Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.
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Artigo de método
Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A análise de alta resolução da morfologia e função de neurónios de mamífero, muitas vezes requer a genotipagem de cada animal seguindo-se a análise de culturas primárias de neurónios. Nós descrevemos um conjunto de procedimentos para: rotulando camundongos recém-nascidos para ser genotipados, genotipagem rápida, e estabelecendo culturas de baixa densidade de neurônios do cérebro desses ratos. Ratinhos individuais são marcadas por tatuagem, o que permite a identificação de longo prazo duradoura na idade adulta. A genotipagem por o protocolo descrito é rápido e eficaz, e permite a extracção automática de ácido nucleico com uma boa fiabilidade. Isso é útil em circunstâncias em que o tempo suficiente para a genotipagem convencional não está disponível, por exemplo, em ratos que sofrem de letalidade neonatal. Culturas neuronais primárias são gerados em baixa densidade, que permite experimentos com imagens em alta resolução espacial. Este método de cultura requer a preparação de camadas alimentadoras gliais antes de plaqueamento neuronal. O protocolo é aplicado em sua totalidade para um modelo do rato da distonia distúrbio do movimento DYT1 (AE-torsinA knock-nos ratos), e as culturas neuronais são preparados a partir do hipocampo, córtex cerebral e estriado destes ratos. Este protocolo pode ser aplicado aos ratos com outras mutações genéticas, bem como de outras espécies animais. Além disso, os componentes individuais do protocolo pode ser utilizado para sub-projectos isolados. Assim, este protocolo terá amplas aplicações, não só no campo da neurociência, mas também em outros campos das ciências biológicas e médicas.
Introdução
Modelos de roedores de doenças genéticas provaram útil para estabelecer as funções fisiológicas normais de proteínas e ácidos nucleicos, bem como as consequências de fisiopatológicos defeitos nestes. Exemplos incluem ratos deficientes para proteínas envolvidas em funções celulares essenciais, bem como modelos de rato de desordens tais como doença de Alzheimer. No entanto, certas manipulações genéticas podem levar a letalidade neonatal pouco ou alguns dias após o nascimento. Nestes casos, as culturas de células primárias são um instrumento importante porque as células vivas podem ser obtidos a partir dos filhotes embrionários ou neonatais antes da morte, que podem ser....
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Iowa animal Institucional.
1. Identificação de longo prazo de ratos usando Tatuar as almofadas das patas
- Imobilizar a pata com (superfície plantar) a almofada da pata de frente para o experimentador. Segurar a pata com o polegar e o dedo indicador. Tenha cuidado para não apertar a pata.
NOTA: a imobilização estável é importante para garantir que o pigmento tatuagem é colocado na derme da almofada da pata, e assim é permanente 7. - Limpar a almofada da pata com 70% de etanol ....
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Resultados
Como exemplo da aplicação deste protocolo, os resultados representativos são mostrados para a rotulagem de camundongos por tatuagem, genotipagem de confiança sob várias condições experimentais, e estabelecendo culturas neuronais primárias em camadas alimentadoras gliais.
Tatuagem
Crias recém-nascidas foram marcadas nas almofadas das patas utilizando um sistema de tatuagem ('recém-nascido' na Figura 1). Os rótulos permaneceu clara.......
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Discussão
O protocolo aqui apresentado inclui os procedimentos para a tatuagem para marcar / identificar ratos, camundongos para a genotipagem de pontas da cauda, e para a cultura de neurônios do cérebro do rato em baixa densidade. Em uma rodada de experimentos usando 6-8 filhotes, estes procedimentos normalmente requerem ~ 0,5 hr, ~ 4 horas e ~ 2 horas, respectivamente, em um total de 6-7 horas. Isto torna mais prático para um único experimentador para completar todos os procedimentos necessários a partir do momento do nascime.......
