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Artigo de método

Murino Endoscopia para In Vivo Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

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DOI:

10.3791/51875

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26 de agosto de 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital Münster

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Pequenas técnicas de imagem animais permitem exames de diagnóstico de série e intervenções terapêuticas in vivo. Recentemente, o leque de aplicações tem aumentado significativamente e atualmente inclui avaliação do desenvolvimento de tumor do cólon, cicatrização de feridas e monitoramento da inflamação. Este protocolo ilustra essas aplicações potenciais diferentes de endoscopia murino.

Resumo

Modelos de mouse são amplamente utilizados para estudar patogênese de doenças humanas e para avaliar os procedimentos de diagnóstico, bem como intervenções terapêuticas pré-clínicos. No entanto, a avaliação válida de alterações patológicas, muitas vezes requer análise histológica, e quando realizado ex vivo, necessita de morte do animal. Portanto, em situações experimentais convencionais, exames de acompanhamento intra-individuais são raramente possível. Assim, o desenvolvimento de endoscopia de murino em ratinhos vivos investigadores permite pela primeira vez a ambos visualizar diretamente a mucosa gastrointestinal e também repetir o processo para a monitorização de alterações. Existem inúmeras aplicações para in vivo murino endoscopia, incluindo estudar inflamação intestinal ou cicatrização de feridas, a obtenção de biópsias da mucosa repetidamente, e localmente administrar agentes de diagnóstico ou terapêuticos em uso de cateter de injeção em miniatura. Mo de diagnóstico por imagem, mais recentemente, a imagem molecular tem estendidodalidades permitindo a detecção específica de moléculas alvo específicas distintas, usando as fotossondas. Em conclusão, a endoscopia murino surgiu como uma nova tecnologia de ponta para o diagnóstico experimental in vivo de imagens e pode ter um impacto significativo em pesquisas pré-clínicas em vários campos.

Introdução

Modelos animais têm muito enriquecido nossa compreensão de inúmeras patologias intestinais. O rato de laboratório (Mus musculus) surgiu como um modelo animal primordial na investigação biomédica devido à sua informação genética e genômica abundante e está prontamente disponível em linhagens transgênicas e mata-mata. Além de reforçar a compreensão patogênese da doença, modelos animais também são usados ​​principalmente para testar drogas candidatos, bem como intervenções diagnósticas ou terapêuticas pré-clínicos. No entanto, apesar da variedade de modelos de ratos, simulando a doença humana, muitas opções de diagnóstico e de intervenção que são rotineiramente usados ​​no tratamento do paciente não estão disponíveis para os ratos. Deste modo, as estratégias de vigilância para controlar o curso da doença de murino ou o efeito de intervenções terapêuticas são geralmente limitados para observações indirectas ou post mortem análises. Embora existam procedimentos não-invasivos para os ratos de monitoramento vitalidade como índices de atividade da doença, quantification de perda de peso ou ganho, sangue, urina e fezes análises, estas são apenas indicadores indiretos e são influenciados pela variabilidade inter-individual. Além disso, análises post mortem evitar observações longitudinais em momentos repetitivos. Técnicas de imagem sofisticados para monitorar a atividade da doença em camundongos só recentemente foram introduzidos 1,2. Embora essas técnicas de imagem permitem análises repetitivas, eles apenas fornecem uma visão descritiva e muitas vezes imprecisas sobre o intestino, não permitir a visualização da mucosa direta ou permitir intervenções diagnósticas ou terapêuticas, como a aquisição de biópsia ou aplicação tópica e intramucosal de candidatos a fármacos.

Recentemente, os sistemas de endoscopia de alta resolução para utilização em ratos vivos foram desenvolvidos 3,4. Pela primeira vez, essas técnicas endoscópicas permitir a visualização direta de patologias de doenças do cólon endoluminal como cicatrização de feridas ou inflamação intestinal proporcionando objective estado, em tempo real, permitindo estudos longitudinais no mesmo animal em intervalos de tempo repetitivos. Além de permitir que as biópsias repetidas em um ratinho individual, sistemas de endoscopia também pode ser utilizado para influenciar terapeuticamente um tumor distinta ou inflamação localizada, permitindo a aplicação directa de uma substância para a área de interesse. Além disso, como substâncias terapêuticas e de controlo podem ser entregues directamente para a área de interesse, esta pode ser realizada no mesmo ratinho, não incluindo a variabilidade inter-individual. Estes sistemas de terem sido utilizadas para a avaliação da inflamação do cólon, cicatrização de feridas, biópsias hepáticas laparoscópicas e indução ortotópico de tumores hepáticos 8 e desenvolvimento do tumor através de vários sistemas de pontuação, tais como o índice endoscópica murino de gravidade da colite (MEICS) 5-7. MEICS consiste de cinco parâmetros para avaliar a inflamação: espessamento da parede do cólon, alterações do padrão vascular, presença de fibrina, a granularidade dos Mucossuperfície al, e fezes de consistência.

