Abstract
Den fremmedlegeme reaksjon oppstår når et syntetisk overflate innføres i kroppen. Den er karakterisert ved adsorpsjon av blodproteiner og den påfølgende feste og aktivering av blodplater, monocytt / makrofag adhesjon, og inflammatorisk cellesignale hendelser, som fører til post-komplikasjoner. Chandler Loop Apparatus er et eksperimentelt system som tillater forskere å studere de molekylære og cellulære interaksjoner som oppstår når store mengder blod er perfused over polymere rør. For dette formål, har denne anordning blitt brukt som en ex vivo-modell tillater vurdering av den anti-inflammatoriske egenskaper av forskjellige polymeroverflatemodifiseringer. Vårt laboratorium har vist at blod rør, kovalent modifiserte via fotoaktivering kjemi med rekombinant CD47, kan konferere biokompatibilitet til polymere overflater. Tillegg av CD47 til polymere overflater kan være et effektivt middel for å fremme effektiviteten av polymere blodledninger. HennesEin er metodikken detaljering fotoaktivering kjemi som brukes til å føye rekombinant CD47 til klinisk relevante polymere blodledninger og bruken av Chandler Loop som en ex vivo-forsøksmodell for å undersøke blod interaksjoner med CD47 modifisert og styreledninger.
Introduction
Mange kliniske prosedyrer, slik som kardiopulmonal bypass og renal dialyse, krever bruk av polymere blodledninger og er ofte forbundet med post-komplikasjoner en. Når perfundert med blod, disse polymerer illegale fremmedlegemet reaksjon (FBR), som resulterer i adsorpsjon av blodproteiner og blodplater, monocytter / makrofager heft, og utgivelsen av proinflammatoriske cytokiner, som alle bidrar til post-prosessuelle komplikasjoner og / eller enhetsfeil 2,3. Dermed strategier for å løse dette problemet fortsatt være en viktig og pågående område av biomaterialer forskning. Etterforskerne har forsøkt å løse dette problemet ved å endre blod kontakte flater med bioaktive eller bioinert molekyler 4-6. Forskning i vårt laboratorium har fokusert på å legge rekombinant CD47 (recCD47) til polymere biomaterialer som en strategi for å redusere FBR og øke effekten av disse materialene. CD47 er en ubiquitously uttrykt transmembrane protein med en kjent rolle i immununndragelser, overdragelse "selv" status ved å uttrykke celler 7-10 og show lover ved overdragelse biokompatibilitet når lagt til polymere overflater 11-13. Signal-regulatorisk protein alfa (SIRPα), den kognatreseptoren for CD47, og et medlem av immunoreceptor tyrosin baserte hemmende motiv (ITIM) -holdig familie av transmembrane proteiner, uttrykkes på celler av myeloid opprinnelse 14. Vi har tidligere vist at CD47, via SIRPα-mediert celle signalering, nedregulerer immunresponsen til polyuretan (PU) og polyvinylklorid (PVC) i in vitro, ex vivo, og in vivo-modeller 11-13.
Sentralt i våre undersøkelser er en relativt ny fotoaktivering kjemi, som her er beskrevet, i hvilken kjemisk reaktive tiolgrupper er kovalent føyes til polymere rør ved omsetning av slangen med en multifunksjonell polymer (PDT-BzPh), som består av 2-pyridylditio (PDT), den fotoreaktiv benzofenon (BzPh) og en karboksy-modifisert polyallylamin 11-13. Reduksjon av de kovalent vedføyde PDT grupper med tris (2-karboksyetyl) fosfin-hydroklorid (TCEP) 11 gir en tiolerte overflate som kan være omsettes deretter med terapeutiske grupper. Detaljert heri tidligere og 12,13, recCD47, ytterligere modifisert ved tilsetning av et C-terminale poly-lysin halen 12,13, blir reagert med sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cykloheksan-1-karboksylat (sulfo-SMCC) i 1 time for å gi tiol-reaktive grupper, slik at for et monosulfid bindingsdannelse mellom slangen og recCD47 11. Den anti-inflammatoriske kapasiteten til CD47 funksjonaliserte overflater ble testet, ex viv o, ved hjelp av Chandler sløyfe-apparatur med humant fullblod, som opprinnelig ble beskrevet i 1958 som en in vitro modell av trombotisk 15 koagulasjon. Anordningen er avhengig av enlukkede rør-systemet delvis fylt med luft, og en roterende motor for å sirkulere blodet gjennom slangen 15.. Denne eksperimentelle modellen gir mulighet for å undersøke effekten av blod eksponering ved modifiserte og umodifiserte overflater, så vel som effekten av disse overflatemodifiseringer på fysiologien av celler i blod.
