Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Resumo

Superfície Plasmon Resonance (SPR) é um método livre de marcador para a detecção de interacções biomoleculares em tempo real. Nisto, um protocolo para uma proteína de membrana: interação experimento receptor é descrita, ao discutir os prós e contras da técnica.

Resumo

As interações proteína-proteína são fundamentais para a maioria, senão todos, os processos fisiológicos, e entender a natureza de tais interações é um passo central na pesquisa biológica. A Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) é uma técnica de detecção sensível para estudo sem marcação de interações biomoleculares em tempo real. Em um experimento típico de SPR, um componente (geralmente uma proteína, denominada 'ligante') é imobilizado na superfície de um chip sensor, enquanto o outro (o 'analito') é livre em solução e é injetado sobre a superfície. A associação e a dissociação do analito do ligante são medidas e plotadas em tempo real em um gráfico chamado sensograma, a partir do qual os dados de pré-equilíbrio e equilíbrio são derivados. Ser livre de marcadores, consumir baixas quantidades de material e fornecer dados cinéticos de pré-equilíbrio, muitas vezes torna o SPR o método de escolha ao estudar a dinâmica das interações de proteínas. No entanto, deve-se ter em mente que, devido à alta sensibilidade do método, os dados obtidos precisam ser cuidadosamente analisados e apoiados por outros métodos bioquímicos.

SPR é particularmente adequado para estudar proteínas de membrana, pois consome pequenas quantidades de material purificado e é compatível com lipídios e detergentes. Este protocolo descreve um experimento de SPR caracterizando as propriedades cinéticas da interação entre uma proteína de membrana (um transportador ABC) e uma proteína solúvel (a proteína de ligação ao substrato cognato do transportador).

Introdução

Interacções proteína-proteína (PPI); a formação e dissociação de complexos de proteínas, são eventos chave em muitos processos biológicos (por exemplo, a replicação, transcrição, tradução, sinalização, comunicação célula-célula). Estudos semi-quantitativa da PPI são muitas vezes realizados experimentos usando imuno-precipitação pull-down ou. No entanto, estas técnicas (e semelhantes) estão limitados na gama de afinidades que pode ser medida (micromolar baixa e maior afinidade), devido aos passos de lavagem que são inerentes a tais técnicas. Tais técnicas "ponto final" não é possível identificar interações afinidade transitórios ou baixos que muitas vezes são de grandes consequências biológicas. Além disso, a resolução temporal de tais abordagens é extremamente limitada, geralmente ordens de grandeza mais lento do que as taxas de reacção. SPR supera essas deficiências devido à sua sensibilidade e resolução temporal superior ^{a 1,2.} SPR é um método livre de marcador, e como talinteracção molecular pode ser medida (desde que as mudanças de massa pode ser detectado). Em adição a PPI, que tem sido extensamente usado para a caracterização da proteína-ligando, proteína-fármaco (ou molécula pequena), de ADN-proteína, e interacções proteína-RNA ^3-5. Os resultados são registados e representados graficamente em tempo real, que permite a modificação rápida das condições experimentais e desenho experimental flexível.

O princípio por trás física instrumentos baseados SPR é a utilização de um sistema óptico que mede uma alteração do índice de refracção na superfície do sensor sobre a massa muda ^2. Um dos parceiros de interacção ligando (daqui em diante) é imobilizada num chip de matriz de polímero e a segunda molécula (a seguir analito) é feito fluir através da superfície. Ligação do analito ao ligando altera a massa na superfície do chip. Essa mudança de massa é direta e proporcionalmente relacionada a mudanças no índice de refração da superfície. Os resultados são representados graficamente em tempo real eapresentadas como unidades de resposta (RU) como uma função do tempo. Uma tal trama é denominado um sensogram (por exemplo, Figura 1). Desde SPR segue o curso completo do tempo de interacção, pré-equilíbrio constantes de velocidade são derivados, em adição ao equilíbrio afinidades. Tal como pormenorizado abaixo, o comportamento de pré-equilíbrio de um dado sistema mantém muita informação, e fornece uma perspectiva muito diferente do que o equilíbrio sozinho. Uma vez que o sistema é calibrado, as experiências são muito rápidos e exigem apenas pequenas quantidades de material de proteína (microgramas de quantidades de nanogramas). A recolha de informação cinética completa de um dado sistema pode ser conseguida em dia. A elevada sensibilidade da SPR proporciona medições que não são possíveis usando qualquer outra técnica de ^6. No entanto, essa alta sensibilidade é uma "faca de dois gumes", pois pode ser uma importante fonte de dados falsos positivos. Qualquer fator que afeta o índice de reflexão é gravado e plotados no sensogram. Como tal, apcontroles ade- deve ser usado para eliminar falsos positivos, e apoio de abordagens complementares é altamente recomendado.