Neste protocolo, descrevem o uso de endoscopia rígida em modelos murinos de cicatrização intestinal, inflamação e câncer de cólon. Em primeiro lugar, demonstrar a avaliação endoscópica da cicatrização e inflamação do cólon, bem como a avaliação longitudinal da atividade colite eo estudo da cancerogenesis no cólon murino. Além do uso descritivo da endoscopia murino, nós fornecemos instruções detalhadas sobre o uso de instrumentos endoscópicos para obter biópsias, bem como a aplicação tópica e intramucosal de diferentes componentes de interesse (por exemplo, candidatos a fármacos ou células tumorais). Finalmente, demonstramos a utilização de endoscopia fluorescência murino, que emprega técnicas sofisticadas de imagens moleculares, na definição de tumores colo-rectais.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) de acordo com a Lei de Proteção de Animais alemão.

1. Materiais e montagem de experimento

  1. Cuidados com os animais
    1. Use feminino ou camundongos machos de qualquer tensão pesando 20 a 25 g e abrigá-los de acordo com a legislação cuidado animal local.
    2. Alimentar ratos com comida para roedores e especial aplicar ração isenta de alfafa pelo menos três dias antes da fluorescência exames para minimizar endoluminal auto-fluorescência.
    3. Fornecer autoclavado beber água ad libitum.
  2. A indução da colite induzida por DSS aguda
    1. Prepara-se uma 3% (w / v) de sulfato de sódio de dextrano (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) solução por dissolução de 3 g de DSS em 100 ml de água autoclavada. Oferecer esta solução como a água potável exclusiva para ad libitum camundongos e calcular 5 ml de solução por DSS-mouse / dia. Alimentação contcamundongos rol com água autoclavada sem DSS ad libitum 9.
  3. A indução de câncer colorretal
    1. Dissolver azoximetano mutagénicas (OMA) (CUIDADO Pode causar cancro e defeitos genéticos!) Em solução salina isotónica estéril para se obter uma concentração final de 1 mg / ml. Aplicar uma dose única de 10 mg por kg de peso corporal OMA intra-peritoneal com uma seringa de 1 ml (30 g) 10.
    2. Camundongos desafio (excluindo os ratos de controle) com ciclos repetitivos de 3% (w / v) DSS do dia 0-7, dia 14-21, dia 28-35 e dia 42 a 49 de induzir inflamatória impulsionado cancerogenesis colorretal. Alimentar ratos com água esterilizada apenas entre esses desafios (ver Figura 4A por um cronograma detalhado). Alimentar ratos de controle em água esterilizada durante todo o experimento.
  4. Preparação de fluorescência endoscopia (FE)
    1. Use Fluorescein-Isothiocyanat (ITCF) - dextrano (peso molecular de 70.000 Da; FITC: glicose = 1: 250) para detecção de adenoma do cólon por realce visual de displasia associada padrão vascular.
    2. Administrar 60 mg de dextrano conjugado com FITC diluído em 100 ul de PBS por via intravenosa 5 minutos antes da análise de fluorescência endoscópica.
  5. Anestesia
    1. Fornecer um suprimento contínuo para anestesia de isoflurano (1,5 LO 2 / min; 1,5-2% em volume de isoflurano [2-cloro-2-(difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano]). Use equipamentos especiais anestesia veterinária, com uma máscara para controlar firmemente a anestesia.
  6. Preparação de enema
    1. Instilar 2 ml de fluido de enema (conteúdo: hidrogenofosfato dissódico 1,5% (w / v) e di-hidrogenofosfato de sódio a 11% (w / v)) para o cólon, se se suspeita de significativa fecal que podem obscurecer a visão.

2 Equipamento técnico

  1. Use uma estação de trabalho endoscópica veterinária que é desenvolvida e aprovada para o uso de animais pequenos endoscopia. Conecte o workstation para uma unidade de câmera, uma fonte de luz xenon, uma bomba de ar e um monitor convencional PC para luz branca endoscopia. Em seguida, conecte a câmera eo telescópio rígido em miniatura (diâmetro externo 1,9 milímetros, 10 cm de comprimento; Figura 5).
  2. Use bainha endoscópio com canal de trabalho (Figura 5D) para a aplicação de pinça de biópsia ou tubo de injecção. Use a bainha sem canal de trabalho para colonoscopia diagnóstica.
  3. Defina as configurações da fonte de luz para fluorescência endoscopia para excitar traçadores utilizado (por exemplo, 490 nm para dextrano FITC-conjugado). Além disso, a integração de um filtro de passagem de banda adequada entre o telescópio e a câmara (por exemplo, 525 nm para o dextrano conjugado com FITC).
  4. Insira uma pinça de biópsia flexível (3, 28. Charr cm) através do canal de trabalho do endoscópio para obter biópsias.
  5. Introduzir tubo de injecção flexível (0,96 mm), através do canal de trabalho para tópica, intramucosal ou Endoluminal umdministração de agentes de diagnóstico ou terapêuticos.
  6. Use uma mesa de exame aquecida com uma temperatura de 42 ° C. Isso evita que os ratos se tornando hipotermia durante o exame.

