Artigo de método

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente In Vitro Depleção de células T humanas antígeno específico da

DOI:

10.3791/51859

⸱

11 de agosto de 2014

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1Department of Pathology, Institute of Cell Engineering, Johns Hopkins University, 2Department of Internal Medicine I, University of Regensburg, 3Department of Rheumatology, Asklepios Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Orientações são apresentados para a produção de antigénio de células apresentadoras artificial assassino, KaAPC, uma ferramenta eficaz para a depleção in vitro de células T específicas de antigénios humanos e de uma solução alternativa para imunoterapia celular para o tratamento de doenças mediadas por células T auto-imunes num antígeno forma específica, sem comprometer o sistema imunitário remanescente.

Resumo

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O tratamento atual das doenças autoimunes mediadas por células T se baseia principalmente sobre as estratégias de imunossupressão global, o que, no longo prazo, é acompanhado de efeitos colaterais adversos, tais como redução da capacidade para o controle de infecções ou neoplasias. Portanto, novas abordagens precisam ser desenvolvidas que visam apenas as células da doença mediação e deixar o sistema imunológico restante intacto. Ao longo da última década, uma variedade de estratégias de imunoterapia com base em células de modular as respostas imunitárias mediadas por células T tem sido desenvolvido. A maioria destes métodos baseiam-se em células apresentadoras de antigénio de indução de tolerância (APC). No entanto, além de ser tecnicamente difícil e incómodo, tais abordagens baseadas em células são altamente sensíveis a respostas de células T citotóxicas, o que limita a sua capacidade terapêutica. Aqui é apresentado um protocolo para a geração de células apresentadoras de antigénios artificiais assassinas não celular (KaAPC), que permite a depleção das células T patológicas, deixando o remaining sistema imunológico intacto e funcional. KaAPC é uma solução alternativa para imunoterapia celular, que tem potencial para o tratamento de doenças auto-imunes e rejeição de aloenxertos por regulação das respostas de células T indesejáveis ​​num local específico do antigénio.

Introdução

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Ao longo das duas últimas décadas muito progresso foi feito na compreensão dos mecanismos patogénicos de doenças auto-imunes. No entanto, os tratamentos mais comuns ainda dependem de corticosteróides, bem como drogas imunossupressoras, como análogos de purina, agentes alquilantes e inibidores da calcineurina 1. O uso de tais drogas tem melhorado muito o prognóstico dos pacientes, no entanto, o tratamento não fornece uma cura do mau funcionamento imunológico subjacente. Além disso, os pacientes tornam-se vulneráveis ​​a infecções e ao desenvolvimento de câncer.

Por isso, o objectivo final no tratamento de doenças auto-imunes mediadas por células T e a rejeição do enxerto é alvejar especificamente apenas as células T causadoras de doenças, enquanto, ao mesmo tempo, deixando o restante do sistema imunitário intacto e competente para lutar contra distúrbios imunológicos. Utilizando células apresentadoras de antígenos (APC), como um tratamento para suprimir respostas de células T do sangue periférico foi descrito pela primeira vez já emdécada de 1970 por vários grupos. Desde então, diversos métodos à base de células têm sido desenvolvidos (revisto em Schutz et ai. 2). Estratégias utilizando-expressando FasL assassino-APC como células imunorregulatórios mostrou resultados promissores, indicando potencial terapêutico para o tratamento de auto-imunidade, rejeição do enxerto e infecções crônicas. No entanto, existem limitações significativas com as estratégias que utilizam FasL Killer-APC que, em última análise limita a sua aplicabilidade clínica; (I) a geração ou isolamento de APC é de tempo, trabalho e custos intensivos (ii) pacientes que sofrem de citopenia devido a imunossupressão fornecer quantidades e qualidade de células limitadas (iii) revestimento ou a transdução de sinais com a APC indução de apoptose, tais como os resultados de FasL altamente fenótipos e (iv) Killer-APC são sensíveis a citotóxica funções efectoras de células T, reduzindo, consequentemente, o seu potencial terapêutico. Portanto, é difícil garantir um reprodutível fenótipa Killer-APC definidatipo que pode ser utilizado para a modulação específica de antigénio de respostas de células T in vivo.

