Abstract
La telomerasa, una ribonucleoproteína, es responsable de mantener la longitud de los telómeros y por lo tanto la promoción de la integridad genómica, la proliferación, y la vida útil. Además, la telomerasa protege la mitocondria de estrés oxidativo y confiere resistencia a la apoptosis, lo que sugiere su posible importancia para el sobreviviente de la no-mitótico, las células altamente activos, tales como neuronas. Hemos demostrado previamente la capacidad de los nuevos activadores de telomerasa para aumentar la actividad y la expresión de la telomerasa en las diversas regiones de cerebro de ratón y para proteger a las células neuronas motoras del estrés oxidativo. Estos resultados refuerzan la noción de que la telomerasa está implicado en la protección de las neuronas de diversas lesiones. Para subrayar el papel de la telomerasa en el cerebro, que aquí comparamos la actividad de la telomerasa en el cerebro de ratones macho y hembra y su dependencia de la edad. Ensayo TRAP es un método estándar para la detección de actividad de la telomerasa en varios tejidos o líneas celulares. Aquí se demuestra el anásis de la actividad de la telomerasa en tres regiones del cerebro de ratón por no desnaturalizante de extracción de proteínas utilizando CHAPS tampón de lisis seguido por modificación del ensayo TRAP estándar.
En este ensayo de 2 pasos, la telomerasa endógena se alarga un sustrato específico de la telomerasa (cebador TS) mediante la adición de 6 repeticiones TTAGGG pb (reacción de la telomerasa). Los productos de reacción de telomerasa se amplifican por reacción PCR crear una escalera de ADN de incrementos de 6 pb. El análisis de la escalera de ADN se realizó por electroforesis en gel de agarosa de alta resolución 4,5% seguido de tinción con colorante de ácidos nucleicos altamente sensibles.
En comparación con el ensayo TRAP tradicional que utilizan marcado con 32P radiactivo dCTP de para la detección de ADN y la electroforesis en gel de poliacrilamida para la resolución de la escalera del ADN, este protocolo ofrece un ahorro de ensayo TRAP para evaluar la actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón, lo que demuestra la capacidad de tiempo no tóxica detectar diferencias en telomerasactividad de correo en los distintos región del cerebro del ratón hembra y macho.
Introduction
La telomerasa es una ribonucleoproteína compuesta de la telomerasa transcriptasa inversa (terc), la subunidad catalítica de la telomerasa, y un componente de ARN (TERC). El papel canónica de la telomerasa es preservar la longitud adecuada de los telómeros mediante la adición de secuencias repetitivas (TTAGGG) a los extremos teloméricas, por lo tanto, la promoción de la integridad genómica, y la proliferación celular 1. Funciones adicionales se atribuyeron a de TERT en células, es decir, que confiere resistencia a la inducida por diversos agente que daña el 2 apoptosis, protege a las células madre mesenquimatosas humanas del estrés oxidativo 3, y desempeña un papel pro-supervivencia en neuronas completamente diferenciadas por su asociación a TIA1 ARN positivo gránulos 4.
De TERT se expresa y se activa principalmente en las células somáticas de dividirse y en la mayoría de tipos de cáncer, mientras que los niveles de expresión y actividad de la enzima están estrechamente regulado en las células que no se dividen 5,6. Los estudios han demostrado que en el rOdent cerebro, actividad de la telomerasa se convierte en indetectable por día postnatal 10, mientras que el ARNm de TERT se mantiene a niveles más bajos en la edad adulta 7. Otros estudios demostraron actividad de la telomerasa en la zona sub-ventricular adulto, el bulbo olfatorio, el hipocampo, y en el cerebelo y la corteza adultos 8. Recientemente hemos demostrado que nuevos compuestos que aumentan la expresión y la actividad de la telomerasa en las cuerdas cerebro y la médula ejercen efectos neuroprotectores en N-metil-D-aspartato (NMDA) - ratones inyectados, retrasaron el inicio y la progresión de la enfermedad esclerosis lateral amiotrófica en transgénicos SOD1 ratones y aumentó la supervivencia de las neuronas motoras en la médula espinal de estos ratones 9. Para entender completamente la función pro-supervivencia de la telomerasa en las neuronas y en el cerebro, es esencial para desarrollar un ensayo rápido simple y relativamente sensible para la detección de la actividad de la telomerasa en las diversas regiones del cerebro.
