Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo

Resumo

O cálcio está envolvido em inúmeras vias de sinalização fisiológicos e fisiopatológicos. Imagem de células vivas requer equipamento especializado e pode ser demorado. Um método rápido, simples usando um citômetro de fluxo para determinar mudanças relativas de cálcio citosólico em células epiteliais aderentes trazidos para suspensão foi otimizado.

Resumo

Uma variedade de processos celulares, tanto fisiológicos quanto fisiopatológicos, requerem ou são governados pelo cálcio, incluindo exocitose, função mitocondrial, morte celular, metabolismo celular e migração celular, para citar apenas alguns. O cálcio citosólico é normalmente mantido em baixas concentrações nanomolares; em vez disso, é encontrado em altas concentrações micromolares a milimolares no retículo endoplasmático, na matriz mitocondrial e no compartimento extracelular. Após a estimulação, um aumento transitório no cálcio citosólico serve para sinalizar eventos a jusante. A detecção de alterações no cálcio citosólico é normalmente realizada usando uma imagem de células vivas configurada com corantes de ligação ao cálcio que exibem um aumento na intensidade de fluorescência ou uma mudança no comprimento de onda de emissão após a ligação do cálcio. No entanto, uma configuração de imagem de células vivas não é acessível gratuitamente a todos os pesquisadores. Métodos alternativos de detecção foram otimizados para células imunológicas com citometria de fluxo e para células aderentes não imunológicas com um leitor de microplacas de fluorescência. Aqui, descrevemos um método simples e otimizado para detectar alterações nas células epiteliais com citometria de fluxo usando um corante de ligação de cálcio de comprimento de onda único. As células epiteliais do túbulo proximal renal aderentes, que normalmente são difíceis de carregar com corantes, foram carregadas com um corante de ligação de cálcio permeável a células fluorescentes na presença de probenecida, colocadas em suspensão e os sinais de cálcio foram monitorados antes e depois da adição de tapsigargina, tunicamicina e ionomicina.

Introdução

O cálcio é um importante segundo mensageiro responsáveis ​​pela transmissão de sinais fisiológicos e patofisiológicos celular ^1. Concentrações citosólicas de cálcio são mantidos baixos por meio da atividade de bombas de cálcio e trocadores de cálcio. A / ATPase de cálcio do retículo endoplasmático sarcoplasmático (SERCA) preenche o retículo endoplasmático (ER) loja de cálcio como parte de um sistema de "vazamento de bomba", enquanto o cálcio ATPase da membrana plasmática (PMCA) expulsa o cálcio para o compartimento extracelular, tanto em maneiras dependentes de ATP ^2. Mensageiros fisiológicas, tais como hormonas ou neurotransmissores, transmitem os seus sinais através de receptores acoplados à proteína G, a activação de fosfolipase C, que provoca a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) na membrana de plasma para gerar diacilglicerol e trifosfato de inositol (IP3) ^3. Enquanto diacilglicerol permanece na membrana plasmática, IP3 difunde-se para o citosol e liga-se ao receptor de IP3s (IP3Rs), que são activadas ligando os canais de cálcio, encontrados na membrana do RE e do cálcio é libertado a partir da loja ER luminal culminando com um aumento nas concentrações de cálcio citosólicos ^4. Uma via alternativa para o cálcio para atingir o citossol é através de canais de cálcio e permutadores presentes na membrana plasmática. Crosstalk entre esses dois compartimentos foram descritos: liberação de cálcio de cálcio induzida (CICV), onde o cálcio extracelular induz liberação de cálcio das lojas ER ⁵ e loja operada entrada de cálcio (SOCE), onde o esvaziamento das lojas ER é detectada por STIM e provoca a abertura de Orai canais de cálcio na membrana plasmática para promover o reenchimento das lojas de ⁶ ER.