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Divulgações
O autor (Zhengmin Huang) é o presidente da EZ BioResearch LLC que produz os reagentes descritos neste artigo.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos pesquisadores da Universidade de Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins e Beverly Davidson pelas instruções e comentários úteis sobre as culturas estriadas, e aos Drs. Kara Gordon, Nicole Bode e Pedro Gonzalez-Alegre pela assistência e discussões sobre a genotipagem. Também agradecemos ao Dr. Eric Weyand (Sistemas de Identificação e Marcação de Animais) pelos comentários úteis sobre a tatuagem, e ao Dr. Shutaro Katsurabayashi (Universidade de Fukuoka) pelos comentários úteis sobre a cultura do rato. Este trabalho foi apoiado por doações da American Heart Association, do Departamento de Defesa (prêmio W81XWH-14-1-0301 do Programa de Pesquisa Méd....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTES - Máquina de tatuagem | |||
| Limpador | Identificação e Marcação de Animais, Inc. | NMCR3 | Isso é usado para limpar as agulhas e o suporte após a tatuagem. |
| Agente de secagem de máquina | Sistemas de identificação e marcação de animais, Inc. | NDAR4 | É usado para secar as agulhas e o suporte após a limpeza. |
| Neonate Tattoo Black Pigment | Animal Identification and Marking Systems, Inc. | NBP01 | |
| Aplicador de Preparação de Pele | Sistemas de Identificação e Marcação de Animais, Inc. | NSPA1 | Ponta Q. |
| Solução de preparação da pele | Sistemas de identificação e marcação de animais, Inc. | NSP01 | Este reagente fornece uma fina camada de óleo que aumenta a eficiência da tatuagem e previne o desbotamento da tatuagem, por (informações do fornecedor): 1) evitando que a pele não tatuada seja manchada temporariamente, permitindo assim que a qualidade de uma tatuagem de almofada de pata seja facilmente avaliada antes que o filhote seja devolvido à sua gaiola de origem – A superfície da pele manchada pode ser confundida com a pele tatuada, 2) reduzindo os danos à pele durante a tatuagem - Amolecer a pele e lubrificar a agulha ajudará a agulha a penetrar na pele sem causar danos à pele e 3) impedir que o oxigênio molecular entre na pele, reduzindo assim as respostas inflamatórias às espécies reativas de oxigênio que podem ser geradas. |
| REAGENTES - genotipagem | |||
| EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Formato de Tubo de Tira) | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | |
| 2X PCR Ready Mix II | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | Um corante vermelho, de carga para eletroforese, está incluído na solução 2X PCR Ready Mix. |
| Solução de Lise de Tecido A | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | Prepare a Solução de Extração de DNA misturando 20 µ l de Solução de Lise Tecidual A e 180 µ l de solução de lise tecidual B por amostra. |
| Solução de Lise de Tecido B | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | Prepare a Solução de Extração de DNA misturando 20 µ l de Solução de Lise Tecidual A e 180 µ l de solução de lise tecidual B por amostra. |
| Ácido acético, glacial | VWR | BDH 3092 | |
| Grau otimizado para agarose, grau de biologia molecular | rpi | A20090-500 | Usamos géis de agarose a 2% em tampão TAE contendo a coloração de gel de DNA SYBR Safe (diluída 10.000 vezes) ou brometo de etídio (0,5 µ g/ml de volume de gel). |
| Brometo de etídio | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| Ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico dihidratado (EDTA) | Fisher | BP120-500 | |
| Pontas de Pipeta Filtradas, Sem Aerossóis, 0.1-10 µ l | Dot Scientific Inc | UG104-96RS | Use pontas de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada. |
