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Artigo de método

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

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⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

29 de janeiro de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

Resumo

A análise de alta resolução da morfologia e função de neurónios de mamífero, muitas vezes requer a genotipagem de cada animal seguindo-se a análise de culturas primárias de neurónios. Nós descrevemos um conjunto de procedimentos para: rotulando camundongos recém-nascidos para ser genotipados, genotipagem rápida, e estabelecendo culturas de baixa densidade de neurônios do cérebro desses ratos. Ratinhos individuais são marcadas por tatuagem, o que permite a identificação de longo prazo duradoura na idade adulta. A genotipagem por o protocolo descrito é rápido e eficaz, e permite a extracção automática de ácido nucleico com uma boa fiabilidade. Isso é útil em circunstâncias em que o tempo suficiente para a genotipagem convencional não está disponível, por exemplo, em ratos que sofrem de letalidade neonatal. Culturas neuronais primárias são gerados em baixa densidade, que permite experimentos com imagens em alta resolução espacial. Este método de cultura requer a preparação de camadas alimentadoras gliais antes de plaqueamento neuronal. O protocolo é aplicado em sua totalidade para um modelo do rato da distonia distúrbio do movimento DYT1 (AE-torsinA knock-nos ratos), e as culturas neuronais são preparados a partir do hipocampo, córtex cerebral e estriado destes ratos. Este protocolo pode ser aplicado aos ratos com outras mutações genéticas, bem como de outras espécies animais. Além disso, os componentes individuais do protocolo pode ser utilizado para sub-projectos isolados. Assim, este protocolo terá amplas aplicações, não só no campo da neurociência, mas também em outros campos das ciências biológicas e médicas.

Introdução

Modelos de roedores de doenças genéticas provaram útil para estabelecer as funções fisiológicas normais de proteínas e ácidos nucleicos, bem como as consequências de fisiopatológicos defeitos nestes. Exemplos incluem ratos deficientes para proteínas envolvidas em funções celulares essenciais, bem como modelos de rato de desordens tais como doença de Alzheimer. No entanto, certas manipulações genéticas podem levar a letalidade neonatal pouco ou alguns dias após o nascimento. Nestes casos, as culturas de células primárias são um instrumento importante porque as células vivas podem ser obtidos a partir dos filhotes embrionários ou neonatais antes da morte, que podem ser mantidos durante pelo menos algumas semanas in vitro, e durante este tempo o desenvolvimento neuronal precoce pode ser seguido pela experiências bioquímicas, funcionais e morfológicas. Para as culturas primárias, ela pode ser benéfica para os neurónios em placa de baixa densidade; isso faz com que seja possível visualizar a somata indivíduo, dendrites, eixos axonal e termi nervonais em alta resolução espacial. No entanto, a sobrevivência e diferenciação de neurónios a baixa densidade, tipicamente requer que eles são plaqueadas numa camada alimentadora de células gliais, a co-cultura com células gliais, na ausência de contacto físico com eles, ou cultivadas em meio condicionado por células gliais 1.

O estabelecimento de culturas neuronais de baixa densidade em camadas alimentadoras gliais pode ser dependente de genotipagem rápida e fiável de antemão - dentro de algumas horas, em contraste com alguns dias. A velocidade é especialmente importante quando o genótipo neuronal precisa de ser compensada com o de uma camada alimentadora glial preparado de antemão. Como um exemplo mais prático, pode ser necessário decidir qual das crias que genótipo de usar na geração de culturas, para optimizar a eficiência de uma experiência.

Aqui demonstramos o protocolo de trabalho que tenha sido utilizado para rápido, simplificado e fiável genotipagem rato em publicações anteriores 2-6. Rabos de rato eum kit disponível comercialmente são usados. Este protocolo inclui a extracção de passo único de ácidos nucleicos a partir do tecido, e não exige nem um passo de purificação de ácido nucleico que nem o uso de um tampão de terminação ('solução parar'). A fiabilidade deste método de genotipagem é ilustrada, apresentando os resultados de uma série de testes em que são introduzidas diferenças no que diz respeito à quantidade de partida das amostras, a idade dos animais e do comprimento dos produtos de amplificação de PCR. Este kit oferece as vantagens de extracção e fiabilidade automatizado.

Por causa de ser abrangente, a utilização de tatuagem para identificação de longo prazo dos ratinhos cujo genótipo é também demonstrada. A tatuagem é conseguido pela aplicação de tinta para tatuagem a derme da pele (epiderme sob as) 7. Um procedimento é descrito para tatuar as almofadas das patas de ratos recém-nascidos ou 1 dias de idade, embora tatuagens pode ser aplicado a outras partes do corpo, tais como as caudas e os dedos do pé, e a Animals de todas as idades. Além disso, os procedimentos será demonstrada para o plaqueamento e a cultura de neurónios de rato, a uma densidade baixa, com base na preparação optimizado de diferentes tipos de camadas alimentadoras gliais 2,8.

