuação permite que as vantagens da S. sistema modelo cerevisiae para ser eficientemente aplicada para investigar os mecanismos responsáveis ​​pelo acúmulo de alterações genéticas durante o envelhecimento celular mitótico.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte pela concessão R00AG031911 do Instituto Nacional do Envelhecimento dos Institutos Nacionais de Saúde para PHM O conteúdo deste artigo não refletem necessariamente opiniões oficiais do National Institutes of Health.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinaThermo Scientific21335100 mg
Microesferas Anti-BiotinaMiltenyi Biotec130-090-4852 ml MicroBeads conjugadas com anticorpos monoclonais anti-biotina de camundongo (isotipo: camundongo IgG1)
Colunas MACS LSMiltenyi Biotec130-042-40125 colunas adequadas para separador QuadroMACS
Separador QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976Apenas Separador
Kit de Partida QuadroMACSMiltenyi Biotec130-091-051Inclui: Separador QuadroMACS (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), Colunas LS (130-042-401), Suporte para Tubos MACS 15 ml (130-091-052), Uma unidade de 2 ml de MACS MicroBeads. Nota: Sistemas alternativos incluem Dynabeads Biotin Binder e MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer, 40 µ mBD Biosciences35234040 µ m para uso com tubos cônicos BD Falcon 50 ml. 50 por pacote
Trypan BlueSigma-AldrichT6146Pó, filtrando após a dissolução importante para remover partículas
Aglutinina de gérmen de trigo Alexa Fluor488Life TechnologiesW11261Conjugados com diferentes espectros de excitação/emissão também podem ser usados
Reagente anti-desvanecimento ProLong GoldLife TechnologiesP3693010 ml, outros reagentes anti-desvanecimento também podem ser usados

Referências

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