El telomérica rprotocolo de amplificación EPEAT (TRAP) es un ensayo sensible conocida la combinación de la actividad de la telomerasa y canónica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este ensayo, la telomerasa añade TTAGGG repite a un sustrato de telomerasa (TS imprimación) oligonucleótido, seguido de la amplificación por PCR que genera 6 pares de bases (pb) escalera de ADN utilizando el TS cebador inverso -. ACX marcado con 32P dCTP de se utilizan para detectar la baja cantidad de productos de PCR. La escalera de ADN se resolvió por electroforesis en gel de poliacrilamida de secuenciación (PAGE). Tanto la intensidad de las bandas de ADN y la longitud de la escalera de ADN reflejan la cantidad de moléculas de enzimas activas y su procesividad respectivamente 10.
Este ensayo tradicional tiene algunas dificultades importantes: El peligro de la exposición a sustancias radiactivas, grandes y difíciles de manejar PÁGINA secuenciación y el consumo de tiempo de la carrera en gel y exposición de la película del producto radiactivo (durante la noche en ambos casos). Este protocolo ofrece un ensayo de agarosa no radiactivo mejora mini-gel a base. La escalera del ADN 6 pb se resuelve usando gel de agarosa de alta resolución de 4,5% y la detección se logra utilizando colorante de ácidos nucleicos altamente sensibles. La combinación de alta resolución de agarosa usando mini-gel y tinción de ácido nucleico sensible ofrece fácil de manejar ensayo, elimina los peligros de la exposición a la radiactividad y se reducirá considerablemente la duración total del ensayo de 3 días a varias horas.
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Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la experimentación con animales en la Universidad Ben-Gurion (IL-39-08-2010).
1. ratón Cerebro Proteína Extracción
- Preparar 3 tubos de 15 ml cada una que contienen tubos de 5 ml de solución de Ringer y colocar en hielo.
- Sacrificar el ratón usando anestesia isoflurano (PRECAUCIÓN - Utilizar campana química) durante 10-20 segundos, seguido por dislocación cervical y decapitación inmediata.
- Retire el cerebro del cráneo y enjuague durante unos segundos con una solución helada de Ringer para evitar daños en el tejido cerebral.
- Usando una cuchilla quirúrgica, separar el cerebelo (CR) y el tronco cerebral (BS) a partir de la corteza frontal. A continuación, separar el cerebelo de cortar el tronco cerebral y el lóbulo frontal (FL) desde la corteza frontal; quitar el bulbo olfatorio del lóbulo frontal. Coloque las regiones 3 cerebrales en los designados tubos de 15 ml.
- Homogeneizar el tejido en cada tubo. Añadir frsolución de Ringer frío hielo carne de manera que cada tubo contiene el mismo volumen y centrifugar durante 7 min a 800 x g.
- Eliminar el sobrenadante y añadir 100 l de tampón de lisis CHAPS a cada tubo. Mezclar bien, haciendo pasar la solución varias veces (~ 10) a través de una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 21, y se incuba en hielo durante 30 min.
- Transferir el contenido de cada tubo a un tubo nuevo micro-centrífuga y centrifugar durante 30 minutos a 13.000 x g. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y determinar la concentración de proteína usando un método previamente establecido. Guardar los extractos de proteína en alícuotas de 10 l a -80 ° C.
2. TRAP ensayo Preparación de los instrumentos, soluciones de reacción, y cálculos de dilución de proteínas
- Preparar número apropiado de tubos de microcentrífuga etiquetados para diluciones de extracto de proteína y tampón de reacción de la telomerasa. Realizar todas pipeteo en el protocolo utilizando puntas con filtro para evitar la contaminación. Descongele las siguientes soluciones en el hielo: mezcla TRAP reacción 10x, primer TS, dNTPs, extractos de agua ultrapura y proteínas (véase la tabla de materiales para reactivos y reactivos concentraciones).
- Diluir la solución del extracto de proteína a una concentración final de 1 g / l usando agua ultra-pura (agua ultrapura).
3. telomerasa Reacción
- Prepare la mezcla de reacción telomerasa añadiendo lo siguiente a un tubo de micro-centrífuga: mezcla 2 l TRAP (10x), 1 l TS imprimación (0,1 mg), 1 mu l dNTPs (10 mM) y 15 l de agua ultrapura. Para múltiples muestras, multiplicar los volúmenes mencionados por el número de muestras, más 1.