Nós usamos um modelo genético do rato da desordem neurológica DYT1 distonia herdada - uma desordem de movimento autossômica dominante, causada por uma mutação no gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. A proteína codificada, torsinA, pertence aos "ATPases associadas a diversas atividades celulares" (AAA +) família de proteínas, cujos membros geralmente desempenham funções semelhantes a chaperonas, auxiliando em: proteínas que se desdobram, desmontagem proteína do complexo, o tráfico de membrana e fusão das vesículas 10-13. Os resultados de mutação em uma deleção em enquadramento de um codão para ácido glutâmico, e pode conduzir a manifestação de "início precoce generalizada isolado distonia '14,15. No entanto, o caminhomecanismos ophysiological responsáveis ​​por esta desordem permanecem pouco compreendidos. Em um modelo de rato knock-in, o alelo mutante é Tor1a tm2Wtd, mencionados a seguir como Tor1a AE. Heterozygous AE-torsinA knock-nos ratos são pacientes humanos viáveis ​​e geneticamente mímica com DYT1 distonia, enquanto homozigoto knock-in ratos morrerem após o nascimento 16,17, com a latência para a morte pós-natal afetados por fundo genético 18. A morte prematura de homozigose camundongos knock-in exige que tanto a genotipagem dos animais eo estabelecimento de culturas neuronais são concluídas rapidamente. Como outro exemplo de genotipagem, Tfap2a (fator de transcrição AP-2α, ativando obrigatório 2α proteína potenciador) será usado. A proteína codificada por este gene é importante na regulação de vários processos celulares, tais como a proliferação, a diferenciação, a sobrevivência e a apoptose 19.

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Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Iowa animal Institucional.

1. Identificação de longo prazo de ratos usando Tatuar as almofadas das patas

  1. Imobilizar a pata com (superfície plantar) a almofada da pata de frente para o experimentador. Segurar a pata com o polegar e o dedo indicador. Tenha cuidado para não apertar a pata.
    NOTA: a imobilização estável é importante para garantir que o pigmento tatuagem é colocado na derme da almofada da pata, e assim é permanente 7.
  2. Limpar a almofada da pata com 70% de etanol em uma esponja ou um chumaço de gaze.
  3. Aplique óleo de pele para um aplicador com ponta de algodão, e pressione suavemente a ponta contra a superfície do pad pata várias vezes. Use apenas uma pequena quantidade de óleo da pele; quando presentes em grandes quantidades, vai impedir que o pigmento tatuagem de atingir a pele.
  4. Mergulhar as pontas das agulhas de tatuagem na tinta imediatamente antes tatuagempara tatuagem. Use limpa, asséptica e agulhas de tatuagem afiadas, para diminuir a dor e a possibilidade de infecção, e também para aumentar a eficiência de tatuagem.
  5. Enquanto a superfície da almofada da pata é coberto com o óleo da pele, pressione as pontas das agulhas de tatuagem verticalmente e levemente contra a pele no centro da almofada da pata, e injetar a tinta várias vezes. Veja a tabela de materiais / equipamentos para obter informações sobre o sistema de tatuagem elétrica.
  6. Spray de etanol a 70% em uma gaze, pressione-a contra a pata para remover o pigmento da tatuagem extra na superfície da pele, e inspecionar a qualidade da tatuagem. Verifique se o meio de almofada pata tem uma mancha escura, redonda que difere da pigmentação normal da pele. Se a tatuagem não é escuro ou grande o suficiente para facilitar a visualização, repita os passos de tatuagem anteriores.

2. Ratos Genotipagem neonatal, recorrendo a uma rápida Kit PCR Genotipagem

  1. Desinfectar a extremidade distal de uma cauda de rato com etanol a 70%, cortadas em 5 mm ou menos da caudaponta e transferi-lo para um tubo de uma tira de 8 tubo, do tipo utilizado para a PCR. Use uma lâmina de barbear usadas-un para cada cachorro para evitar a contaminação cruzada entre as amostras. Em alternativa, usar um par de tesouras, mas, neste caso, com cuidado e remover completamente o tecido remanescente sobre as lâminas utilizando etanol a 70%. Verifique se há sangramento. Se ocorrer sangramento, aplique pressão à parte corte da cauda com uma gaze até sangramento parou.
  2. Adicionar 200 uL de solução de ADN A extracção a cada tubo de PCR contendo um espécime. Veja a tabela de materiais / equipamentos para a sua composição e informações sobre o kit.
  3. Colocar a tira tubo num termociclador de PCR, e iniciar a extracção de ADN utilizando o seguinte programa: 1 ciclo a 55 ° C durante 10 minutos, 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, e mantendo a 4 ° C.
    NOTA: Este é o mesmo termociclador PCR que é usado mais tarde para PCR.
  4. Após a extração de DNA for concluído, remova a tira tubo do reciclador uma térmicand inverter 5 vezes.
  5. Transferência de 4 mL da solução (extracto de ADN) de cada amostra para um tubo de un-utilizado de uma tira de 8 tubo, e misturar-se com: 10 ul de 2X PCR Ready Mix II, 2 ul de mistura para a frente & iniciadores reverse (recomendado pelo 0,5 m; veja a tabela dos materiais / equipamentos para as sequências), e 4 l de livre de nuclease H 2 O, para cada espécime. Mexer um pouco (por exemplo, 3 segundos) usando uma centrífuga de bancada. Manter os tubos em gelo em todos os momentos, exceto quando do manuseio.
  6. Executar ciclos térmicos. Ver Tabela de materiais / equipamentos para o programa térmico.
  7. Detectar os produtos de ADN amplificados. Carregar a solução de reacção total a partir do PCR (20 uL) directamente dentro de um poço de um gel de agarose. Carregar os marcadores de peso molecular em um poço separado. Aplicar um campo eléctrico.
  8. Adquirir imagens de fluorescência das bandas com luz ultravioleta.