Sob condições fisiopatológicas, a resposta celular de cálcio é desregulados e citosólicas de cálcio aumenta na ausência de estimuladores fisiológicos ^1. A resposta de cálcio pode ser afectada de várias maneiras: cálcio prolongadasinal, a remoção retardada de cálcio a partir do citosol, depleção das reservas de cálcio ou mudanças localizadas em cálcio. Além disso, as mitocôndrias assumir um papel central na memória intermédia de libertação de cálcio e ^7. Prolongado e / ou aumento de cálcio citosólico supramáxima leva à morte celular. Na verdade, o cálcio é mais frequentemente do que não envolvido na resposta fisiopatológica celular e é um evento chave em uma ampla gama de doenças, tais como doenças neurodegenerativas, doenças cardíacas, câncer, doenças ósseas e doenças renais, que estão principalmente associados com a morte celular e perda ou alteração de órgão ou tecido função ^8-10. Além disso, a perturbação de sinais de cálcio tem sido associada a adaptação celular e alterações em funções celulares e as respostas.

Tradicionalmente, os sinais de cálcio são medidos com um indicador de cálcio fluorescente carregada negativamente que é carregado em células em uma forma de éster de acetoximetilo permeável célula (AM). Uma vez clivada por Esteras celulareses, os indicadores fluorescentes permanecer dentro do compartimento intracelular e aumentam em intensidade de fluorescência quando o cálcio é ligado. O indicador de cálcio mais conhecidos e utilizados é o raciométrica Fura-2 desenvolvido por Roger Tsien e colegas ^11. Indicadores de cálcio com afinidades diferentes para permitir diferentes pools de cálcio de cálcio a ser monitorizado. Métodos de detecção incluem imagens de células vivas, leitor de microplacas de fluorescência e citometria de fluxo. A cinética relativamente rápida de sinais de cálcio (geralmente dentro de alguns segundos a minutos) faz de células vivas imaginando o melhor método para a obtenção de mais informações sobre as características do sinal de cálcio. Além dos cinética rápida de sinais de cálcio (em milissegundos), imagens de células vivas é um método melhor para estudar compartimentalização celular da sinalização de cálcio dentro de uma única célula ^12. As concentrações de cálcio absolutos pode ser calculada através da determinação da fluorescência mínima e máxima da ind cálcioicator pela adição de um quelante de cálcio e de permeabilização das células, respectivamente, como descrito por Grynkiewicz et ai. ^11.

A utilização de citometria de fluxo para medir sinais de cálcio foi desenvolvido pela primeira vez na década de 1980 em células imunológicas onde a oportunidade para medir vários parâmetros, tais como a integridade da membrana e separação de população de células, e o requisito de células em suspensão combinada com o desenvolvimento de um único comprimento de onda indicadores de cálcio feita de citometria de fluxo de um método ideal e convenientdetection ^13-15. Em células aderentes, imagens de células vivas fornece a maior parte da informação sobre a sinalização de cálcio, mais importante, a cinética, mas requer uma instalação complicada, compreendendo um microscópio de fluorescência, um sistema de perfusão, a manutenção do ambiente celular, tais como a temperatura, e microscópio software especializado para adquirir e análise de dados. Métodos alternativos, tais como um leitor de microplacas de fluorescência ou farmacolmeios ogical através do uso de quelantes de cálcio são incomparáveis ​​em termos de informação adquirida. Citometria de fluxo é cada vez mais amplamente utilizado para monitorizar o cálcio citosólico em células aderentes, embora, na maioria dos estudos, apenas ponto de terminar as medições sejam efectuadas. Utilizando o método desenvolvido inicialmente por Gergely et al., Em células imunológicas B ^16, alterações na concentração de cálcio livre citosólico por citometria de fluxo com uma cinética em tempo real e o controlo da intensidade de fluorescência em células individuais a partir de uma população de amostra foram medidos com sucesso em células epiteliais de cancro e de células-tronco do câncer híbridos ^17. Este método foi adicionalmente adaptado para utilização em células epiteliais aderentes, que são difíceis de carregar com os indicadores de cálcio ^18.

