Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Resumo

Superfície Plasmon Resonance (SPR) é um método livre de marcador para a detecção de interacções biomoleculares em tempo real. Nisto, um protocolo para uma proteína de membrana: interação experimento receptor é descrita, ao discutir os prós e contras da técnica.

Resumo

As interações proteína-proteína são fundamentais para a maioria, senão todos, os processos fisiológicos, e entender a natureza de tais interações é um passo central na pesquisa biológica. A Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) é uma técnica de detecção sensível para estudo sem marcação de interações biomoleculares em tempo real. Em um experimento típico de SPR, um componente (geralmente uma proteína, denominada 'ligante') é imobilizado na superfície de um chip sensor, enquanto o outro (o 'analito') é livre em solução e é injetado sobre a superfície. A associação e a dissociação do analito do ligante são medidas e plotadas em tempo real em um gráfico chamado sensograma, a partir do qual os dados de pré-equilíbrio e equilíbrio são derivados. Ser livre de marcadores, consumir baixas quantidades de material e fornecer dados cinéticos de pré-equilíbrio, muitas vezes torna o SPR o método de escolha ao estudar a dinâmica das interações de proteínas. No entanto, deve-se ter em mente que, devido à alta sensibilidade do método, os dados obtidos precisam ser cuidadosamente analisados e apoiados por outros métodos bioquímicos.

SPR é particularmente adequado para estudar proteínas de membrana, pois consome pequenas quantidades de material purificado e é compatível com lipídios e detergentes. Este protocolo descreve um experimento de SPR caracterizando as propriedades cinéticas da interação entre uma proteína de membrana (um transportador ABC) e uma proteína solúvel (a proteína de ligação ao substrato cognato do transportador).

Introdução

Interacções proteína-proteína (PPI); a formação e dissociação de complexos de proteínas, são eventos chave em muitos processos biológicos (por exemplo, a replicação, transcrição, tradução, sinalização, comunicação célula-célula). Estudos semi-quantitativa da PPI são muitas vezes realizados experimentos usando imuno-precipitação pull-down ou. No entanto, estas técnicas (e semelhantes) estão limitados na gama de afinidades que pode ser medida (micromolar baixa e maior afinidade), devido aos passos de lavagem que são inerentes a tais técnicas. Tais técnicas "ponto final" não é possível identificar interações afinidade transitórios ou baixos que muitas vezes são....

Protocolo

1. A amostra de proteína e tampão de preparação de

1. Preparação da amostra: purificar as proteínas de interesse e certificar-se de todos os agregados são removidos, através da injecção da proteína antes da experiência, numa coluna de filtração em gel ou por ultracentrifugação (geralmente de 10 minutos a 100.000 xg é suficiente).
   Nota: Embora desejáveis, preparações de proteínas altamente puras não são uma obrigação. SPR tem sido usado com sucesso com purificações menos-que-perfeito e mesmo com ^8,9 total de extrato.
2. Tampão de preparação:
   1. Preparar o tampão do experimento (chamado de "tampão de corrida", ou RB). Para o proto....

Resultados

No sistema aqui descrito, um chip NiNTA é usado para imobilizar o transportador de membrana marcada com His ^6,7. Sendo um homo-dímero, cada transportador é duplamente marcado, melhorando a sua ligação ao chip NiNTA. Após o carregamento de níquel, ligando A (o transportador de interesse) é imobilizada em Fc = 2, até ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A tarja preta). Em seguida, utilizando o mesmo caudal e da duração da injecção, ligando B (do ligando de controlo) injecta-se Fc = 1, inici.......

Discussão

SPR é um método altamente sensível para estudar interações moleculares, e muitas vezes é a única abordagem que permite o monitoramento em tempo real das interações transitórios (mas importantes). Um exemplo é a interacção transiente aqui apresentada, que não poderia ser detectado por qualquer outro método (ensaios de pull-down, ensaios de lipossomas de sedimentação ^6). Além disso, enquanto que outros métodos são limitados ao equilíbrio medições (seja qualitativo ou quantitativo), SPR é uma das únicas técnicas.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAavaliação	Software GE Healthcare
Biacore T200	GE Healthcare
Cloreto de níquel	Sigma	N6136
Tungstato de sódio dihidratado	Sigma	T2629
Cloreto de sódio	Bio-Lab LTD.
Base Trizma	Sigma	T1503
Ácido etildilamina-tetracético sal dissódico di-hidratado (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecil-β-D-Maltopiranosídeo (DDM)	Affymetrix	D310
Solução de dodecil sulfato de sódio	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Ácido clorídrico	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Filtro de membrana	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC transportador	Lewinson lab
RbsBC ABC transportador	Lewinson lab
Laboratório			Lewinson

19030591 de proteína de ligação ao substrato ModA