3. cultura primária de cérebro do rato Neurons em glial Feeder Camada

NOTA: Os procedimentos para a dissecação do cérebro e de dissociação de células (3,1) são comuns a todos os procedimentos subsequentes. Os procedimentos para as culturas do mouse gliais (3.2), culturas gliais de rato (3,3), e do rato culturas neuronais (3.4) são descritos separadamente mais tarde.

  1. Cérebro Dissection e Celular Dissocaiation
    1. Sacrificar um rato ou ratazana filhote por decapitação, remove-se rapidamente o cérebro, e colocá-lo em solução de Hanks (ver Tabela 1 para a composição) + 20% de soro fetal bovino (FBS) numa placa de 35 mm (mantido em gelo).
    2. Corte o cérebro através da linha média em dois hemisférios. Remover a região de interesse (por exemplo, do córtex cerebral, corpo estriado e hipocampo) de cada hemisfério do cérebro. Retire as meninges e os principais vasos sanguíneos a partir da superfície. Corte a região do cérebro em 10/04 fatias finas usando uma lâmina cirúrgica.
    3. Enxaguar as fatias de cérebro num tubo de centrifugação de 15 ml, uma vez wit'solução de + 20% de FBS, em seguida, 3 vezes, com o Hanks h Hanks solução (isto é, sem soro) (todos a 4 ° C). Para enxaguar, adicionar 5-10 ml de solução, deixe o cérebro fatias assentar no fundo do tubo, aspirar a solução a partir do topo, e adicionar uma solução fresca. Finalize o procedimento de lavagem por aspiração da solução.
    4. Filtro de 2 ml da solução de digestão contendo tripsina (ver Tabela 1 para a composição) usando uma seringa de 3 ml e um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente no tubo que contém as fatias de cérebro. Deixe a tripsinização prosseguir durante 13 min à temperatura ambiente.
    5. Neutraliza-se a solução de tripsina primeiro aspirando a maior parte dela e, em seguida, pela adição de 7-10 ml de solução de Hanks '+ FBS a 20% (4 ° C).
    6. Enxaguar as fatias de cérebro, duas vezes com Hanks solução de + 20% de FBS, e depois três vezes com o Hanks solução (ou seja sem soro) (todos a 4 ° C). Finalize o procedimento de lavagem, aspirando a solutde iões.
    7. Filtro de 2 ml da solução de dissociação (ver Tabela 1 para a composição) usando uma seringa de 3 ml e um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente para o tubo com as fatias de cérebro.
    8. Mecanicamente dissociar as células por trituração suavemente 10-20 vezes, até que pedaços de tecido visível desaparecer. Use um, fogo-polido Pasteur pipeta conectado-algodão e evitar fazer bolhas durante a trituração.
    9. Espere 3 min para as pequenas peças para sossegar.
    10. Transferir a maioria da solução (~ 1,5 mL, deixando alguma solução na parte inferior) para um tubo de centrifugação de 15 ml, que contém 3 ml de solução de Hanks solução de FBS + 20% (4 ° C), utilizando-se conectado a-algodão, fogo pipeta Pasteur polida. Não transferir toda a solução, porque a inclusão de qualquer sedimento no fundo tipicamente resulta na deterioração da cultura.
    11. Centrifugar durante 13 minutos a ~ 185 g (~ 1100 rpm) a 4 ° C.
    12. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente,adicionar 1 ml de pré-aquecido plaqueamento médio (37 ° C) para o sedimento, e ressuspender que pipetando suavemente várias vezes usando o ligado-algodão, polido-fogo pipeta de Pasteur.
      NOTA: Três tipos diferentes de plaqueamento media são utilizados para fins de cultura diferentes: chapeamento de médio 1 para células gliais do mouse, chapeamento de meio-2 para os neurônios de rato, e plaqueamento de médio 3 para os neurônios de ratos e células gliais (ver Tabela 1 para composições) .
    13. Retire 10 ul da suspensão celular, misturá-la com 10 ml de solução de azul de tripano a 0,4%, e medir a densidade de células vivas, utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
  2. Cultures Rato da glia
    1. Lave as lamelas para ajudar a estabelecer culturas de células de ratos saudáveis.
      1. Mergulhe lamelas de vidro (redondo, 12 mm de diâmetro) em ácido nítrico a 70% em uma placa de Petri de vidro. Proteger da luz usando papel alumínio e coloque-o em um shaker orbital O / N.
      2. Lavar o coversli vidrops na placa de Petri, pelo menos, três vezes com água destilada. Mergulhe-os em água destilada. Coloque o prato em um shaker orbital O / N.
      3. Seque as lamelas em um papel de filtro Whatman 150 milímetros na cabine de segurança biológica.
      4. Autoclave as lamelas.
      5. Coloque as lamelas em 24 poços cultura prato.
    2. Rótulo e genotípicas camundongos recém-nascidos de acordo com as etapas 1 e 2.
    3. Obter as células do cérebro dos filhotes de rato, de acordo com a etapa 3.1.
      NOTA: O uso do córtex cerebral é típico para a preparação da camada de rato alimentador glial. No entanto, outras regiões do cérebro, tais como o hipocampo e estriado, funcionará após o ajuste adequado da densidade celular devido a diferentes números e os rendimentos de células de diferentes regiões.