recCD47 kan legges til et utvalg av polymere overflater ved hjelp av denne fotoaktivering kjemi, og dens anti-inflammatorisk kapasitet kan bli vurdert ved å anvende en klinisk relevant ex vivo modell ligne blodperfusjon i løpet av polymere overflater 11,12. Kliniske karakterblodledninger modifisert med recCD47 viser vesentlig mindre blodplater og inflammatorisk cellefesting i forhold til ikke-modifiserte polymerer når de utsettes for menneskeblod i anordningen. En trinn-for-trinn-beskrivelse av denne endringen prosessen er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. modifisere Polymer Overflater med recCD47
MERK:. Protokollen er oppsummert skjematisk i Figur 1 Figur 1A illustrerer generasjon av tiol-reaktiv polymer overflater Figur 1B illustrerer generasjon av tiol-reaktivt recCD47..
- Dag 1
- Tilbered en løsning av PDT-BzPh (1 mg / ml) og kaliumbikarbonat (KHCO 3) (0,7 mg / ml) i sterilt vann. Omrør over natten ved 4 ° C (beskytte mot lys).
- Dag 2
- Skjær polymere slangen inn 40 cm lange biter (lenge nok til å passe rundt roterende hjul).
- Suge-rør i en 0,1% vandig løsning av hexacylpyridinium i 90 minutter ved romtemperatur på en riste eller på Chandler sløyfe-apparatur. Vask rørene med sterilt vann 3x etter 90 min suge.
- Surgjøre løsningen for PDT-BzPh fra dag 1 ved tilsetning av 15% vandig kaliumfosfat, monobasisk (KH 2 4). Tilsett 50 mL KH 2 PO 4 per ml av PDT-BzPh, som danner en uklar micelle-løsning.
- Bløt rørene i det surgjorte PDT-BzPh løsning i 40 minutter ved romtemperatur på en riste eller på anordningen.
- Vask rørene med fortynnet eddiksyre (1: 1,000) en gang.
- Expose rørene til UV-bestråling for en samlet varighet på 60 min. Roter rørene ¼ slå hver 15 min å bestråle hele areal.
- Sug rørene i en løsning av 20 mg / ml kalium-bikarbonat (KHCO 3) i 20 min ved værelsestemperatur på en riste eller på anordningen.
- Vask rørene med sterilt vann 3x og oppbevares ved 4 ° C i sterilt vann.
- Dag 3
- Oppløse 5 mg Sulfo-SMCC i 200 mL dimetylformamid (DMF) (OBS: Utfør i avtrekksskap).
- Tilsett 50 pl av Sulfo-SMCC oppløsning fremstilt i trinn 1 til 0,1 mg / ml recCD47 poly-lysin løsning, og omrør i 60 min ved roOM temperatur.
- I løpet av 60 min oppsikt, Degas sterile Dulbeccos Fosfatbufret Saline (DPBS) og sett til side.
- Rens Sulfo-SMCC reagerte recCD47 bruker en 7K molekylvekt cut-off spin avsalting kolonne henhold til produsentens anvisninger. Samle endelige gjennomstrømning (høy kvalitet, tiol-reaktiv recCD47) og fortynn til et volum som er nødvendig for å belegge innsiden av røret med DPBS.
- Skyll rørene fra dag 2 med sterile, degassed DPBS 3x.
- React den modifiserte overflaten av rørene med en oppløsning av 20 mg / ml med tris (2-karboksyetyl) fosfin-hydroklorid (TCEP) i avgassede DPBS for mindre enn 2 min. Skyll rørene med sterile degassed DPBS 4x.