Com base no nosso trabalho anterior com FasL expressando Killer-APC e 3-5 células apresentadoras de antigénios artificiais (AAPC) 6,7 nós desenvolvida uma abordagem baseada no talão (KaAPC) para a inibição específica de antigénio ou eliminação de células T auto-reactivas, em vitro. KaAPC consistem de um dímero de HLA-A2-Ig (sinal 1) e um mAb anti-Fas (apoptose sinal indutor) covalentemente imobilizada sobre uma superfície de um 4.5 mm de paramagnética esférula de látex. Eles depleção das células T específicas de antigénio de uma maneira mediada pelo Fas / FasL, a partir de culturas de células T de múltiplos especificidades de uma maneira específica do antigénio e independente da morte celular induzida por activação (AICD) via. Dose apoptose dependente de células T-alvo é induzida rapidamente já depois de 30 min 8.

KaAPC podem ser facilmente gerados, de forma controlada garantindo uma definida fora do phenot prateleiraYpê e superar a maioria das deficiências das estratégias de depleção de células baseado. Consequentemente, KaAPC exibir um grande potencial para o tratamento de doenças auto-imunes mediadas por células T e a rejeição do enxerto, o avanço do campo de estratégias de tratamento específicos de células T.

Protocolo

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1 Geração de HLA-A2-Ig Baseado KaAPC

  1. Preparar tampão de borato estéril. Adicione uma solução de ácido bórico em água de 0,1 M e ajustar o pH para 7,0. Filtro estéril (0,22 mm) de tampão e armazenar a 4 ° C.
  2. Preparar o tampão de lavagem talão estéril. Utilize tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio e magnésio. Adicionar soro AB humano a 3% de concentração final. Adicionar ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para uma concentração final de 2 mM. Adicionar azida de sódio (NaN3) a 0,01% para a concentração final. Filtro estéril (0,22 mm) de tampão e armazenar a 4 ° C.
  3. Transferir 250 mL de contas de epóxi (cerca de 100 x 10 6 esferas) de estoque em um estéril, tampa de rosca frasco de vidro.
  4. Adicionar 250 ul de tampão de borato.
  5. Coloque frasco de vidro em um ímã e deixe contas aderir por 2 min; tampão aspirado e remover frasco de vidro do ímã.
  6. Lavar as pérolas uma vez com 1 ml de tampão de borato.
  7. Ressuspender as esferas em 550 ul de 0,018 ug/ Ml de HLA-A2-Ig e 3,64 ug / ml de anti-humano CD95 mAb (clone CH11) e misturar suavemente por agitação. (Por favor, consulte a seção de discussão para obter mais informações.)
  8. Incubar frasco de vidro em uma extremidade rotador durante final, a 4 ° C durante 24 hr.
  9. Girar as pérolas a 300 xg durante 2 min.
  10. Coloque frasco de vidro em um ímã para 2 min e aspirar a "solução de carregamento KaAPC"; remover frasco de vidro do ímã, adicionar 1 ml de tampão de lavagem talão e ressuspender cuidadosamente por agitação.
  11. Repita o passo 1.10 duas vezes.
  12. Incubar frasco de vidro num rotor a 4 ° C durante 24 h, em 1 ml de tampão de lavagem de grânulo. Neste ponto, todos os locais de ligação de proteína residual será bloqueada pelo soro AB humano contido no tampão de lavagem talão.
  13. Girar as pérolas a 300 xg durante 2 min.
  14. Coloque frasco de vidro em um ímã para 2 min e tampão aspirado lavagem talão; remover frasco de vidro do ímã e solução substituir com 1 ml de PBS.

2 Controle de Qualidade, Peptide Carregando, Wcalcinação, Armazenamento e Estabilidade da KaAPC

  1. Transferir 1,5 x 10 5 KaAPC para um tubo de FACS e lava-se com 1 ml de tampão de lavagem de FACS.
  2. Ressuspender as pérolas em 100 ul tampão de lavagem de FACS e adicionar 1 ml de anti-IgG1 de ratinho PE (para a detecção de a parte Fc do HLA-A2-Ig) e 1 uL de anti-IgM de ratinho FITC (clone R6-60.2, para detecção do mAb anti-CD95 humano).
  3. Incubar durante 15 minutos a 4 ° C, lava-se com 1 ml de tampão de lavagem de FACS, e ressuspender em 250 ul de tampão de lavagem de FACS e ler coloração por citometria de fluxo.