3 Anestesia de Animais

  1. Coloque rato numa caixa à prova de fugas, mas pequena e administrar isoflurano (100% (v / v), 5% em volume, de 3 L / min). Espere até que o mouse perde a consciência.
  2. Transferir o mouse sobre a mesa de exame de endoscopia. Continue inalação isoflurano via máscara facial com uma dose de 100% v / v, 1,5 vol%, 1,5 L / min. Sempre aplique pomada para evitar o ressecamento dos olhos e sob anestesia.
  3. Avaliar a eficácia da anestesia, verificando os reflexos. Verifique a 'volta em torno do reflexo ": se suficientemente anestesiado, um rato que coloca em suas costas não deve virar. Confira os 'pés reflex ": quando a anestesia é adequado, macio apertando entre os dedos do animal não deve conduzir à retirada da perna (fase detolerância cirúrgico).

4. Colonoscopia

  1. Coloque rato anestesiado propenso / de costas na mesa de exame.
  2. Administrar 2 ml de enema através de uma cânula abotoado no cólon se houver suspeita de acúmulo fecal significativo que pode obscurecer a visão. Espere por ratos para defecar após a administração do enema. Insira o endoscópio com muito cuidado para evitar a perfuração.
  3. Abrir ambas as válvulas da bainha com um deles estar ligado à bomba de ar. Selar a outra válvula com o dedo indicador para dispensar o ar. Inflar cólon com ar, lentamente e com cuidado, em especial no caso de biópsia ou de injecção.
  4. Avance endoscópio apenas até a articulação do cólon direito de evitar a perfuração (4-5 cm de ânus).
  5. Colonoscopia diagnóstica
    1. Examine a mucosa por alterações inflamatórias ou malignas, enquanto puxa de volta o endoscópio. Puxar lentamente para avaliar toda a circunferência do intestino. Avaliar pa intraluminalthologies utilizando sistemas de pontuação estabelecidos apropriados necessários.
    2. Para justificar a posição endoscópica idêntico para a aquisição de imagens durante as visualizações repetitivas das áreas das feridas, observe a distância entre o ânus murino ea lesão da mucosa. Além disso, utilizar a ponta da pinça de biópsia como um espaçador, para atingir a distância idêntica entre o endoscópio e a área da ferida durante a aquisição de imagem. O tamanho da ferida está relacionada com o tamanho da bainha de endoscópio, que é composta por 3 mm.
      NOTA: Coloque endoscópio em posição idêntica em comparação óptica com documentação fotográfica dos exames anteriores. Lesões de medidas no mesmo ângulo e distância em cada seguimento exame endoscópico.
  6. Procedimento de biópsia
    1. Tome biópsias com a ajuda de dois investigadores. Introduzir uma pinça de biópsia com cuidado através do canal de trabalho até que a ponta da pinça é visível no monitor para o segundo investigador. Fórceps Abra e feche com cuidado para aperfuração vazio.
    2. Mover uma pinça para o local da patologia.
  7. Procedimento de injeção
    1. Executar um procedimento de injecção, com a ajuda de dois investigadores. Pré-enchimento do tubo flexível de injecção (0,96 mm) completamente com o agente a ser administrado. Empurre tubo através do canal de trabalho até que a cânula (30 G) é visível no monitor para o segundo investigador. Preparar seringa fino e suavemente administrar a quantidade de agente de diagnóstico ou terapêutico requerido. Os volumes de injecção deve ser de 50 máximo l.
    2. Insira a agulha no submocosa em um ângulo de 15-30 graus. Encare o chanfro na direção da mucosa. A mucosa mostra um sinal de elevação característica após a injeção de sucesso.
  8. Fluorescência endoscopia (FE)
    1. Administrar 60 mg de dextrano conjugado com FITC diluído em 100 ul de PBS por via intravenosa antes fluorescência exame endoscópico.
    2. Verifique o ponto de tempo ideal entre a injeção deo traçador fluorescente marcado e o procedimento de imagem o qual é dependente do traçador farmacologia. Configurar as definições de sistema de filtro de banda de acordo com o comprimento de onda de excitação e emissão do traçador utilizado. Realizar endoscopia para marcadores de fluorescência de volume de sangue não-específicos (por exemplo, FITC), imediatamente após a injecção intravenosa do corante fluorescente para avaliar o padrão vascular da superfície da mucosa.
    3. Considere imaginando várias horas após a aplicação do traçador no caso dos marcadores direcionados ou "sondas inteligentes" para proporcionar uma melhor alvo para fundo de razão.
    4. Realizar foto e vídeo-documentação dos resultados.