| Pontas de Pipeta Filtradas, Pontas de Filtro de Ajuste Premium, 0.5-20 µ l | Dot Scientific Inc | UG2020-RS | Use ponteiras de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada. |
| Pontas de Pipeta Filtradas, Pontas de Filtro de Ajuste Premium, 1-200 µ l | Dot Scientific Inc | UG2812-RS | Use ponteiras de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada. |
| Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 100 bp | EZ BioResearch LLC | L1001 | Usamos qualquer um desses três marcadores de peso molecular. |
| Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 1000 bp | EZ BioResearch LLC | L1010 | |
| Marcador de peso molecular, TrackIt, 100 bp DNA Ladder | Tubos PCR GIBCO-Invitrogen | 10488-058 | |
| , 8 tiras de tubos com tampas de cúpula individualmente anexadas, naturais, 0,2 ml | USA Scientific | 1402-2900 | Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Uma tira de 8 tubos é fácil de manusear e agrupar as amostras do que os tubos individuais. |
| Tubos de PCR, Ultraflux Individual | rpi | 145660 | Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. |
| Tubo de microcentrífuga Seal-Rite 0,5 ml, natural | USA Scientific | 1605-0000 | Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. |
| Coloração segura do gel do ADN de SYBR * concentração de 10.000x em DMSO | GIBCO-Invitrogen | S33102 | |
| Tris base | rpi | T60040-1000 | |
| Primeiras demão para amplificar o gene de Tor1a dentro Δ Camundongos knock-in E-torsinA | Esses primers foram usados em uma concentração final de 1,0 ng/µ l (~0,16 µ M) (referência 2). | ||
| Primers para amplificação do gene Tfap2a em camundongos | 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (para frente), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverso) para o amplicon de 498 pb, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (para frente), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverso) para o amplicon de 983 pb, e 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (para frente), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverso) para o amplicon de 1990 pb. Esses primers são usados a 0,5 µM. | ||
| REAGENTES - cultura | |||
| 5-Fluoro-2′-desoxiuridina | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Consulte a seção de comentários da uridina para obter mais informações. |
| Suplemento B-27 | GIBCO-Invitrogen | 17504-044 | |
| Placas de cultura de células 35 x 10 mm, | de falcão BD | com cultura 353001 de | |
| tecidos, T25, tratados com cultura de tecidos, pescoço inclinado, tampa de vedação de plugue, área de crescimento de 25 cm2 | 353082 | ||
| de falcão BD de 70 mlFrascos de cultura de células, T75, tratados para cultura de tecidos, pescoço inclinado, tampa ventilada, 75 cm2 Área de crescimento, 250 ml | BD falcon | 353136 | |
| Tubo cônico, polipropileno, 15 ml | BD falcon | 352095 | |
| Countess (contador de número de células) lâminas de câmara | GIBCO-Invitrogen | C10312 | |
| Cloridrato de citosina β-D-Arabinofuranosídeo (cloridrato de Ara-C) | Sigma-Aldrich | C6645-100mg | |
| D-(+)-Glicose (Dextrose) anidra, SigmaUltra, 99,5% (GC) | Sigma-Aldrich | G7528-250G | |
| Prato, Vidro de Petri 100 x 15 mm | Pyrex | 3160-101 | |
| Água destilada | GIBCO-Invitrogen | 15230-147 | |
| DNase Tipo II | Sigma-Aldrich | D4527-200KU | A solução de estoque é preparada a 1.500 unidades/20 μ l = 75.000 unidades/ml em água destilada. |
| Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta, GlutaMAX, piruvato | GIBCO-Invitrogen | 10569-010, | |
| , 250 ml, membrana de 50 mm de diâmetro, 0,2 µ m Tamanho dos Poros | Nalgene | 568-0020 | |
| Unidade de Filtro PES Rápido, 500 ml, membrana de 90 mm de diâmetro, 0.2 µ m Tamanho dos Poros | Nalgene | 569-0020 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | GIBCO-Invitrogen | 26140-079 | |
