O enriquecimento de gDNA para sequenciamento NGS é uma ferramenta fácil e poderosa para o estudo de mutações constitucionais. Neste artigo, apresentamos o procedimento para analisar de forma simples a sequência completa de 11 genes envolvidos no reparo de danos ao DNA.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA
Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso generalizado de Next Generation Sequencing abriu novos caminhos para a pesquisa do câncer e diagnóstico. NGS trará enormes quantidades de novos dados sobre o câncer e, especialmente, genética do câncer. O conhecimento atual e futuras descobertas tornará necessário estudar um grande número de genes que poderiam estar envolvidos em uma predisposição genética para o câncer. Neste sentido, foi desenvolvido um projeto para estudar Nextera 11 genes completos envolvidos no DNA reparação de danos. Este protocolo foi desenvolvido para estudar com segurança 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 e TP53) do promotor de 3'-UTR em 24 pacientes simultaneamente. Este protocolo, baseado em tecnologia de transposase e gDNA enriquecimento, dá uma grande vantagem em termos de tempo para o diagnóstico graças genética para provar multiplexação. Este protocolo pode ser utilizado com segurança com ADNg sangue.
Introdução
Em 2010, cerca de 1,5 milhões de pessoas (essencialmente mulheres) desenvolveram câncer de mama em todo o mundo. Estima-se que 5 a 10% dos casos eram hereditários. Quase 20 anos atrás, BRCA1 e BRCA2 foram identificados como envolvidos na mama hereditário e câncer de ovário 1. Desde cerca de 15 anos atrás, BRCA1 e BRCA2 regiões codificantes foram sequenciados para determinar a predisposição genética para câncer de mama e ovário. Alterações nos genes BRCA1 e BRCA2 são detectados em 10 a 20% das famílias seleccionadas 2 sugerindo que a análise destas regiões não é suficiente para um rastreio efi....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1 Avaliação de gDNA (DNA genômico) Rendimento
- Quantificar recém-extraído gDNA antes da preparação da biblioteca. Use o método de avaliação de rendimento fluorométrica quantificar gDNA intacta (evitar o uso de um espectrofotômetro para avaliação de rendimento gDNA). Medir a proporção (260/280 nm) e assegurar que é entre 1,8 e 2 NOTA: 50 ng de gDNA são necessários para o experimento.
2. gDNA Enriquecimento: Dia 1 Manhã
- Antes da partida
- A partir do kit enriquecimento DNA (ver Tabela de Materiais / Equipamentos), descongele tampão DNA (DT) e da enzima DNA (TDE1) soluções no gelo. Pelo menos 30 min antes do....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Os resultados das amostras de CQ
A capacidade do presente método para determinar sequências de genes alvo se baseia na qualidade do ADNg (Figura 2A) e a qualidade do passo tagmentation. Se o tagmentation não é suficiente (Figura 2B, painel superior), a sequenciação não será satisfatória. Como mencionado acima, após a purificação tagmentation, o ADNg deve ser tagmented em fragmentos de 150 pb e 1000 pb, com a maioria dos fragmentos de cerca de 300 pb (Fi.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O amplo uso de dispositivos e tecnologias NGS tem proporcionado novas oportunidades no estudo de câncer e doenças genéticas. Além de seqüenciamento do genoma inteiro ou RNA sequenciamento, a análise de uma grande quantidade de seqüências gDNA selecionados em vários pacientes ao mesmo tempo oferece grandes perspectivas no diagnóstico. Aqui, desenvolvemos um projeto específico (disponível on demand) usando a tecnologia para estudar Nextera 11 genes completos em 24 pacientes, simultaneamente, com um dispositivo de transfer.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos à Ligue contre le Cancer de Côte d'Or e ao Centre Georges-François Leclerc por seu apoio financeiro. Agradecemos a Philip Bastable pela edição do manuscrito.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Dispositivo de sequenciamento/rendimento médio |
| Nextera Kit de enriquecimento | Illumina | FC-123-1208 | Tecnologia baseada em transposase |
| Cartucho de 300 ciclos | Contas | Illumina 15033624 | |
| AMPure | Beckman Coulter | A63881 | Contas de purificação magnéticas |
| Suporte magnético | Alpaqua | A32782 | |
| Placas de 96 poços | Life Technologies | 4306737 | |
| Placas MIDI de 96 poços | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | Este selo é necessário apenas para amplificação por PCR. Outros selos padrão podem ser usados durante todo o experimento |
| MiSeq | Illumina | Fornecido com o dispositivo de sequenciamento Software Experiment Manager Endereço de Internet: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Ferramenta do site do fabricante |
Referências
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