Aqui, utilizando uma linha de células epiteliais aderentes imortalizada derivada do segmento S1 do túbulo proximal do rim de rato (WKPT-CL.2 0293) ^19, descrevemos um m simplificada optimizadoétodo para a medição de alterações na concentração de cálcio citosólico, por citometria de fluxo. Uma vez que muitas células epiteliais possuem um número de transportadores orgânicos para compostos aniónicos, a carga de células com um indicador de cálcio podem provar ser um desafio. Para evitar o efluxo de indicadores de cálcio, probenecida, o inibidor prototípico de transportadores de aniões orgânicos e originalmente desenvolvido para diminuir a excreção renal de penicilina ^20, é aplicado simultaneamente no meio de incubação. As células são mantidas em monocamadas de carga indicador de cálcio, apresentado em sinais de suspensão e de cálcio podem ser detectadas imediatamente após a adição do composto.

Protocolo

1. Preparação dos Reagentes e Soluções

1. Prepare uma solução de Hank equilibrada modificado sal (HBSS) (em mM: 136.9 NaCl, 5.37 KCl, 0,34 de Na ₂ HPO _4, 0,44 KH ₂ PO _4, 4,17 NaHCO _3, pH 7,2, sem vermelho de fenol). Armazenar a 4 ° C.
2. Adicione 1,5 M de _CaCl2 e 2 M de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) (pH 7,2) soluções de reserva, utilizando água destilada.
3. Prepara-se uma solução de estoque de 250 mM de probenecida. Para a forma de ácido livre (muitas vezes referida como insolúveis em água), dissolver em pó probenecida em NaOH 1 N, encher a três quartos do volume final com água destilada e, lentamente, titula-se a pH 7,4 com 1 N de HCl. Armazenar a 4 ° C.
4. Dissolver membrana permeável ao cálcio fluorescente corante obrigatório em dimetilsulfóxido anidro (DMSO) a uma concentração de reserva de 1 mM. Armazenar a -20 ° C no escuro.
5. Antes de cada experiência, acabado de preparar-H contendo probenecidBSS de fluxo (PHF) tampão modificado pela combinação com HBSS (em concentrações finais) 1,5 mM de _CaCl2, 10 mM de HEPES, pH 7,2, 5% de soro fetal bovino, 2 mM de probenecida, glicose e 5,55 mM. Aquece-se até 37 ° C.

2. Cultura celular

1. Placa de 2,5 x 10 ⁵ células de rim do túbulo proximal (WKPT CL.2-0293) por poço de uma placa de 6 ou 35 milímetros bem prato em meio de cultura padrão e crescer durante 2 dias, atingindo uma confluência de aproximadamente 70%.

3. Corante de cálcio Carregando

1. Para cada prato ou bem, misturar 1 ml de meio de cultura contendo 5% de soro fetal bovino, corante de cálcio permeáveis ​​4 uM de ligação celular e 2 mM de probenecida.
2. Substituir o meio de cultura com 1 ml de mistura de corante de carga em cada poço e incubar a 37 ° C durante 30 min numa incubadora humidificada com 5% de CO _2. Cobrir a placa com uma folha de alumínio para evitar a descoloração do indicador fluorescente.

4. Preparação de Cells para Citometria de Fluxo

1. Solução de tripsina a 0,05% de ácido etilenodiaminotetracético-quente (EDTA) a 37 ° C.
2. Aspirar cálcio solução de corante de carga de cada poço e adicionar 1 ml de tripsina ao longo da parede do poço.
3. Incubar a 37 ° C até que todas as células são separadas.
4. Transferência de células para um tubo de 1,5 ml e sedimento por centrifugação numa microcentrífuga a 10000 g durante 1 min.
5. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
6. Lave as células adicionando tampão PHF 1 ml e ressuspender por pipetagem cima e para baixo.
7. Sedimentar as células por centrifugação a 10.000 g durante 1 min.
8. Repita os passos 4.6. e 4.7. mais duas vezes.
9. Ressuspender as células num volume final de 500 ul de tampão de PHF e usar as células para a experimentação dentro de 1 h.
10. Opcional: contagem de células para determinar a concentração de células e usar 5 x ^outubro 4-1 x 10 ⁵ células por medição.