- Tilsett Sulfo-SMCC-reagert recCD47 til rørene og inkuber over natten ved 4 ° C på en rister eller på anordningen.
2. Immunoassay Kvantifisering av recCD47 på modifisert Overflater
- Skyll modifiserte rør som skal kvantifiseres fra Dag 3 viddh DPBS 3x. Oppbevar rør ikke brukt for kvantifisering i DPBS ved 4 ° C.
- Bruk en 4 mm biopsi slag for å gjøre dupliserte glassprøver, og plassere biopsi slag i brønner i en 96-brønns plate.
- Tilbered en negativ kontroll bestående av en ikke-modifisert t-prøven ikke er behandlet med den påvisningsantistoff. Tilbered en antistoff-kontroll bestående av en ikke-modifisert t-prøve som ble behandlet med påvisningsantistoff. Forbered de modifiserte rør stikkprøvene som ble behandlet med påvisning antistoff.
- Blokk prøver med 0,4% bovint serumalbumin (BSA) i DPBS i 60 minutter ved romtemperatur på en riste.
- Etter blokkering, aspirat BSA og skyll med tris-bufret saltvann plus 1% Tween-20 (TBST) 3 ganger, 10 minutter hver på en shaker.
- Forbered en fungerende utvanning av antistoff i 0,4% BSA i henhold til produsentens anbefalte fortynning for immunologiske analyser. Fortynne human CD47 Antibody B6H12-FITC 1: 100 i 0,4% BSA.
- Tilsett 200 pl av antistoff-fortynningen til hensiktsmessige brønner. Incubate negative kontroller med bare 0,4% BSA. Inkuber ved romtemperatur i 60 min på en rister (beskytte mot lys).
- Skyll med TBST 3x, 10 min hver på en shaker. Aspirer siste TBST skylling og tilsett 200 mL DPBS til rør prøvebrønner.
- Samle den endelige gjennomstrømning, som er av høy kvalitet tiol-reaktiv rekombinant CD47 og fortynn til et volum som er nødvendig for å belegge innsiden av rørene med DPBS.
- Les FITC signalintensitet ved hjelp av en mikroplateleser med FITC eksitasjon (485 nm) og utslipp (538 nm) innstillinger.
- Beregn recCD47 bundet til polymeroverflaten basert på standardverdier, står for auto-fluorescens og ikke-spesifikk binding fra kontrollprøven antistoff.
3. Chandler Loop Apparatus Protocol
Oppsøk Institutional Review Board (IRB) godkjenning av blodprøvetaking protokollen og informert samtykke papirene før oppstart av innsamling av humane blodprøver. Få infoRMED samtykke fra en menneskelig blod donor.
MERK: En diagram som viser anordningen er vist i figur 2.
- Fyll vann-bad med destillert vann til omtrent 1/2 av diameteren hjulene er neddykket. Tilsett nok blekemiddel i vannbad for å lage en 10% blekemiddel. Sett vannbad til 37 ° C og la temperaturen til likevekt.
- Samle metall adaptere (vist i figur 1B), umodifisert og modifisert slange rør, og montere rundt apparatutførelse, slik som vist i figur 1C. Sørg for at slangen passer snuggly rundt hjulet med metall adapteren på plass.
- Innhent 30 ml blodprøve ved hjelp av en IRB-godkjent protokoll, i en ampulle fylt inn med 2 ml citrat eller andre antikoagulant, og bland ved inversjon for å hindre clotting når prøven er innsamlet.
- Tilsett ca 10 ml blod til hvert rør ved hjelp av metallventil og sprøyten, slik at noe luft i røret. Fest ventilhetten og rRoter med 3 timer.
- Drenere blodet i en avfalls beger behandlet med en 10% blekemiddel (eller som kreves av institusjonell policy).
- Forsiktig skylle slangen interiør med DPBS å fjerne alle spor av blod. Samle gjennomstrømning i avfallsbegerglass. Kvitt deg med blod i samsvar med institusjonelle politikken.
- Desinfiser apparater og blod kontakte overflatene med en 10% blekemiddel eller i henhold til institusjonelle politikken.
- Prosessprøver for fluorescerende mikroskopi eller scanning elektronmikroskopi som beskrevet nedenfor.