| Lamínula de vidro, 12 mm Redondo, espessura 0.09– 0.12 mm, No. 0 | Carolina | 633017 | |
| GlutaMAX-I | GIBCO-Invitrogen | 35050-061 | |
| Sais Balanceados Hanks' | Sigma-Aldrich | H2387-10X | |
| HEPES, ≥ 99,5% (titulação) | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Ácido clorídrico, 37%, reagente AC | Sigma-Aldrich | 258148-100 ML | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I5500-250 mg | |
| Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4•( 7H2O), BioUltra, ≥ 99,5% (Fluka) | Sigma-Aldrich | 63138-250G | |
| Biosciences | sem vermelho de fenol | 356237 | Este é o material de revestimento para lamínulas e frascos. 1) Para prepará-lo, descongele a solução de matriz de membrana basal Matrigel no gelo, o que geralmente leva ~ 1 dia. Com uma pipeta pré-arrefecida, alíquota da solução descongelada em balões T25 pré-arrefecidos sobre gelo e conservar os balões a -20 °C. Para preparar a solução de Matrigel de trabalho, descongele o Matrigel alíquota em um frasco com gelo, dilua 50 vezes adicionando a solução de MEM pré-resfriada e mantenha a solução diluída a 4 ° C. É importante pré-resfriar todos os utensílios de cultura e meios que entram em contato com o Matrigel, exceto durante e após o revestimento das lamínulas, para evitar que forme um gel prematuramente. 2) Para revestir as lamínulas de vidro ou frascos de cultura com Matrigel, aplique a solução de Matrigel na superfície. Antes de revestir as células, é importante secar completamente a superfície. Para este fim, pode ser útil aspirar Matrigel durante a centrifugação celular imediatamente antes de plaquear as células e dar tempo suficiente para a secagem. |
| Meio essencial mínimo (MEM) | GIBCO-Invitrogen | 51200-038 | |
| Extensor de soro MITO+, 5 ml | BD Biosciences | 355006 | |
| Placas multipoços, Placa de 24 poços tratada com cultura de tecidos | Falcão BD | 353047 | |
| Placas multipoços, Placa de 6 poços tratada com cultura de tecidos | Falcão BD | 353046 | |
| Meio Neurobasal-A (1X), líquido | GIBCO-Invitrogen | 10888-022 | |
| Ácido Nítrico | VWR | bdh 3044 | |
| NS (Suplemento Neuronal) 21 | preparado em laboratório | Fonte: referência 69 | |
| pipetas de Pasteur, 5 ¾ ” | Fisher | 13-678-6A | Use este plugue de algodão 5 ¾ ” Pipeta Pasteur para trituração celular. Polir a ponta com fogo de antemão para alisar a superfície de corte e reduzir o diâmetro interno para 50-80% do original. Uma ponta muito pequena interromperá as células e reduzirá a viabilidade celular, mas uma ponta muito grande diminuirá a eficiência da trituração. |
| Pipetas Pasteur, 9" | Cloreto de potássio Fisher | 13-678-6B | |
| (KCl), SigmaUltra, ≥ 99,0% | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Pipeta sorológica, 2 ml | BD falcon | 357507 | |
| pipeta sorológica, 5 ml | sorológica 357543 | falcão BD | |
| pipeta sorológica | 357551 | falcão BD | |
| 10 ml, pipeta sorológica | 357525 | falcão BD | |
| , 50 ml | BD falcon | 357550 | |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Hidrogenocarbonato de sódio), SigmaUltra, ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Cloreto de sódio (NaCl), SigmaUltra, ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| Hidróxido de sódio (NaOH), pellets, 99,998% à base de metais traços | Sigma-Aldrich | 480878-250G | |
| Fosfato de sódio dibásico heptahidratado (Na2< / sub>HPO4< / sub>•( 7H2O)), ≥ 99,99%, Aldrich | Sigma-Aldrich | 431478-250G | |
| Sucrose, SigmaUltra, ≥ 99,5% (GC) | Sigma-Aldrich | S7903-250G | |
| Filtro de seringa, estéril, 0,2 µ m | 431219 | Corning | |
| , 3 ml | BD falcon | 309585 | |
| Transferrina, Holo, plasma bovino | Calbiochem | 616420 | |