    4. Adicionar ~ 4 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1 para a suspensão final de células (~ 1 mL). Por meio de cultura de pré-aquecimento, coloque a solução na incubadora de cultura (5% de CO 2 e 95% de O 2, 37 ° C) S / N, apermitir que os valores de temperatura e pH para estabilizar.
    5. Transferir a suspensão celular a um balão de cultura T25 não revestido, utilizando o plugado-algodão, fogo-polido Pasteur pipeta. Colocar o balão na incubadora cultura.
    6. Fim de 1 dia in vitro (DIV), lavar as células cultivadas no frasco T25 duas vezes com meio de plaqueamento-1 (4 ° C). Colocar o balão de volta na incubadora. Realizar a lavagem por aspiração do meio dentro do frasco completamente com uma pipeta de Pasteur, a adição de ~ 5 ml de meio fresco e inclinando gentilmente o balão várias vezes em um movimento giratório.
    7. Em 6-9 DIV, (isto é, um dia antes da tripsinização e plaqueamento em lamelas, em passos 3.2.8-3.2.13), 100 ul de colocar o material de revestimento com proteínas da matriz extracelular (ver Tabela de Materiais / Equipamento para comentários sobre o material de revestimento) sobre as lamelas de vidro em um prato de cultura, e colocar a placa de cultura na incubadora de cultura.
    8. Em 7-10 DIV, quando as células são 20-40% confluentes (espacialmente contínua), trypsinize eles.
      1. Lavar o balão de uma só vez, por aspiração de toda a solução dentro do frasco e adicionando ~ 13 ml de solução de Hanks (4 ° C), incline suavemente o frasco várias vezes em um movimento giratório, e aspirar a solução completamente.
      2. Adicionar 40 ul de solução de ADNase (concentração final, 750 unidades / ml) a 4 ml de solução de tripsina-EDTA, passar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente para as células do frasco.
      3. Deixe a tripsinização prosseguir durante 13 min a 37 ° C na incubadora.
      4. Neutraliza-se a solução de tripsina por adição de 2 ml de 100% de FBS (4 ° C) para o balão.
      5. Transferem-se as células tratadas com tripsina para um tubo de centrifugação de 15 ml usando um de 5 a 10 ml de pipeta, adicionar ~ 4 ml de solução de Hanks '+ FBS a 20% (4 ° C), centrifugar a ~ 185 g e 4 ° C durante 13 min e aspirar o sobrenadante.
    9. Ressuspender o sedimento em 1 ml de pré-warmemeio-1 d chapeamento.
    10. Medir a densidade das células de acordo com o passo 3.1.13.
    11. Aspirar o material de revestimento completamente a partir das lamelas de vidro, e a placa de ~ 50 ul de células gliais ressuspensas em lamelas.
      NOTA: Estas células irá estabelecer a camada de alimentação glial.
    12. Coloque a placa de cultura com lamelas na incubadora.
    13. 20-60 min mais tarde, adicionar 1 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1 a cada poço, e colocar o prato de volta na incubadora. Nota: Embora o meio de revestimento é adicionada, será útil para utilizar outra pipeta para pressionar para baixo da periferia da lamela (onde não existem células plaqueadas), de modo que a lamela não irá flutuar no meio.
    14. Em 1 DIV da camada alimentadora glial (ou seja, na lamela de vidro), substituir o meio com 1 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1, aspirando-se toda a solução em um poço e depois enchendo-a com meio fresco.
    15. Em 2-3 DIV da camada alimentadora da glia, quando o cells são 80-100% confluentes, adicionar inibidor mitótico (10 ul de uma mistura de 5-fluoro-2'-desoxiuridina + uridina; concentrações finais de 81,2 e 204,8? M, respectivamente) a cada poço, para inibir a replicação do ADN e, por conseguinte, a suprimir a proliferação de células gliais.
    16. Em 7-9 DIV, quando as células são 90-100% confluentes (1-2 h antes do plaqueamento neurónios na camada alimentadora glial), substituir o meio de cultura com pré-aquecido plaqueamento meio-2 (37 ° C).
      NOTA: Os neurónios vai ser revestida no mesmo dia, utilizando o passo 3.4.
  3. Cultures Rat gliais
    1. Bata de um frasco de cultura T25 com o mesmo material de revestimento.
      NOTA: É necessário para posterior remoção das células não aderentes no passo 3.3.5.
      1. Adicionar 2.0 ml do material de revestimento para o balão, e colocar o balão no incubador de cultura.
      2. Após 2-3 h, aspirar o material de revestimento completo, de tal modo que o piso do frasco torna-se seca.
    2. Obter as célulasdas crias de rato, de acordo com o passo 3.1.
      NOTA: A região CA3-CA1 do hipocampo é usado para a preparação da camada de rato alimentador glial. No entanto, outras regiões do cérebro, tais como o córtex cerebral e corpo estriado, vai funcionar depois de se ajustar para diferenças na densidade das células, devido a diferentes números e os rendimentos de células de diferentes regiões.
    3. Adicionar ~ 4 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-3 para a suspensão de células final (~ 1 mL).