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Figura 1 QC mancha de um lote KaAPC feito como indicado na secção de protocolo. Coloração foi realizada como descrito na secção de protocolo 2 de HLA-A2-Ig foi detectada utilizando um anti-murganho-PE mAb IgG1, ao passo que anti-humano CD95 (anti-Fas) foi detectada com um anticorpo anti-ratinho-FITC mAb IgM (ver protocolo sicção 2.2) (linha azul). Gráficos pretos, cheios representam pérolas vazias corados com anti-mouse-IgG1 PE mAb ou anti-mouse-IgM FITC mAb, respectivamente. Números no canto superior direito indicam a intensidade de fluorescência média (MFI). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Para peptídeo transferência de carga 20 x 10 6 KaAPC em um novo frasco de vidro esterilizado, coloque em um ímã para 2 min, aspirar PBS e ressuspender em pérolas 500 mL PBS fresco com 5 mg peptídeo (Tenha em mente, apenas peptídeos HLA-A2 restritas vai ligar-se ao dímero!).
  2. Loja carregado KaAPC a 4 ° C até à sua utilização, por pelo menos 3 dias, para permitir o carregamento de péptido suficiente para o dímero de HLA-A2-Ig.
  3. Imediatamente antes da utilização, lavar o péptido carregado KaAPC como indicado em 1,14; repita este passo pelo menos 6x.
    NOTA: Este é um passo fundamental para garantir que o peptídeo livre tem to ser removido completamente para evitar falsos resultados positivos de extermínio; péptido livre residual foi mostrado para induzir apoptose em culturas de células T específicas para o antigénio 9. Para excluir um efeito peptídeo solúvel, executar amostras de controlo de sobrenadante de peptídeo carregado e lavado KaAPC (ver 3.8).
  4. Contagem contas usando hemocitômetro e etiqueta com data, nome do peptídeo e concentração.
    NOTA: carregados KaAPC permanecer funcional, a 4 ° C durante pelo menos um mês. Após um mês, re-carregamento com o mesmo péptido permite KaAPC para ser utilizada até um ano.

3. KaAPC In Vitro Ensaio Killing

  1. Prepare a mídia de co-cultura. Preparar meio RPMI completo suplementado com factor de crescimento de células T de 3% (fabricado no laboratório 6) e 3% de doadores de plasma autólogo. Se doador de plasma autólogo não estiver disponível, usar soro AB humano inativado pelo calor.
  2. Preparar tampão de ligação AnnexinV preparação. Dissolve-se 8,12 g de cloreto de sódio (NaCl) e 0,12 g calccloreto de io (CaCl 2) em 990 ml de ddH 2 O.Add 10 ml de tampão de HEPES 1M.
  3. Gerar células T específicas de antigénios humanos. (Para um protocolo detalhado, consulte a publicação anterior 7 utilizando artificiais células apresentadoras de antígenos (AAPC)). Certifique-se de que a especificidade de peptídeo é, pelo menos,> 75%, como determinado por coloração de tetrâmero.
  4. Para cada amostra incubar por 2 x 10 5 células T específicas de antigénio / poço (em 96 poços redondos de fundo da placa), em 200 ul de meio de co-cultura a uma razão de 1: 1 com KaAPC durante 48 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2.
  5. Amostras de colheita e transferir para um tubo de FACS; lava-se com 1 ml de tampão de ligação AnnexinV, girar a 300 xg durante 5 minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender em 100 ul de tampão de ligação AnnexinV
  6. As amostras de manchas com 1 ul AnnexinV FITC e 5 ul de 7-AAD para 10-15 min à temperatura ambiente, lava-se com 1 ml de tampão de ligação AnnexinV; girar a 300 xg por 5 min, elimine o sobrenadante umd ressuspender em 250 ul de tampão de ligação AnnexinV
  7. Leia amostras imediatamente em citômetro de fluxo.
  8. Prepare as seguintes amostras para determinar assassinato antígeno-específica por KaAPC: apenas células T; As células T anti-CD95 + solúvel; As células T + descarregado KaAPC; Células T + péptido não carregado KaAPC cognato; Células T + péptido cognato carregado KaAPC; Células T + sobrenadante de peptídeo cognato carregado KaAPC.

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. Figura 2 KaAPC matando ensaio Peptide carregado KaAPC ou esferas de controlo (HLA-A2-Ig apenas grânulos) foram cultivadas durante 48 horas a uma razão de 1: 1 com células T específicas CMVpp65 (~ 80%), recolhido e subsequentemente corados com AnnexinV e iodeto de propídio (PI) para determinar a apoptose por citometria de fluxo (ver secção protocolo de 3,3-3,7). "cognato" refere-se a esferas carregadas com CMVpp65 e "não-cognato" para seranúncios carregados com Mart-1 péptido. Os números indicam a porcentagem de células T viáveis ​​no quadrante inferior esquerdo de cada parcela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Para executar as experiências cruzadas-, gerar células T específicas para o antigénio de duas especificidades diferentes.
  2. Além disso avaliar a depleção-capacidades específicas de antigénio de KaAPC com uma análise simultânea da eliminação específica de antigénio de células T na população de células T heterogénea. (Para um protocolo detalhado consulte Schütz et al. 10).