5. Fluxo CitSetup ometer

1. Comece o citômetro de fluxo, abra a gaveta fluídica e virar a chave seletora de válvula de ventilação para aumentar a pressão de ar do tanque de fluido do invólucro.
2. "Prime" do instrumento para remover eventuais bolhas de ar residente de dentro das câmaras de ar e câmara de fluxo.
3. No software de citometria de fluxo, abrir duas janelas do gráfico de pontos.
   1. O primeiro gráfico de pontos requer a frente de luz difusa (FSC) para o parâmetro X e do lado da luz difusa (SSC) para o parâmetro Y para controlar para a qualidade das células no interior da amostra através do seu tamanho e da sua granularidade, respectivamente.
   2. O segundo gráfico de pontos mede a intensidade de fluorescência do corante ligado de cálcio. Escolha do canal de detecção de fluorescência apropriado para o parâmetro Y utilizando uma escala logarítmica e tempo em segundos para o parâmetro X em uma escala linear.
4. Definir a taxa de fluxo para "alto".

6. Citometria de Fluxo MEDIÇÃO

1. Execute as medições em RT. Num tubo de ensaio de citometria de fluxo (11,5 x 75 mm), adicionar 480 ul de tampão de PHF.
2. Adicionar suspensão de células de 20 mL e brevemente vortex para misturar.
3. Mover o braço de suporte do tubo para o lado e posicionar o tubo de amostra sobre o tubo de injecção da amostra até uma vedação hermética é formada. Retorne o braço de suporte do tubo para sua posição original centrado.
4. Optimizar a medição, ajustando o canal de fluorescência de tal modo que a intensidade de fluorescência média da amostra é de aproximadamente 10 ² no eixo-y. Salvar e usar para os experimentos posteriores.
5. Para iniciar um experimento, repita os passos 6.1 a 6.3.
6. Fluorescência basal recorde para 50 seg.
7. Pause medida, retirar o tubo de amostra, adicionar o composto de interesse, vortex brevemente e retornar ao tubo de injecção de amostra. Este passo não deve demorar mais do que 15 segundos.
8. Retomar a medição e continuar para um total de 204,8 seg.
9. Use um i cálcioonophore, tais como ionomicina (10 uM), e um quelante de cálcio, tal como o etileno-glicol do ácido tetra-acético (EGTA), _MnCl2 ou _CoCl2 (2 mM), para os controlos positivos e negativos, respectivamente.

