O transporte axonal de BDNF, um factor neurotrófico, é crítico para a sobrevivência e função de várias populações neuronais. Algumas desordens degenerativas são marcadas pela ruptura da estrutura e função axonal. Nós demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários.
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Artigo de método
Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios
Neste artigo
Resumo
Resumo
BDNF desempenha um papel importante em vários aspectos da sobrevivência neuronal, diferenciação e função. Défices funcionais e estruturais no axônios são cada vez mais vistos como uma característica precoce de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Huntington (DH). Como ainda é pouco claro o mecanismo (s) pelo qual é induzida lesão axonal. Nós relataram o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que pode ser utilizado para rastrear o transporte axonal de BDNF. Quantum dot marcado BDNF (QD-BDNF) foi produzido pela conjugação de ponto quântico 655 a mBtBDNF. Um dispositivo de microfluidos foi usada para isolar axónios de corpos celulares de neurónios. A adição de QD-BDNF ao compartimento axonal permitiu imagens ao vivo de transporte BDNF nos axônios. Nós demonstramos que QD-BDNF movido essencialmente exclusivamente retrogradamente, com muito poucas pausas, a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg. Este sistema pode ser utilizado para me investigarcanismos de função axonal interrompido no AD ou HD, bem como outras doenças degenerativas.
Introdução
Os neurônios são as células cujos processos longos e muitas vezes altamente elaborados são fundamentais para estabelecer e manter a estrutura ea função dos circuitos neurais altamente polarizada. O axônio desempenha um papel vital no que transportam cargas de e para as sinapses. As proteínas e organelas sintetizados no soma célula necessita de ser transportado por axónios para chegar ao terminal pré-sináptico para suportar a função neuronal. Do mesmo modo, os sinais recebidos pelo axónios distais devem ser transduzidas e transportado para o soma. Estes processos são essenciais para a sobrevivência neuronal, diferenciação e manutenção. Em que o transporte axonal em ne....
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Protocolo
Os procedimentos cirúrgicos e de animais são realizadas estritamente de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os experimentos que envolvem o uso de animais são aprovados por UCSD Animal Care Institucional e Comitê de Uso.
1. plasmídeo Clonagem, expressão e purificação do mono-biotinilado BDNF (mBtBDNF)
NOTA: Construir pré-proBDNFavi e BirA cDNA em vetor pcDNA3.1 e co-expressar em células HEK293FT 10. Purificar mBtBDNF utilizando pérolas de Ni-NTA de acordo com o método previamente publicado de produzir factor de crescimento do nervo monobiotinylated madura e bi....
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Resultados
Produção e Purificação de BDNF Mono-biotinilado Biologicamente Activo
O vector de expressão de BDNF fundida com uma sequência de AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) foi criado de acordo com um protocolo previamente publicado 10. A massa molecular da proteína de fusão de comprimento completo foi previsto para ser ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated BDNF maduro com uma massa molecular esti.......
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Discussão
Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que podem ser utilizados para rastrear o transporte axonal de BDNF. Conjugando a proteína a estreptavidina quantum dot, e usando uma câmara de microfluidos, o método permite detectar o transporte axonal de BDNF nos neurónios primários com sensibilidade única molécula, em tempo real e com resolução espacial e temporal. As ferramentas aqui utilizadas fornecer um meio pelo qual a estudar as m.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit por sua assistência técnica. O estudo foi financiado pelo NIH concessão (PN2 EY016525) e pelo financiamento da Síndrome de Down Research Foundation e Tratamento eo Larry L. Fundação Hillblom.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Polimerase de DNA pfx de platina | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT células | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-mídia de alta glicose | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotina | Sigma | B4639 | |
| TurboFect; | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Resinas Ni-NTA | Qiagen | 30250 | |
| Inibidores de protease coquetel | Sigma | Kit de coloração de prata S8820 | |
| G-Biosciences | 786-30 | ||
| BDNF humano recombinante | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 lamínulas de vidro | VWR | 48393-060 | |
| Poli-L-Lisina | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Tripsina | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-estreptavidina conjugados | Invitrogen | ||
| anticorpo anti-Avi GenScript | A00674 | ||
| esferas de estreptavidina-agarose | Tecnologia da Vida | SA100-04 | |
| Ácido tricloroacético | Sigma | T6399 | |
| HRP-estreptavidina | Anticorpo | Thermo Scientific N100 | |
| um presente generoso do Dr. M. Chao do | |||
| BD Science | 610101 |
Referências
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular O....
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Reimpressões e permissões