4. Fluorescent Mikros og celletelling
- Forbered en 4% paraformaldehyde (PFA) løsning (Advarsel: Utfør i avtrekksskap).
- Inkuber rør i en 4% PFA-løsning over natten ved 4 ° C.
- Etter over natten inkubasjon fjerne 4% PFA og skyll filmer veldig forsiktig med DPBS.
- Kutt slangen inn i seksjoner for å avsløre lumen overflate for farging.
- Stainen seksjon av rør med noen få dråper av monterings media med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 30 min ved romtemperatur (beskytte mot lys). Etter flekker, skyll slangen veldig forsiktig med DPBS å redusere bakgrunns DAPI signal.
- Bilde ved hjelp av et fluorescerende mikroskop utstyrt med en DAPI filter og digitalt kamera til å telle antall celler i 9 blindt utvalgte synsfelt henhold 200X forstørrelse.
- Record celle teller per synsfelt og utføre egnede statistiske analyser for å fastslå statistisk signifikans av resultatene.
5. Scanning elektronmikroskopi
- Forbered en 2% glutaraldehyd løsning (Advarsel: Utfør i avtrekksskap).
- Inkuber rør i en 2% glutaraldehyd-løsning over natten ved 4 ° C.
- Etter over natten inkubasjon forsiktig skylle slangen 3x med DPBS.
- Forbered en 1% løsning av osmiumtetroxyd (Advarsel: Alvorlig risiko ved innånding! Bruk i avtrekksskap).
- Inkuber rør i en 1% løsning av osmiumtetroksyd i 15 min ved romtemperatur.
- Forsiktig skylle slangen 3x med DPBS.
- Tilbered en serie av etanolkonsentrasjon (25%, 50%, 75%, 95% og 100% etanol).
- Dehydrer slangen ved inkubasjon i serien av etanolkonsentrasjoner. Inkuber i 25%, 50%, 75% og 95% etanol i 20 minutter hver. Inkuber i 100% etanol i 30 min.
- Superkritisk punkt tørke slangen med CO2 i 45 min for å fjerne all fuktighet.
- Mount tube seksjoner på et eksemplar spire med sølv lim eller grafitt.
- Frakk tube seksjoner med 12,5 nm gull-palladium.
- Undersøk i et scanning elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av tiol-reaktive polymere overflater ved bruk av PDT-BzPh og TCEP sammen med tiol-reaktive recCD47 poly-lysin ved hjelp av SMCC gir mulighet for feste av recCD47 til polymere overflater. Modifikasjonsprosessen er oppsummert skjematisk i figur 1. Nytten av denne modifikasjon prosessen er at den kan brukes til mange forskjellige proteiner og mange forskjellige polymere overflater, forutsatt at proteinet kan bli modifisert med tilstrekkelig kjemisk reaktive grupper som for eksempel amin-inneholdende og lysines at polymeren har tilstrekkelig tilgjengelige hydrokarboner.
Det er vist tidligere at recCD47 kan legges til polymere overflatene med denne protokollen 11-13. Som vist i figur 3A, er betydelig FITC flekker synlig for recCD47, ved hjelp av et FITC-konjugert antilegeme til det ekstracellulære Ig-domene av CD47, som er lokalisert spesifikt til filmen som vist ved DIC avbildning(Figur 3B). Disse resultater viser at recCD47 kan være kovalent bundet til polyuretan-filmer. Måling av de fluorescerende enheter, og å sammenligne med en standardkurve bestemmes konsentrasjonen av overflate bundet recCD47. Vi har vist at recCD47 kan legges til polymere overflater på nivåer over 500 ng / cm 2,11-13. Disse resultater bekrefter at denne tiol-basert polymer modifikasjon protokollen kan brukes for å tilføye poly-lysin-modifiserte rekombinante proteiner til polymere overflater.