    4. Transferir a suspensão de célula para o balão de cultura T25 revestidos, utilizando-se conectado a-algodão, polido-fogo pipeta de Pasteur. Colocar o recipiente na incubadora de cultura (5% de CO 2 e 95% de O 2, 37 ° C).
    5. Em 2-3 DIV, quando as células são 20-40% confluentes, remover não-aderente ou fracamente células aderentes, fechando a tampa firmemente, agitando vigorosamente ~ 10 vezes, aspiração da solução, e a adição de 4-5 ml de chapeamento 3-forma (a 4 ° C). Repita este procedimento uma vez. Examine as células cultivadas em todo o piso balão (por exemplo,usando microscópio de contraste de fase) para confirmar que as que aparecem neuronal (ou seja, aqueles para os quais a borda exterior do corpo da célula aparece fase brilhante) são completamente removidas. Repita o procedimento quantas vezes for necessário para eliminar essas células, e em seguida, retornar o frasco para a incubadora.
      NOTA: A força e o número total de "shakes" necessários podem variar entre experimentadores individuais. O importante é não manter o número total de shakes para um número definido, mas para confirmar que as células neuronais-like são eliminados.
    6. No 6-8 DIV, quando as células são 90-100% confluentes, a passagem das células gliais por trypsinizing-los como no passo 3.2.8.
    7. Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), adicionam-se 10 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), transferência das células tratadas com tripsina para um balão T75 não revestida, e em cultura deles a incubadora.
      NOTA: as células gliais Rato será passadas duas vezes; em contraste, as células gliais de rato are passadas apenas uma vez, porque eles se tornam insalubres após várias passagens. Células gliais de rato vai ser passadas em frascos T75 que não são revestidas com qualquer material de revestimento. O revestimento permite que as células da glia de ratos a crescer muito rapidamente e produzem muitas células ciliadas (células ependimárias putativos), que irá deteriorar-se a condição de cultura neuronal mais tarde.
    8. Em 17-19 DIV de cultura num balão de glial (isto é, 11 dias após passaging e um dia antes da tripsinização e plaqueamento em lamelas de cobertura por passos 3.3.9-3.3.14), 100 ul de colocar o material de revestimento em lamelas de vidro não lavadas ( redondo, 12 mm de diâmetro) numa placa de cultura, e colocar a placa de cultura na incubadora de cultura.
      NOTA: Para as culturas da glia de ratos, a diferença não foi notado nos resultados de cultura com ou sem lavar as lamelas.
    9. Em 18-20 DIV da cultura glial no frasco (ou seja, 12 dias após passaging), prepare a camada de alimentação glial por trypsinizing as células cultivadas, de acordo com step 3.2.8.
    10. Durante a centrifugação, aspirar o material de revestimento completamente a partir das lamelas de vidro.
    11. Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), e medir a densidade de células, de acordo com o passo 3.1.13.
    12. Ajustar a densidade de 10 4 glial vivo células / ml, e a placa 100 uL da suspensão de células glial nas lamelas de vidro revestidas.
      NOTA: Estas células irá estabelecer a camada de alimentação glial.
    13. Coloque a placa de cultura com lamelas na incubadora por 20-60 min.
    14. Adicionar 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C) a cada poço, e colocar o prato de volta na incubadora.
    15. Em 3-4 DIV da camada alimentadora da glia, quando as células na lamela são 40-80% confluentes, adicionar 1 ml de meio de crescimento pré-aquecido (ver Tabela 1 para a composição) que contém citosina β-D-arabinofuranósido ( AraC, concentração final de 4 mM) para parar a proliferação de células gliais. Placa neurônios a 7-9 DIV da camada alimentadora da glia, quando as células são 60-80% confluente, utilizando o passo 3.4.
  4. Cultures Rato Neuronal
    1. Rótulo e genotípicas camundongos recém-nascidos de acordo com as etapas 1 e 2.
    2. Use os filhotes de rato para o passo 3.1.
    3. Ajuste a densidade da suspensão de células ao vivo para ~ 2,0 x 10 5 células / ml, utilizando pré-aquecido chapeamento meio-2 para plaqueamento em células gliais do mouse, ou usando o plaqueamento meio-3 para plaqueamento em células gliais de rato.
    4. Placa as células na camada alimentadora glial, adicionando suavemente a suspensão de células para o meio de cultura de cada poço. Nota: O volume da suspensão celular a ser adicionada é determinada pelo número de células alvo num poço de cultura. Por exemplo, a placa de ~ 60 ul de suspensão de células para atingir 12.000 células / poço.
    5. Note-se que não há solução muda são necessárias após os neurônios são banhados. Ter cuidado para evitar a evaporação da solução das cavidades ao longo do curso da cultura, por humedecimento do o interiorf incubadora de cultura.

