Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil In Vitro

Resumo

Este protocolo descreve o uso de braços de suporte de silicone em micro-como as superfícies de cultura maleáveis ​​para a medição da contractilidade de células do músculo in vitro. Contração celular provoca flexão cantilever, que pode ser medido, registrado, e convertido em leituras de força, proporcionando um sistema não invasivo e escalável para medir a função contrátil in vitro.

Resumo

O desenvolvimento de ensaios in vitro preditivos e mais biologicamente relevantes baseia-se o avanço dos sistemas de cultura de células versáteis que facilitam a avaliação funcional das células semeadas. Para esse efeito, a tecnologia cantilever microescala oferece uma plataforma com a qual a medir a funcionalidade contráctil de uma gama de tipos de células, incluindo esquelético, cardíaco e células de músculo liso, através da avaliação da contracção induzida substrato flexão. Aplicação de matrizes cantilever multiplexados fornece os meios para o desenvolvimento moderado a protocolos de alto rendimento para a avaliação da eficácia do fármaco e toxicidade, o fenótipo da doença e progressão, assim como neuromusculares e outras interacções célula-célula. Este manuscrito apresenta pormenores para a fabricação de matrizes de cantiléver fiáveis ​​para este fim, e os métodos necessários para células em cultura com sucesso sobre estas superfícies. Descrição mais detalhada é fornecida sobre as medidas necessárias para realizar anal funcionalysis de tipos de células contrátil mantida em tais matrizes, utilizando um novo sistema de laser e foto-detector. Os dados representativos fornecidos destaca a precisão e a natureza reprodutível da análise da função contráctil possível usar este sistema, bem como a grande variedade de estudos para que tal tecnologia pode ser aplicada. Ampla adoção bem sucedida deste sistema poderia fornecer aos investigadores os meios para realizar estudos de baixo custo rápidas e funcionais in vitro, levando a previsões mais precisas do desempenho do tecido, o desenvolvimento da doença ea resposta ao tratamento terapêutico romance.

Introdução

A cultura in vitro de células musculares de fontes humanas e de roedores é possível há décadas^1,2. No entanto, embora as preparações de lamínula padrão sejam úteis para avaliação bioquímica, elas não facilitam a análise da saída funcional primária da célula (contratilidade) e, portanto, são de valor um tanto limitado como meio de avaliar a maturação e o desempenho celular. Para maximizar a quantidade de dados obtidos a partir de tais culturas in vitro, é necessário avançar no desenvolvimento de sistemas capazes de abrigar essas células em configurações que permitam a avaliação em tempo real de seu desempenho funcional. O estabelecimento de....

Protocolo

1. Cantilever Chip Fabrication

Pormenores ilustrados das etapas de fabricação descritos são proporcionados na Figura 1.

1. Coloque wafers de silício sobre isolante (SOI) em um forno e leve ao forno a 125 ° C por 20 min para desidratar-los.
2. Deposite um 1,5 um espessa camada de óxido de silício na camada alça do wafer SOI desidratado usando um Plasma avançado Chemical Vapor Deposition (PECVD) ferramenta.
3. Coloque a bolacha sobre a rotação do mandril com a camada de revestimento do dispositivo virada para cima. Certifique-se de bolacha é centrado, dispensar 2 ml de P20 iniciador no centro da bolach....

Resultados

Cultura bem sucedida de células contrácteis em cantiléver é um procedimento relativamente simples, utilizando técnicas padrão de cultura de células (Figura 5). A percentagem de consolas de apoio células contratantes irá variar dependendo do tipo de célula que está sendo examinado e técnica de cultura específica empregada. Usando células embrionárias primárias derivadas de rato membros posteriores, actividade contráctil foi detectada em 12% das consolas analisados ​​(n = 4). Análise da função contrátil u.......

Discussão

Os passos críticos na análise de microescala consolas para a evidência de contracção celular são o posicionamento do braço de suporte do chip dentro da platina do microscópio e do subsequente alinhamento do laser e foto-detector, com a ponta dos braços de suporte de canto na matriz. Se isso não for feito de forma precisa, em seguida, o software não será capaz de extrapolar as posições das restantes consolas na matriz, potencialmente levando ao acúmulo de falsos negativos durante a coleta de dados. Os operadores devem te.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			de crescimento muscular primário de rato
Meio neurobasal	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
suplemento G5	Life Technologies	17503-012	1x
Derivado de Glial Fator Neurotrófico	Ciências celulares	CRG400B	20 ng/ml
Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro	Ciências celulares	CRB600B	20 ng/ml
Fator Neurotrófico Ciliar	Ciências celulares	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrofina-3	Ciências celulares	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrofina-4	Ciências celulares	CRN501B	20 ng/ml
Fator de Crescimento de Fibroblastos Ácidos Life Technologies		13241-013	25 ng/ml
Cardiotrofina-1	Ciências celulares	CRC700B	20 ng/ml
Sulfato de Heparina	Sigma	D9809	100 ng/ml
Fator Inibidor de Leucemia	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectina	Sigma	V0132	100 ng/ml
			primário de diferenciação muscular de rato
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipamento
Laser de diodo vermelho Classe 2	Newport
Fotodetector	Industries
Modelo 2100 Pulso estimulador	Sistemas A-M
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments
Patch clamp microscópio e palco	Olympus
Delta T4 controlador de prato de cultura	Bioptechs
Software de axoscópio	Dispositivos moleculares
Software LabVIEW	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubadora	NAPCO
Classe 2 capela de fluxo microbiológico	Labconco
Pipetas e ponteiras	Eppendorf