Resultados

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As características deste protocolo definido incluem a geração de um fenótipo KaAPC que apresenta HLA-A2-Ig (sinal 1) e anti-Fas mAb (sinal de apoptose), ao mesmo tempo, o que em comparação com métodos baseados em células não é alterada pelo revestimento ou eficácias de transdução, e pode ser facilmente modulada durante a produção (Figura 1). Além disso, KaAPC, não são sensíveis às funções efectoras das células T citotóxicas e a sua funcionalidade não é dependente da qualidade das células apresentadoras de antigénios autólogos pré e pós manipulação in vitro.

KaAPC são capazes de reduzir o número de células T específicas para o antigénio in vitro, quando carregado com o péptido cognato, enquanto a não-cognato carregado KaAPC não esgotam as células T (Figura 2). Portanto, KaAPC induzir a apoptose das células T de uma maneira especifica para o antigénio. Subsequentemente, utilizou-se KaAPC para depleção selectiva de células T específicas de antigénio a partir de uma mistura de diferentes células T specificities, demonstrando que apenas citotoxicidade mínimo estava vazando em células vizinhas T (Figura 3). Assim, KaAPC representam uma ferramenta excelente para a depleção in vitro específico de antigénio de células T específicas para o antigénio humano activadas com potencial aplicabilidade clínica para o tratamento de doenças auto-imunes e rejeição de aloenxerto.

Discussão

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O passo mais importante no protocolo é garantir a proporção adequada de sinal 1 (peptídeo MHC) e sinal de 2 (anti-Fas mAb). Realizamos experimentos de titulação intensivos para definir a relação perfeita para o sinal 1 e 2; , tornou-se evidente que variações mínimas, devido às diferenças no dímero de HLA-A2 ou concentrações de Ig anti-Fas de mAb pode interferir com a funcionalidade do KaAPC. Assim, a concentração de ambos os sinais deve ser sempre verificada e a qualidade de ambas as proteínas devem ser frequentemente testado mesmo que foi pedido de uma fonte comercial. Além disso, as concentrações deverão ser sempre determinada pelo mesmo ensaio como ensaios de detecção de diferentes pode resultar em diferentes concentrações. Funcionalidade do HLA-A2-Ig também pode ser prejudicada devido a refolding incompleto e / ou carregamento peptídeo ineficiente. Além disso moléculas dímero pode agregar em diferentes graus, o que pode ter impacto sobre a atividade funcional da proteína. Portanto, a actuai quantidade de dímero necessário para a geração de um KaAPC funcional específico e pode variar. Além disso, verificou-se que o intervalo ideal para a indução da morte de sinal de anti-Fas sobre mAb KaAPC é extremamente apertado. Nas nossas mãos quantidades maiores 3,64 ug / ml de levar a morte não específica de células T positivas para Fas, enquanto quantidades inferiores a 3,64 ug / ml resultou numa reduzida actividade de morte, dependendo da dose. Embora estas condições parecem muito apertado, a atenção a estes detalhes irá resultar na geração de um KaAPC funcional e específico.

Embora a corrente de fenótipo KaAPC é funcional para a depleção de células T específicas de antigénio activadas, as experiências iniciais de segmentação de células específicas para o antigénio T naive em repouso ou não demonstrou nenhuma indução significativa de apoptose específica de antigénio, como estas populações reduziram a expressão de Fas. Portanto, pode-se prever a adição de um sinal co-estimulador para a KaAPC para induzir o aumento da regulação do Fas em células T em repouso para se transformá-losem uma meta para o KaAPC. Embora isto seja possível, todos os três sinais terá de ser cuidadosamente ajustada para garantir um fenótipo KaAPC funcional.