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Resultados

Como exemplo da aplicação deste protocolo, os resultados representativos são mostrados para a rotulagem de camundongos por tatuagem, genotipagem de confiança sob várias condições experimentais, e estabelecendo culturas neuronais primárias em camadas alimentadoras gliais.

Tatuagem

Crias recém-nascidas foram marcadas nas almofadas das patas utilizando um sistema de tatuagem ('recém-nascido' na Figura 1). Os rótulos permaneceu clara...

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Discussão

O protocolo aqui apresentado inclui os procedimentos para a tatuagem para marcar / identificar ratos, camundongos para a genotipagem de pontas da cauda, ​​e para a cultura de neurônios do cérebro do rato em baixa densidade. Em uma rodada de experimentos usando 6-8 filhotes, estes procedimentos normalmente requerem ~ 0,5 hr, ~ 4 horas e ~ 2 horas, respectivamente, em um total de 6-7 horas. Isto torna mais prático para um único experimentador para completar todos os procedimentos necessários a partir do momento do nascime...

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Divulgações

O autor (Zhengmin Huang) é o presidente da EZ BioResearch LLC que produz os reagentes descritos neste artigo.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos pesquisadores da Universidade de Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins e Beverly Davidson pelas instruções e comentários úteis sobre as culturas estriadas, e aos Drs. Kara Gordon, Nicole Bode e Pedro Gonzalez-Alegre pela assistência e discussões sobre a genotipagem. Também agradecemos ao Dr. Eric Weyand (Sistemas de Identificação e Marcação de Animais) pelos comentários úteis sobre a tatuagem, e ao Dr. Shutaro Katsurabayashi (Universidade de Fukuoka) pelos comentários úteis sobre a cultura do rato. Este trabalho foi apoiado por doações da American Heart Association, do Departamento de Defesa (prêmio W81XWH-14-1-0301 do Programa de Pesquisa Médica Revisado por Pares), da Dystonia Medical Research Foundation, da Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, da National Science Foundation e da Whitehall Foundation (NCH).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
REAGENTES - Máquina de tatuagem
LimpadorIdentificação e Marcação de Animais, Inc.NMCR3Isso é usado para limpar as agulhas e o suporte após a tatuagem.
Agente de secagem de máquinaSistemas de identificação e marcação de animais, Inc.NDAR4É usado para secar as agulhas e o suporte após a limpeza.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Aplicador de Preparação de PeleSistemas de Identificação e Marcação de Animais, Inc.NSPA1Ponta Q.
Solução de preparação da peleSistemas de identificação e marcação de animais, Inc.NSP01Este reagente fornece uma fina camada de óleo que aumenta a eficiência da tatuagem e previne o desbotamento da tatuagem, por (informações do fornecedor): 1) evitando que a pele não tatuada seja manchada temporariamente, permitindo assim que a qualidade de uma tatuagem de almofada de pata seja facilmente avaliada antes que o filhote seja devolvido à sua gaiola de origem – A superfície da pele manchada pode ser confundida com a pele tatuada, 2) reduzindo os danos à pele durante a tatuagem - Amolecer a pele e lubrificar a agulha ajudará a agulha a penetrar na pele sem causar danos à pele e 3) impedir que o oxigênio molecular entre na pele, reduzindo assim as respostas inflamatórias às espécies reativas de oxigênio que podem ser geradas.
REAGENTES - genotipagem
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Formato de Tubo de Tira)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100Um corante vermelho, de carga para eletroforese, está incluído na solução 2X PCR Ready Mix.
Solução de Lise de Tecido AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare a Solução de Extração de DNA misturando 20 µ l de Solução de Lise Tecidual A e 180 µ l de solução de lise tecidual B por amostra.
Solução de Lise de Tecido BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare a Solução de Extração de DNA misturando 20 µ l de Solução de Lise Tecidual A e 180 µ l de solução de lise tecidual B por amostra.
Ácido acético, glacialVWRBDH 3092
Grau otimizado para agarose, grau de biologia molecularrpiA20090-500 Usamos géis de agarose a 2% em tampão TAE contendo a coloração de gel de DNA SYBR Safe (diluída 10.000 vezes) ou brometo de etídio (0,5 µ g/ml de volume de gel).
Brometo de etídioSigma-AldrichE7637-1G
Ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico dihidratado (EDTA)FisherBP120-500
Pontas de Pipeta Filtradas, Sem Aerossóis, 0.1-10 µ lDot Scientific IncUG104-96RS Use pontas de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada.
Pontas de Pipeta Filtradas, Pontas de Filtro de Ajuste Premium, 0.5-20 µ lDot Scientific IncUG2020-RSUse ponteiras de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada.
Pontas de Pipeta Filtradas, Pontas de Filtro de Ajuste Premium, 1-200 µ lDot Scientific IncUG2812-RSUse ponteiras de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada.
Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001Usamos qualquer um desses três marcadores de peso molecular.
Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Marcador de peso molecular, TrackIt, 100 bp DNA LadderTubos PCR GIBCO-Invitrogen10488-058
, 8 tiras de tubos com tampas de cúpula individualmente anexadas, naturais, 0,2 ml USA Scientific1402-2900Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Uma tira de 8 tubos é fácil de manusear e agrupar as amostras do que os tubos individuais.
Tubos de PCR, Ultraflux Individual rpi145660Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase.
Tubo de microcentrífuga Seal-Rite 0,5 ml, naturalUSA Scientific1605-0000Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase.
Coloração segura do gel do ADN de SYBR * concentração de 10.000x em DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primeiras demão para amplificar o gene de Tor1a dentro Δ Camundongos knock-in E-torsinA Esses primers foram usados em uma concentração final de 1,0 ng/µ l (~0,16 µ M) (referência 2).
Primers para amplificação do gene Tfap2a em camundongos5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (para frente), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverso) para o amplicon de 498 pb, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (para frente), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverso) para o amplicon de 983 pb, e 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (para frente), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverso) para o amplicon de 1990 pb. Esses primers são usados a 0,5 µM.
REAGENTES - cultura
5-Fluoro-2′-desoxiuridinaSigma-AldrichF0503-100MGConsulte a seção de comentários da uridina para obter mais informações.
Suplemento B-27GIBCO-Invitrogen17504-044
Placas de cultura de células 35 x 10 mm,de falcão BDcom cultura 353001 de
tecidos, T25, tratados com cultura de tecidos, pescoço inclinado, tampa de vedação de plugue, área de crescimento de 25 cm2353082
de falcão BD de 70 mlFrascos de cultura de células, T75, tratados para cultura de tecidos, pescoço inclinado, tampa ventilada, 75 cm2 Área de crescimento, 250 mlBD falcon353136
Tubo cônico, polipropileno, 15 mlBD falcon352095
Countess (contador de número de células) lâminas de câmaraGIBCO-InvitrogenC10312
Cloridrato de citosina β-D-Arabinofuranosídeo (cloridrato de Ara-C)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glicose (Dextrose) anidra, SigmaUltra, 99,5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Prato, Vidro de Petri 100 x 15 mmPyrex3160-101
Água destiladaGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Tipo IISigma-AldrichD4527-200KUA solução de estoque é preparada a 1.500 unidades/20 μ l = 75.000 unidades/ml em água destilada.
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta, GlutaMAX, piruvatoGIBCO-Invitrogen10569-010,
, 250 ml, membrana de 50 mm de diâmetro, 0,2 µ m Tamanho dos PorosNalgene568-0020
Unidade de Filtro PES Rápido, 500 ml, membrana de 90 mm de diâmetro, 0.2 µ m Tamanho dos PorosNalgene569-0020
Soro fetal bovino (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Lamínula de vidro, 12 mm Redondo, espessura 0.09– 0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Sais Balanceados Hanks'Sigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥ 99,5% (titulação)Sigma-AldrichH3375-250G
Ácido clorídrico, 37%, reagente ACSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinaSigma-AldrichI5500-250 mg
Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4•( 7H2O), BioUltra, ≥ 99,5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Biosciencessem vermelho de fenol356237Este é o material de revestimento para lamínulas e frascos. 1) Para prepará-lo, descongele a solução de matriz de membrana basal Matrigel no gelo, o que geralmente leva ~ 1 dia. Com uma pipeta pré-arrefecida, alíquota da solução descongelada em balões T25 pré-arrefecidos sobre gelo e conservar os balões a -20 °C. Para preparar a solução de Matrigel de trabalho, descongele o Matrigel alíquota em um frasco com gelo, dilua 50 vezes adicionando a solução de MEM pré-resfriada e mantenha a solução diluída a 4 ° C. É importante pré-resfriar todos os utensílios de cultura e meios que entram em contato com o Matrigel, exceto durante e após o revestimento das lamínulas, para evitar que forme um gel prematuramente. 2) Para revestir as lamínulas de vidro ou frascos de cultura com Matrigel, aplique a solução de Matrigel na superfície. Antes de revestir as células, é importante secar completamente a superfície. Para este fim, pode ser útil aspirar Matrigel durante a centrifugação celular imediatamente antes de plaquear as células e dar tempo suficiente para a secagem.
Meio essencial mínimo (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
Extensor de soro MITO+, 5 mlBD Biosciences355006
Placas multipoços, Placa de 24 poços tratada com cultura de tecidosFalcão BD353047
Placas multipoços, Placa de 6 poços tratada com cultura de tecidosFalcão BD353046
Meio Neurobasal-A (1X), líquidoGIBCO-Invitrogen10888-022
Ácido NítricoVWRbdh 3044
NS (Suplemento Neuronal) 21 preparado em laboratórioFonte: referência 69