CD47 er blitt vist å være en markør for "self", hindrer inflammatorisk celleadhesjon og aktivering av immunsystemet 7-13. For å etterligne in vivo forhold så tett som mulig i et ex vivo miljø, kan humant fullblod blir perfusert gjennom umodifisert og modifisert polymerisk rør i Chandler sløyfe-apparat (vist i figur 2). Celleadhesjon til røret kan bli vurdert via DAPI farging (
Figur 1. Skjematisk av overflatemodifisering. A) tiolert polymer overflater ble samlet ved inkubering av polymeroverflaten med photoactivatable tverrbinder PDT-BzPh og påfølgende reduksjon med TCEP. B) </ Strong> SMCC ble brukt til å produsere tiol-reaktive recCD47, som deretter ble omsatt med det tiolerte syntetisk overflate for å gi recCD47 funksjonaliserte overflater.
Figur 2. Diagram av Chandler Loop Apparatus. B) Anordningen består av et vannbad oppvarmet til 37 ° C, roterende hjul festet på en metallstang festet til en rotasjonsmotor. Dette oppsettet gjør det mulig for den roterende motor for å slå hjul, og derved blir oppslukt partier av produksjonsrøret inn i 37 ° C vannbad og perfusjon av blod gjennom slangen. B) Metall adaptere blir brukt til å koble endene av rør som danner en sløyfe rundt en av de roterende hjul. Blod blir tilsatt til rørene gjennom metallventilporten og avsluttes med ventillokket. C) Etter sammensetning bør slangen og metallventil passe snuggly around det roterende hjul, som er vist her med et tomt rør.
Figur 3. Quantization av recCD47 på polyuretan filmer. Antistoffer rettet mot det ytre Ig-domenet av CD47 ble anvendt for å kvantifisere mengden av recCD47 bundet til polyuretan-filmer. Fluorescerende mikroskop bilder tatt under 200X forstørrelse med passende filter sett viser FITC deteksjon av recCD47 vedlagt polyuretan (A). (B) DIC-bilder viser at FITC-signalet er spesifikk for polyuretanfilm.
Figur 4. Cell vedheft til umodifisert og recCD47-modifisert polyuretan. Hele menneskeblod ble samlet inn og perfused over uendret eller recCD47-modifisertPU filmer 3 timer. Etter 3 timers perfusjon, ble filmene skylt med DPBS, og det adherte celler ble fiksert med 4% PFA over natten ved 4 ° C og DAPI farget i 30 minutter ved romtemperatur. DAPI-fargede cellene ble talt ved hjelp av et fluorescerende mikroskop etter 200X forstørrelse og egnede filter sett. (A) 9 tilfeldig utvalgte synsfelt ble talt for hver endring. (B) data er representative for 9 synsfelt og er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil (p = 0,004).
Figur 5. SEM analyse av recCD47 endret og kontrollflater følgende ex vivo analyse. Menneskelig helblod ble oppsamlet og perfundert i løpet av umodifisert eller recCD47-modifiserte PVC-rør i 3 timer. Representative bildene viser betydelig celle vedlegg til unmodified overflater mens recCD47-modifiserte overflater viser bare en og annen vedlagt celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fotoaktivering kjemi (oppsummert i figur 1) gir mulighet for endring av praktisk talt alle polymer overflate som har tilstrekkelige hydrokarboner å forenkle PDT-BzPh vedlegg og påfølgende UV bestråling til foto-aktivere PDT-BzPh. Funksjonalisepolymeroverflaten med reaktive tiolgrupper muliggjør den påfølgende binding av en rekke testbare molekyler av interesse. I våre spesielle studier valgte vi rekombinant CD47 11-13. Den spesielle konjugering kjemien at vi brukte involverte reaksjonen av protein er amingrupper med det bifunksjonelle kryssbindings SMCC 11-13. Dette ga tiol-reaktive recCD47 for den etterfølgende reaksjon med den tiolerte polymere overflate. Sluttproduktet var en mono-sulfid linkage kovalent binding av recCD47 til polymer. For å sikre at amingruppene fra aminosyrene i CD47 ikke ble brukt for reaksjonen, og derved dempe effektenav det immobiliserte CD47, vi videre modifisert recCD47 ved innsetting av en poly-lysin tag på protein C-terminus. Det ville være mulig at en lignende molekyl strategi kan bli anvendt med andre proteiner. Dermed konjugering kjemi presenteres her og andre steder 11-13 gir en viktig anledning til å vurdere muligheten av potensielt terapeutiske molekyler til å konferere biokompatibilitet på syntetiske overflater.