Ajustar a plataforma de talão a uma matriz biocompatível ou biodegradáveis ​​irá melhorar KaAPC na aplicabilidade vivo. Recentemente, Shen et al. Relatam a utilização bem sucedida em vivo dos KaAPC 5 utilizando esferas de látex iM conjugado com anti-Fas (clone JO2) e anti-His / H2-K b -TRP2 11. Temos sido capazes de mostrar que o conceito geral de células apresentadoras de antígenos artificiais (AAPC) podem ser transferidos com sucesso de mM dimensionado para partículas de tamanho 12 nm e que a funcionalidade é influenciada pela geometria da partícula 13. Assim, fazendo variar o tamanho e / ou forma de um futuro KaAPC desenhos pode ser capaz de afectar a funcionalidade in vivo e a biodistribuição, a qual pode ser a chave para o sucesso do tratamento de doenças auto-imunes específicas de órgãos.

2, o desenvolvimento de HLA de classe I suplementar dímero moléculas, bem como a identificação de novos antigénios em curso relevantes autoimunes irá aumentar e alargar a aplicabilidade de outro KaAPC. Além disso pode-se pensar em usar KaAPC dirigida a diferentes epítopos para atingir múltiplos antígenos simultaneamente.

Em resumo, KaAPC representam uma tecnologia de plataforma flexível para umaespecíficos do tigen depleção de células T. Sua natureza "lego-like" possibilita a inclusão de novos sinais, como sinais co-estimulatórios ou inibitórios adicionais, como PD1 ou TRAIL em várias matrizes, o que poderia ampliar e melhorar a sua posterior in vitro e in vivo aplicabilidade. Nós apresentamos aqui o protocolo de passo-a-passo para gerar KaAPC, a abordagem baseada em primeiro talão para a eliminação de células T específicas de antigénios a partir de misturas de células T com especificidades diferentes.

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Figura 3. KaAPC eliminar CTL de uma forma específica para o antigénio marcado com PKH26 activado Fas + CTL efectoras da memória e PKH67-rotulado CTL específica CMVpp65-a partir do mesmo dador foram misturados com uma mistura 1:. Proporção e co-cultivadas com 1 CMVpp65 KaAPC durante 48 h. As culturas de controlo foram tratados com KaAPC descarregado, ou 1 ug / mlsolúvel de anti-Fas-mAb (clone CH11). Perda mínima de células viáveis ​​foi determinado em culturas não tratadas CTL mistos (mistura T). FACS dados originais para cada população CTL da mistura T são mostrados. Análise de apoptose foi realizada como anteriormente publicado por gating separado em ambas as populações de células T 10. Os números representados nos quadrantes superior esquerdo representa% de células totais. A figura ilustra é derivado de uma experiência representativa de três experiências independentes. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Sangue. . Schutz, C. et al assassino células apresentadoras de antigénios artificiais: uma nova estratégia para eliminar as células T específicas de sangue.. 2008; 111, 3546-52. Direitos de autor da Sociedade Americana de Hematologia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Divulgações

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CS e MF não têm nada a revelar.

Sob um acordo de licenciamento entre NexImmune e da Universidade Johns Hopkins, drs. Schneck e Oelke têm direito a ações de royalties recebidos pela Universidade em vendas de produtos AAPC descritos neste artigo. Eles também possuem ações NexImmune, que está sujeita a certas restrições no âmbito da política da Universidade. Dr. Schneck é um membro da companhia "s Conselho de Administração e do Conselho Consultivo Científico. Os termos deste acordo estão a ser geridos pela Universidade Johns Hopkins, de acordo com o seu conflito de políticas de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) e KFO 146 (MF), o Departamento de Defesa DOD concessão PC 040972 (MO) e do Instituto Nacional de Saúde concede SR1 CA108835 , SR1 Ai44129 (JPS)

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PBSCorning21-040-CV
Soro AB humanoAtlanta biológicosS40110
EDTASigma / AldrichE5134
Azida de sódioSigma / Aldrich71289
M-450 contas epóxiInvitrogen / Dynal14011
MPC-1 ímãInvitrogen / Dynal12001D
Frasco de vidro com tampa de roscaFisher Scientific03-338AA
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
anti-CD95 (clone CH11)Milliore05-201
HLA-A2-Ig dímeroBD/Pharmingen551263
Cryo-tube 2 mlCorning430488
anti-mouse IgG1 PEBD/ Pharmingen559320
anti-mouse IgM FITCBD/Pharmingen553408
Cloreto de sódioMerckS271-3
Cloreto de cálcioSigma/AldrichC5080
HEPEScellgro/Mediatech25-060-CI
RPMIgibco/life technologies11875-085
96-well Round placa inferiorFalcon353077
AnnexinV FITCPromoKinePK-CA577-1001-1000
7-AADBD/Pharmingen51-68981E
Tubos FACSFalcon352008

Referências

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