pipetas de Pasteur, 5 ¾ ”  Fisher13-678-6AUse este plugue de algodão 5 ¾ ” Pipeta Pasteur para trituração celular. Polir a ponta com fogo de antemão para alisar a superfície de corte e reduzir o diâmetro interno para 50-80% do original. Uma ponta muito pequena interromperá as células e reduzirá a viabilidade celular, mas uma ponta muito grande diminuirá a eficiência da trituração.
Pipetas Pasteur, 9"  Cloreto de potássio Fisher13-678-6B
(KCl), SigmaUltra, ≥ 99,0%Sigma-AldrichP9333-500G
Pipeta sorológica, 2 mlBD falcon357507
pipeta sorológica, 5 ml sorológica 357543falcão BD
pipeta sorológica357551falcão BD
10 ml, pipeta sorológica357525falcão BD
, 50 ml BD falcon357550
Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Hidrogenocarbonato de sódio), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS6297-250G
Cloreto de sódio (NaCl), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS7653-250G
Hidróxido de sódio (NaOH), pellets, 99,998% à base de metais traçosSigma-Aldrich480878-250G
Fosfato de sódio dibásico heptahidratado (Na2< / sub>HPO4< / sub>•( 7H2O)), ≥ 99,99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥ 99,5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Filtro de seringa, estéril, 0,2 µ m431219Corning
, 3 mlBD falcon309585
Transferrina, Holo, plasma bovinoCalbiochem616420
Coloração azul de tripano, 0,4%GIBCO-InvitrogenT10282Isso é usado para contar células vivas / mortas. Renove uma solução velha de azul de tripano se ela for reutilizada muitas vezes (por exemplo várias vezes por semana durante várias semanas), pois formará precipitados e resultará em leituras errôneas da densidade celular.
Tripsina, tipo XISigma-AldrichT1005-5G
Solução de tripsina-EDTA, 0,25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5Gé preparada em 50 mg de 5-fluoro-2'-desoxiuridina e 125 mg de uridina em 25 ml de DMEM (8,12 e 20,48 mM, respectivamente).
REAGENTES - imunocitoquímica
Anticorpo, anti-MAP2 policlonal de coelhoMerck MilliporeAB5622
Anticorpo, coquetel monoclonal anti-GFAP de camundongoMerck MilliporeNE1015
EQUIPAMENTO - tatuagem
AIMSSistemas de Identificação e Marcação de Animais, Inc.NEO– 9Este sistema de tatuagem de roedores recém-nascidos é um sistema elétrico que funciona movendo rapidamente agulhas de tatuagem de 1 ou 3 pontos verticalmente na pele. Ative a máquina de tatuagem uma vez por aproximadamente 0,5 segundos, enquanto as pontas das agulhas de tatuagem são mantidas perpendiculares à superfície da pele. Preferimos a tatuagem com três agulhas para maximizar a área tatuada, mas a tatuagem com uma agulha é eficaz em áreas mais estreitas, os dedos dos pés, ou se for necessário um controle mecânico fino, e.g. quando os números são tatuados. Duas rodadas de tatuagem na velocidade mais lenta (definindo "1" de 3 etapas) são normalmente suficientes para produzir uma tatuagem visível e duradoura das almofadas das patas.
EQUIPAMENTO - sistema de eletroforese de genotipagem
, horizontal, Wide Mini– Subcélula GTBIO– RAD170– 4405Os parâmetros típicos de eletroforese são intensidade do campo elétrico a 6 V / cm e duração de 25 minutos para um gel de 10 cm.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini TermocicladorBIO-RADPTC-1148EDUNossas reações de PCR para o gene Tor1a em Δ Os camundongos knock-in E-torsinA são os seguintes: 1 ciclo de desnaturação a 94 ° C por 3 min, 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 30 seg, recozimento a 58 ° C por 30 seg, extensão em 72 ° C por 2 min. Isso é seguido pela extensão final em 72 &# 176; C por 10 min e mantendo a 4 °C.
Fonte de alimentação, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPAMENTO - cultura
Contador de células automatizado, CondessaGIBCO-InvitrogenC10310Este contador de células automatizado mede separadamente as densidades de células vivas e mortas (não coradas e coradas por azul de tripano, respectivamente). É importante conhecer a faixa ideal de medições de densidade: o contador que usamos tem a maior precisão na faixa de 1 x 105 a 4 x 106 células/ml. Se os valores de densidade celular medidos estiverem fora da faixa recomendada, ajuste o volume de ressuspensão adequadamente.
Gabinete de Segurança Biológica, Classe II, Tipo A2NUAIRENU-425-400Este capuz é usado para todos os procedimentos de cultura de células, exceto para dissecção cerebral.
CO2 Incubadora, AutoFlow, Camisa de Água com Controle de UmidadeNUAIRENU-4850
Bancada Limpa HorizontalNUAIRENU-201-330Esta bancada limpa é usada para dissecção cerebral (etapas 3.1.1 e 3.1.2 de "Dissecção Cerebral e Dissociação Celular)".
Orbit LS Agitador de Baixa VelocidadeLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Centrífuga SupervelocidadeFisher46910 (centrífuga)/46922 (rotor)
Sistemas de 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (para frente) e 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverso) (referência 18). selvagens de células Frascos de cultura de células tratados , Unidade de Filtro PES Rápido de 500 mlSolução de matriz de membrana basal , BD Pipeta , de de 25 ml Seringa A solução estoque de células

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