O cálcio está envolvido em inúmeras vias de sinalização fisiológicos e fisiopatológicos. Imagem de células vivas requer equipamento especializado e pode ser demorado. Um método rápido, simples usando um citômetro de fluxo para determinar mudanças relativas de cálcio citosólico em células epiteliais aderentes trazidos para suspensão foi otimizado.
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Artigo de método
Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma variedade de processos celulares, tanto fisiológicos quanto fisiopatológicos, requerem ou são governados pelo cálcio, incluindo exocitose, função mitocondrial, morte celular, metabolismo celular e migração celular, para citar apenas alguns. O cálcio citosólico é normalmente mantido em baixas concentrações nanomolares; em vez disso, é encontrado em altas concentrações micromolares a milimolares no retículo endoplasmático, na matriz mitocondrial e no compartimento extracelular. Após a estimulação, um aumento transitório no cálcio citosólico serve para sinalizar eventos a jusante. A detecção de alterações no cálcio citosólico é normalmente realizada usando uma imagem de células vivas configurada com corantes de ligação ao cálcio que exibem um aumento na intensidade de fluorescência ou uma mudança no comprimento de onda de emissão após a ligação do cálcio. No entanto, uma configuração de imagem de células vivas não é acessível gratuitamente a todos os pesquisadores. Métodos alternativos de detecção foram otimizados para células imunológicas com citometria de fluxo e para células aderentes não imunológicas com um leitor de microplacas de fluorescência. Aqui, descrevemos um método simples e otimizado para detectar alterações nas células epiteliais com citometria de fluxo usando um corante de ligação de cálcio de comprimento de onda único. As células epiteliais do túbulo proximal renal aderentes, que normalmente são difíceis de carregar com corantes, foram carregadas com um corante de ligação de cálcio permeável a células fluorescentes na presença de probenecida, colocadas em suspensão e os sinais de cálcio foram monitorados antes e depois da adição de tapsigargina, tunicamicina e ionomicina.
Introdução
O cálcio é um importante segundo mensageiro responsáveis pela transmissão de sinais fisiológicos e patofisiológicos celular 1. Concentrações citosólicas de cálcio são mantidos baixos por meio da atividade de bombas de cálcio e trocadores de cálcio. A / ATPase de cálcio do retículo endoplasmático sarcoplasmático (SERCA) preenche o retículo endoplasmático (ER) loja de cálcio como parte de um sistema de "vazamento de bomba", enquanto o cálcio ATPase da membrana plasmática (PMCA) expulsa o cálcio para o compartimento extracelular, tanto em maneiras dependentes de ATP 2. Mensageiros fisiológicas, tais como hormonas ou neurotransmissores, transmitem....
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Protocolo
1. Preparação dos Reagentes e Soluções
- Prepare uma solução de Hank equilibrada modificado sal (HBSS) (em mM: 136.9 NaCl, 5.37 KCl, 0,34 de Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, pH 7,2, sem vermelho de fenol). Armazenar a 4 ° C.
- Adicione 1,5 M de CaCl2 e 2 M de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) (pH 7,2) soluções de reserva, utilizando água destilada.
- Prepara-se uma solução de estoque de 250 mM de probenecida. Para a forma de ácido livre (muitas vezes referida como insolúveis em água), dissolver em pó probenecida em NaOH 1 N, encher a três quartos ....
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Resultados
Para aumentar o cálcio citosólico, dois compostos farmacológicos foram aplicados a células renais do túbulo proximal (WKPT-0293 CL.2) carregadas com o corante de ligação celular permeável ao cálcio, Fluo-3-AM. Amostras de controlo não tratados foram carregadas com corante de ligação do cálcio na presença de probenecida e foram misturados, mas sem a adição de quaisquer compostos. Tapsigargina (TG) é um inibidor da bomba clássica SERCA que conduz a fugas para fora do ER e resultando em aumento de cálcio citosólico. Tunica.......
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Discussão
O cálcio é um evento chave na múltiplos processos celulares que actuam como um segundo mensageiro molécula de sinalização e também como um meio para comunicar entre o ER e mitocôndrias. A capacidade de medir alterações nas concentrações de cálcio citosólico livre é uma técnica útil que pode ser aplicada a todas as áreas de biologia celular. Existem vários métodos para a detecção de sinais de cálcio citosólicos. Classicamente, os sinais de um indicador de cálcio raciométrica, tais como Fura-2, são monitorizados em célula.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Pesquisas nos laboratórios é financiado pela Fundação Fritz-Bender, Munique, Alemanha (para TD) e da Universidade de Witten / Herdecke bolsa de investigação interna (para W.-KL). Gostaríamos de agradecer a Prof Dr. Dr. Frank Thévenod (Instituto de Fisiologia, Fisiopatologia e Toxicologia da Universidade de Witten / Herdecke) para sugestões.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Permeável à célula |
| Probenecida | Sigma-Aldrich | P-8761 | Insolúvel em água, dissolver em 1 N NaOH |
| 0,05% Tripsina-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamicina | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Citômetro de Fluxo + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Observe que este é um aplicativo de 16 bits mais antigo que lê arquivos compatíveis com FCS 2.0, mas não reconhece dados digitais FCS 3.0. | |
| WKPT-0293 Cl.2 linha | Disponibilizado pelo Dr. Ulrich Hopfer (Departamento de Fisiologia e Biofísica, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
Referências
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J.
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Reimpressões e permissões