5 Pós-colonoscopia

  1. Separe o rato em uma gaiola vazia e coloque-a sobre uma toalha de papel para proteger o mouse de aspiração de areia. Aqueça o mouse com uma lâmpada de luz vermelha para evitar a hipotermia. Observe o mouse e não deixe sem vigilância até que recuperou suficienteconsciência para manter decúbito esternal. Uma vez completamente consciente, coloque o mouse de volta para sua respectiva gaiola.
  2. No final da experiência, o lugar do rato numa caixa à prova de fugas, mas pequena e administrar CO 2 (100% (v / v), 100% em volume, de 3 L / min). Espere até que o mouse perde a consciência completa e pára de respirar. Despacho do mouse por fratura do colo. Realizar laparotomia eo explantar cólon. Abra o cólon longitudinalmente e lavá-lo para posterior avaliação histológica ou molecular.

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Resultados

Na monitorização in vivo da cicatrização do intestino
Durante a endoscopia de rotina, feridas na mucosa foram induzidas mecanicamente por uma pinça de biópsia em miniatura com um diâmetro de 3 Francês (igual a 1 mm; Figura 1A). Subsequentemente, a cicatrização de feridas foi monitorada por exames endoscópicos diários e quantificada por medição da área de ferida residual utilizando o software de edição, por exemplo, o ImageJ (Figura 1B). O...

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Discussão

Cicatrização do epitélio é um processo contínuo. Esfoliação fisiológica contínua de células superficiais da mucosa gastrointestinal ocorre exigindo a regeneração frequente de células epiteliais 16. Consequentemente, a cicatrização de feridas prejudicada tem um imenso impacto sobre várias doenças, incluindo úlceras gastrointestinais e vazamento da anastomose 17 18. Avaliação da base molecular, assim como potenciais candidatos a medicamentos para estimular a cicatrização, só pode ser realizada de for...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos Sonja Dufentester e Elke Weber para assistência técnica especializada. Agradecemos Faekah Gohar pela revisão do manuscrito e Stefan Brückner para suporte informática médica. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa interdisciplinar do Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Faculdade de Medicina da Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner foi apoiado por uma "Gerok" posição de rotação da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Agradecemos Heike Blum para ilustração do desenho animado mouse.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes
Dieta sem alfafaHarlan Laboritories, Madison, EUA2014
Azoximetano (AOM)Sigma-Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaA5486
Pomada para os olhos BepanthenBayer, Leverkusen, Alemanha80469764
Sulfato de dextrano sódico (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SuéciaDB001
EosinSigma-Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaE 4382
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma-Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Bélgica352070
Florene 100 V/VAbbott, Wiesbaden, AlemanhaB506
HematoxilinaSigma-Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaHHS32-1L
Isopentano (2-Metilbutano)Sigma-Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaM32631-1L
Azul de metilenoMerck, Darmstadt, Alemanha1159430025
O.C.T. Tissue Tek compound                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Holanda4583
Omnican F - canulaBraun, Melsungen, Alemanha9161502
Solução salina tamponada com fosfato, PBSLonza, Verviers, Bélgica4629
Cloreto de sódio 0,9%Braun, Melsungen, Alemanha5/12211095/0411
Dieta padrãoAltromin, Lage, Alemanha1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Holanda4566
Vitro – Clusão                                                                                                                             R. Langenbrinck, Teningen, Alemanha04-0002 
Equipamento
AIDA ControlKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha20 096020
Filtro passa-bandaSemrock, Rochester, EUAHC 716/40
Filtro passa-bandaSemrock, Rochester, EUAHC 809/81
Pinça de biópsia, 3 Fr., 28 cmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha61071ZJ
Dell MonitorDell, Frankfurt am Main, AlemanhaU2412Mb
Bainha de Exame, 9 Fr.KarlStorz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha61029D
Bainha de Exame, 9 Fr.KarlStorz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha61029C
Cabo de Luz de Fibra Óptica, 3,5 mmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha69495NL
Fluoresceína Azul Sistema de FiltroKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha20100032
Filtro de Barreira de FluoresceínaKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha20100033
PedalKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha20010430
Telescópio HOPKINS, 1,9 mm, Comprimento 10 cmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha1830231
SCB D-light P Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha20 133720
SCB tricam SL IIKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha20 2230 20
Conjunto de instrumentos de tubulação VETPUMP IIKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha69811
Tricam PDD PALKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha20221037
UniVet PortaGroppler Medizintechnik, Deggendorf, AlemanhaBKGM 0451
Vetpump 2Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha69321620

Referências

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