- Añadir 19 l de la mezcla de reacción a cada tubo de reacción y añadir 1 l de extracto de proteína diluida (1 mg proteínas) a cada tubo para un volumen final de 20 l.
- Colocar los tubos de reacción en un baño de agua pre-calentada 30 ° C durante 45 min.
4. PCR Reacción
- Quince millasn antes de la final de la reacción de la telomerasa, descongelar las siguientes soluciones: imprimación ACX, Titanium Taq Buffer, agua ultrapura.
- Prepare la mezcla de reacción de PCR añadiendo lo siguiente a un tubo de micro-centrífuga: 2.5 l Titanium Taq Buffer (10x), 1 l imprimación ACX (0,1 mg), 2 l de agua ultrapura (1 l cuando se utiliza IC) y 0,5 l Titanium Taq Polimerasa (50x). Para múltiples muestras, multiplicar los volúmenes mencionados por el número de muestras más 2.
- Añadir 6 l de la mezcla de PCR a cada tubo de PCR y añadir todo el volumen de la reacción telomerasa (20 l) a cada tubo para un volumen final de 26 l.
- Inserte los tubos de PCR a un termo termociclador PCR y ejecutar el siguiente programa:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C - 30 seg. *
- 60 ° C - 30 seg. *
- 72 ° C -. 45 segundos *
- 72 ° C - 2 min.
Guarde los productos de PCR a -20 ° C.
* = 34 ciclos
5. agarosa Mini-gel Preparación, Ejecución de muestras, y Gel de tinción
- Añadir 25 ml de tampón de electroforesis enfriada (TBE) y una barra de agitación a un vaso de precipitados que es 2-4 veces el volumen de la solución tampón y espolvorear lentamente en 1.125 g de la alta resolución (HR) de polvo de agarosa, mientras que la solución se agitó rápidamente . Retire la barra de agitación, cubrir el vaso con un envoltorio de plástico y perfore en un pequeño agujero para ventilación. Calentar el vaso en el microondas a potencia "baja" durante 3 minutos y luego cambiar a energía "Alto" y calentar la solución en pulsos cortos con cuidado de no causar derrames. Tenga en cuenta que cuando la espuma creada por calentamiento se convierte en burbujas grandes y desaparece después de unos segundos, la agarosa está listo.
- El gel fundido a un aparato de mini-gel horizontal, después de que el gel se solidifica a temperatura ambiente permiten que el gel se enfríe durante 20 min a 4 ° C antes de su uso.
- Cargue cada carril con 25 l de muestra TRAP (20 l TRAP productos de PCR y 5 l 6x tinte de carga de gel) y correr a las 110 V durante 3 horas en un cuarto frío 4 ° C.
- Preparar 3x colorante de ácidos nucleicos solución de trabajo mediante la adición de 15 l 10,000x de ácido nucleico mancha, solución madre de 50 ml de agua bidestilada (DDW) con NaCl 0,1 M (0,29 g). Manchar el gel durante 20 min con agitación suave.
- Utilice transiluminador UV con longitud de onda de 302 nm para ver las bandas de ADN escalera TRAP.
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Representative Results
Extractos de proteínas de células enteras se han preparado desde el lóbulo frontal (FL), el tronco cerebral (BS) y el cerebelo (CR), derivado de 3 mujeres y 3 CD-1 ratones macho-1 CD en las edades de 1 y 3 meses de edad para la ensayo TRAP modificado y 3 CD-1 ratones machos a la edad de 2 meses de edad para el ensayo TRAP radiactivo. Actividad de la telomerasa se detectó en 1 mg de extracto de proteínas usando el ensayo TRAP modificado y 2 mg extracto de proteínas para el ensayo TRAP radiactivo. La detección de actividad de la telomerasa mediante el ensayo TRAP radiactivo y por el ensayo TRAP modificado muestra que una mejor visualización y resolución de los productos de ADN de telomerasa se observa con el ensayo modificado como se ve por la longitud y la intensidad de la escalera de ADN (Figura 1A 1C vs y 1D). Se observa una reducción gradual de los productos de ADN de la telomerasa, cuando la disminución de las concentraciones de extractos de proteínas, derivadas de glioblastoma línea celular U-251, se utilizó suggepicar la sensibilidad del método de ensayo TRAP modificado para la detección de la actividad de la telomerasa en concentraciones más bajas de las proteínas del extracto (Figura 1B).