Análise 7. Os dados

1. Analisar dados usando o software de citometria de fluxo dedicado para análise off-line, como WinMDI (Windows Multiple Document Interface para Citometria de Fluxo), um pacote de software livre desenvolvido por Joe Trotter no Instituto Scripps, Citometria de Fluxo Núcleo Facility.
2. Abra um gráfico de pontos com os parâmetros SSC e FSC.
3. Selecione a região de células para análise utilizando a ferramenta "Regiões" (clique com o botão direito sobre a imagem) para excluir as células mortas ou restos de células encontradas no canto inferior esquerdo da análise dos dados (Figura 1).
4. Análise quadrante (Figura 2)
   1. Abra uma densidade de trama com o tempo no eixo dos x e intensidade de fluorescência no eixo-y. Use todos os eventos.
   2. NosE é a mesma região gating como em 7.3.
   3. Quantificar os dados usando a ferramenta "Quadrante".
   4. Ajustar os separadores de quadrante, de modo que a linha vertical é colocado no momento da adição do composto e a linha horizontal que está colocado no centro da linha de base de fluorescência nos controlos. Certifique-se de que o posicionamento dos separadores de quadrante é igual em todas as amostras.
   5. A percentagem de células em cada quadrante é apresentado em cada canto (Figura 2). Compare o quadrante superior direito (UR) entre as amostras.
5. Análise de histograma (Figura 3)
   1. Abra os dados de controlo de uma janela do histograma de intensidade de fluorescência no eixo dos x e eventos no eixo-y. Use todos os eventos.
   2. Para uma visão pictórica, adicione os dados de teste para ser comparado com a testemunha como parcelas de sobreposição (vá em File → Open File → Selecione o arquivo → Overlay).
   3. Para a análise quantitativa, único histograma ganhardows deve ser usado. Portão da população celular utilizando a região R1 do passo 7.3.
   4. No controlo não-tratadas, usar a função de marcador ("marcadores") para marcar a área de análise a partir do ponto médio entre o mínimo e máximo de fluorescência do pico de controlo e terminando na intensidade de fluorescência máxima. A percentagem de células nessa área é calculada.
   5. Recuperar os dados da janela de estatísticas. Repita o procedimento para os restantes ficheiros de dados usando a mesma área marcada para análise.
6. Análise da intensidade de fluorescência (Figura 4)
   1. Abrir um gráfico de pontos com o tempo no eixo dos x e intensidade de fluorescência no eixo-y. Use todos os eventos.
   2. Ative o "Modo Kinetics" e "Overlay Kinetics Line". Uma linha azul aparecerá na trama ponto que representa a intensidade média de fluorescência.
   3. Quantificar o fluxo relativo de cálcio através da criação de várias regiões retangulares. Cada região deve ter awidth de cerca de "50", o que é equivalente a "10 seg". Defina até 15 regiões retangulares.
   4. Recuperar quantificação da janela de estatísticas e copiar em uma planilha.
   5. Usar os dados-y significativo para análise. Calcule a média de R2 a R6, que é equivalente a 20 a 50 seg. Este é o valor da linha de base.
   6. Escolha um intervalo de tempo adequado para a análise do influxo de cálcio (depende de início, duração e intensidade).
   7. Calcular os sinais de cálcio a partir de cada região, dentro deste intervalo de tempo em relação ao valor da linha de base média, isto é, o sinal de fluorescência antes da adição de composto, a qual é definida como 100%. Determinar a média eo desvio padrão das regiões postar além composto; este é o sinal significativo de cálcio evocado pelo composto.

Resultados

Para aumentar o cálcio citosólico, dois compostos farmacológicos foram aplicados a células renais do túbulo proximal (WKPT-0293 CL.2) carregadas com o corante de ligação celular permeável ao cálcio, Fluo-3-AM. Amostras de controlo não tratados foram carregadas com corante de ligação do cálcio na presença de probenecida e foram misturados, mas sem a adição de quaisquer compostos. Tapsigargina (TG) é um inibidor da bomba clássica SERCA que conduz a fugas para fora do ER e resultando em aumento de cálcio citosólico. Tunica...

Discussão

O cálcio é um evento chave na múltiplos processos celulares que actuam como um segundo mensageiro molécula de sinalização e também como um meio para comunicar entre o ER e mitocôndrias. A capacidade de medir alterações nas concentrações de cálcio citosólico livre é uma técnica útil que pode ser aplicada a todas as áreas de biologia celular. Existem vários métodos para a detecção de sinais de cálcio citosólicos. Classicamente, os sinais de um indicador de cálcio raciométrica, tais como Fura-2, são monitorizados em célula...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Permeável à célula
Probenecida	Sigma-Aldrich	P-8761	Insolúvel em água, dissolver em 1 N NaOH
0,05% Tripsina-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamicina	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Citômetro de Fluxo + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Observe que este é um aplicativo de 16 bits mais antigo que lê arquivos compatíveis com FCS 2.0, mas não reconhece dados digitais FCS 3.0.
WKPT-0293 Cl.2 linha			Disponibilizado pelo Dr. Ulrich Hopfer (Departamento de Fisiologia e Biofísica, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)

celular do túbulo proximal do rim de rato