| Coloração azul de tripano, 0,4% | GIBCO-Invitrogen | T10282 | Isso é usado para contar células vivas / mortas. Renove uma solução velha de azul de tripano se ela for reutilizada muitas vezes (por exemplo várias vezes por semana durante várias semanas), pois formará precipitados e resultará em leituras errôneas da densidade celular. |
| Tripsina, tipo XI | Sigma-Aldrich | T1005-5G | |
| Solução de tripsina-EDTA, 0,25% | GIBCO-Invitrogen | 25200-056 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G | é preparada em 50 mg de 5-fluoro-2'-desoxiuridina e 125 mg de uridina em 25 ml de DMEM (8,12 e 20,48 mM, respectivamente). |
| REAGENTES - imunocitoquímica | |||
| Anticorpo, anti-MAP2 policlonal de coelho | Merck Millipore | AB5622 | |
| Anticorpo, coquetel monoclonal anti-GFAP de camundongo | Merck Millipore | NE1015 | |
| EQUIPAMENTO - tatuagem | |||
| AIMS | Sistemas de Identificação e Marcação de Animais, Inc. | NEO– 9 | Este sistema de tatuagem de roedores recém-nascidos é um sistema elétrico que funciona movendo rapidamente agulhas de tatuagem de 1 ou 3 pontos verticalmente na pele. Ative a máquina de tatuagem uma vez por aproximadamente 0,5 segundos, enquanto as pontas das agulhas de tatuagem são mantidas perpendiculares à superfície da pele. Preferimos a tatuagem com três agulhas para maximizar a área tatuada, mas a tatuagem com uma agulha é eficaz em áreas mais estreitas, os dedos dos pés, ou se for necessário um controle mecânico fino, e.g. quando os números são tatuados. Duas rodadas de tatuagem na velocidade mais lenta (definindo "1" de 3 etapas) são normalmente suficientes para produzir uma tatuagem visível e duradoura das almofadas das patas. |
| EQUIPAMENTO - sistema de eletroforese de genotipagem | |||
| , horizontal, Wide Mini– Subcélula GT | BIO– RAD | 170– 4405 | Os parâmetros típicos de eletroforese são intensidade do campo elétrico a 6 V / cm e duração de 25 minutos para um gel de 10 cm. |
| FluorChem 8800 | ProteinSimple | FluorChem 8800 | |
| PCR, MJ Mini Termociclador | BIO-RAD | PTC-1148EDU | Nossas reações de PCR para o gene Tor1a em Δ Os camundongos knock-in E-torsinA são os seguintes: 1 ciclo de desnaturação a 94 ° C por 3 min, 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 30 seg, recozimento a 58 ° C por 30 seg, extensão em 72 ° C por 2 min. Isso é seguido pela extensão final em 72 &# 176; C por 10 min e mantendo a 4 °C. |
| Fonte de alimentação, PowerPac Basic | BIO-RAD | 164-5050 | |
| EQUIPAMENTO - cultura | |||
| Contador de células automatizado, Condessa | GIBCO-Invitrogen | C10310 | Este contador de células automatizado mede separadamente as densidades de células vivas e mortas (não coradas e coradas por azul de tripano, respectivamente). É importante conhecer a faixa ideal de medições de densidade: o contador que usamos tem a maior precisão na faixa de 1 x 105 a 4 x 106 células/ml. Se os valores de densidade celular medidos estiverem fora da faixa recomendada, ajuste o volume de ressuspensão adequadamente. |
| Gabinete de Segurança Biológica, Classe II, Tipo A2 | NUAIRE | NU-425-400 | Este capuz é usado para todos os procedimentos de cultura de células, exceto para dissecção cerebral. |
| CO2 Incubadora, AutoFlow, Camisa de Água com Controle de Umidade | NUAIRE | NU-4850 | |
| Bancada Limpa Horizontal | NUAIRE | NU-201-330 | Esta bancada limpa é usada para dissecção cerebral (etapas 3.1.1 e 3.1.2 de "Dissecção Cerebral e Dissociação Celular)". |
| Orbit LS Agitador de Baixa Velocidade | Labnet | S2030-LS-B | |
| SORVALL RC-6 Plus Centrífuga Supervelocidade | Fisher | 46910 (centrífuga)/46922 (rotor) |
Referências
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
- Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
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Reimpressões e permissões