Una actividad de la telomerasa significativamente más alta se observa en las regiones FL y BS en comparación con el Cr en 3 meses de edad hembras y machos como se revela por la intensidad de las bandas de ADN y la longitud de la escalera de productos de ADN. Además, se muestra que durante la transición del ratón en la edad adulta de actividad de telomerasa aumentos en el FL y disminuye en la BS y CR (Figura 1D). Comparación entre los sexos demuestra que en la actividad de la telomerasa FL es mayor en las mujeres, en contraste con el BS y CR que muestran una mayor actividad de la telomerasa en los hombres.
En los tejidos que expresan niveles bajos de actividad de la telomerasa se ha encontrado que la detección de la escalera de ADN mediante PCR es más eficiente sin utilizar el control interno (IC) del cebador, ya que la IC utiliza el TS como un cebador directo interfiriendo así con la amplificación de ADN escalera. La reproducibilidad de los datos se logra repitiendo cada experimento varias veces.
Figura 1 Actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón: Tradicional contra ensayo TRAP modificado. A) Actividad de la telomerasa en 3 regiones del cerebro analizada por ensayo TRAP radiactivo (2 meses de edad ratones CD-1 machos, extracto de 2 mg proteínas). B) La sensibilidad del ensayo TRAP modificado se muestra por la disminución de las concentraciones de las proteínas de extracto derivado de glioblastoma U -251 célula de la línea. C, D) Actividad de la telomerasa en 3 regiones del cerebro de meses de edad CD-1 hembra y ratones macho 1 (C) y 3 (D). La escalera de ADN comienza a la banda de 50 pb con incrementos de 6 pb. (NC - control negativo, IC- interno de control, BS - tronco cerebral, CR - cerebelo, FL - lóbulo frontal).
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Discussion
Análisis de la actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón a través de la trampa de ensayo consiste en 4 pasos principales: 1) proteínas de extracción a partir de regiones específicas del tejido cerebral 2) TS de elongación de iniciador de telomerasa por - reacción de la telomerasa 3) amplificación de los productos de reacción de telomerasa mediante PCR 4 ) separación de los productos de PCR usando gel de agarosa de alta resolución.
Este ensayo TRAP modificado aborda dos grandes dificultades que se elevan desde el ensayo tradicional: el uso de radiactivos de dCTP para la detección sensible de los productos y PÁGINA PCR separación de la escalera del ADN. De alta resolución en gel de agarosa simplifica la detección de los productos de reacción de telomerasa (la escalera de ADN) en comparación con el disco para manejar PÁGINA secuenciación. Además, la tinción de ácido nucleico es una solución no tóxica con alta sensibilidad necesaria para la detección de la pequeña cantidad de ADN.
Especial atención debe darse a los siguientes pasos críticos: 1) Manteniendo el tiempo entre la extracción de tejido y la homogeneización a un mínimo para preservar la integridad de la proteína 2) CHAPS lisis recongelación tampón debe ser evitada 3) extractos de proteínas deben mantenerse en alícuotas y se descongelaron una vez antes de su uso. Evite volver a congelar las muestras.
Los problemas pueden ocurrir durante la etapa de preparación de gel desde gel de agarosa de alta concentración es propenso a desbordamiento y requiere mucha atención durante la cocción. La técnica tiene varias limitaciones con la necesidad de ejecutar el gel en una habitación fría. Además, la baja cantidad de productos de PCR no se puede ver en una tabla UV.
Nivel de actividad de la telomerasa varía entre los diferentes tejidos y se considera que es baja en el cerebro. Este protocolo ofrece un método de detección más sensible, en comparación con el ensayo radiactivo tradicional permitiendo una mejor detección de la actividad de la telomerasa en el cerebro. Aunque diferentes métodos eficientes en tiempo están disponibles (kits de ensayo TRAP un solo paso, utilizando un labeled imprimación para la detección TS) estos métodos son mucho más caros. Por otra parte, el uso de agarosa elimina el riesgo de toxicidad de la utilización de gel de poliacrilamida.
Como se revela a partir de los resultados representativos, utilizando el método descrito anteriormente, es posible demostrar las diferencias en los niveles de actividad de la telomerasa entre las diversas regiones del cerebro y entre macho y hembra. Este método puede ser utilizado para la detección de actividad de la telomerasa en otros tejidos normales con baja actividad de la telomerasa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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