En ulempe ved denne protokollen er at å utsette visse typer av polymerer, som for eksempel polyuretan, til lengre perioder UV-bestråling kan føre til misfarging. Dette kan unngås ved å plassere polymeren i polystyren-retter (som vanligvis brukes i vevskultur) for å unngå misfarging av polymeren uten å hindre fotoaktivering av PDT-BzPh. Bølgelengden av UV-lys brukt i denne protokollen er 302 nm; avvik fra denne bølgelengden kan resultere i ineffektiv foto-aktivering av PDT-BzPh. Hvis du bruker en annen bølgelengdeUV-lys, er nødvendig for optimalisering av UV-eksponeringstiden for å sikre betydelig foto-aktivering.
Etter denne protokollen tillater feste av recCD47 til polymere overflater, for det formål å immunsvik og formidle "selv"-status til polymeroverflaten for å hindre at fremmedlegemer reaksjonen. Kvantifisering av recCD47 føyd til overflaten er gjennomført ved hjelp av et FITC-merket antistoff til Ig-domenet av CD47 ved hjelp av en immunologisk måling og fluoriserende mikroskopi (figur 3). Denne metodikken kan tilpasses andre proteiner vedlegges polymere overflater forutsatt antistoff tilgjengelighet. Unnlatelse av å oppnå betydelig vedheng recCD47 (eller andre protein) kan skyldes en rekke faktorer, inklusive, manglende photoactivate PDT-BzPh, utilstrekkelige frie hydrokarboner på polymeroverflaten, hydrofobisitet av polymeroverflaten, eller polymeren kan være for tykt eller ugjennomsiktig å la lyset passere gjennom for tilstrekkelig quantificasjon. Alle disse variablene kan eksperimentelt testet og optimalisert for en bestemt polymer.
Den Chandler sløyfe-apparat er et unikt verktøy for ex vivo analyse av humant fullblod eksponering for polymere overflater. Dette system ligner tett perfusjon av blod gjennom kliniske blodledninger som brukes i forskjellige medisinske prosedyrer, muliggjør analyse av mange fysiologiske endepunkter assosiert med blodkontaktende overflater. Som fysiologiske endepunkter for vedheng av recCD47 til polymeroverflater, ble celletellinger ved bruk av DAPI farging (figur 4) og scanning elektronmikroskopi (figur 5) brukes. Andre endepunkter kan også benyttes, avhengig av utstyret tilgjengelighet, for eksempel celletall før og etter blod perfusjon gjennom polymere blodledninger kan også brukes. Uansett, recCD47-modifiserte overflater viste signifikant mindre levd celler sammenlignet med umodifisert kontrollflater. Disse daTA foreslår at recCD47 formidler biokompatibilitet til polymere overflater og potensielt kan brukes til å hindre at FBR i kliniske prosedyrer ved hjelp av polymere blod rør.
Selv om dette er en mye brukt in vitro modell for blod perfusjon studier, er det begrenset i noen henseender. De to store ulemper ved denne fremgangsmåte skriver seg fra kravet om å inneholde luft i røret med blodprøven. Den hyppige blod interaksjon med luft kan forårsake leukocytt-og blodplate-aggregering, og proteindenaturering 16-18, noe som kan påvirke visse endepunkter. For det andre gjenstår luften ved det høyeste punkt av kretsen, noe som begrenser hastigheten av blodsirkulasjon 19. Til tross for de åpenbare begrensninger av denne metoden, induserer det mindre blodskader enn konkurrerende metoder 19 og tjener som en metode for screening av potensielle biokompatibilitet biomolekyler på polymere blodledninger. Når kandidat biomolekyler er identifisert gjennomdenne fremgangsmåte, kan oppnås videre analyse ved in vivo dyremodeller. Til slutt, må det biokompatibilitet av modifiserte polymerer for å bli bekreftet ved hjelp av en egnet in vivo-modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi under award nummer R21 EB015612 (SJS), og det nasjonale hjerte, lunge og blod Institute under award nummer T32 HL007915 (JBS og RJL), av National Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D.
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L.
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