A Figura 1 ilustra a progressão de uma experiência de SPR utilizando um chip sensor revestido-NTA. O sensogram no painel A mostra a injecção dos iões de níquel sobre a matriz de NTA (dados unsubtracted), e painéis BD exibir os dados depois de subtrair o sinal obtido a partir da célula de controlo negativo. Setas vermelhas e azuis mostram início de injeção e final, respectivamente. A imobilização do ligando para o chip altera gradualmente até que a massa de injecção é terminada. O patamar estável observada após o término da injecção do ligando reflecte a associação estável do ligando à superfície (Figura 1B, ciclo 2). Uma vez que uma linha de base estável é conseguido um tampão é injectado sobre o ligando e a célula de referência (Figura 1B, ciclo 3) .Este injecção serve como um "controlo em branco", e serásubtraída durante a análise. Após a injecção, pequenas alterações são registadas, reflectindo um fluxo de massa através do chip. Em seguida, num ciclo separado (Figura 1B, ciclo 4), o analito é injectado; o aumento gradual no RU representa associação da substância ao ligando. Os sítios de ligação tornar-se gradualmente ocupada até que o equilíbrio seja atingido. Assim que termina a injeção, um declínio nos RUs reflete dissociação do complexo. A partir de tais sensograms constantes da taxa de pré-equilíbrio e equilíbrio podem ser derivadas (ver mais adiante). A Figura 1 representa uma interacção transiente entre o ligando e o analito. Quando a interação é mais estável, a queda no nível de RU é mais lento, refletindo uma menor k _d.

Relata-se um experimento SPR teve como objetivo caracterizar a interação entre um transportador de membrana (detergente solubilizado) e seu parceiro funcional proteína ^6,7, ligando o seu substrato cognato. O mod escolhidosistema el é um transportador de ATP cassete de ligação (ABC), ModBC-A da Archeaglobus fulgidus. Este sistema foi escolhido por seus resultados altamente reprodutíveis, alta relação sinal-ruído, e clássica "on / off" taxas. Além disso, os transportadores homólogos ABC estão disponíveis para servir como controlos negativos importantes. O transportador, ModBC (ligante A) é extraído a partir da membrana usando detergentes, purificada e imobilizada sobre o chip. Seu parceiro interagindo solúvel, moda, está a analisar. Como um ligando de controlo negativo, um transportador ABC RbsBC diferente é usado ("ligando B").

Protocolo

1. A amostra de proteína e tampão de preparação de

1. Preparação da amostra: purificar as proteínas de interesse e certificar-se de todos os agregados são removidos, através da injecção da proteína antes da experiência, numa coluna de filtração em gel ou por ultracentrifugação (geralmente de 10 minutos a 100.000 xg é suficiente).
   Nota: Embora desejáveis, preparações de proteínas altamente puras não são uma obrigação. SPR tem sido usado com sucesso com purificações menos-que-perfeito e mesmo com ^8,9 total de extrato.
2. Tampão de preparação:
   1. Preparar o tampão do experimento (chamado de "tampão de corrida", ou RB). Para o protocolo descrito aqui, utilizar 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl e 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltósido). Tenha em atenção que a escolha da composição do tampão pode ser facilmente modificada de acordo com o sistema estudado.
   2. Filtre todos os tampões e amostras de proteína utilizando filtros de 0,22 um. Certifique-se de antemão que os filtros estão em proteínascompatível. Em geral, as plataformas SPR recentemente comercializados contêm um de-Gasser in-line; Se este não for o caso, de-gás buffers antes da utilização.
   3. Dialisar durante a noite ou diluir as amostras contra o RB evitar descasamentos de buffer. A diálise (ou qualquer outro método de troca de tampão) é especialmente aconselhável quando se utiliza produtos químicos de alta viscosidade (por exemplo, sacarose, glicerol, DMSO). Antes de ligar o frasco RB para a entrada da bomba 10 ml manter afastados do RB em um tubo separado.
3. Dilui-se o concentrado em estoque ligando RB para uma concentração final de ~ 20 ug / ml. Como regra geral, para a imobilização do ligando estável, use baixas concentrações ligando com injeções mais longos a baixo fluxo, ao contrário de altas concentrações, alto fluxo e injeções mais curtos.
4. Dilui-se o analito para o RB para a concentração desejada. Normalmente, testar a gama de concentrações para um sistema de afinidade desconhecida a partir de 10 mM a 10 nM em diluições de dez vezes. Comece semprecom as concentrações mais baixas primeiros.

2. Sensor Chip

1. Seleção Chip: Use um ácido nitrilotriacético (NTA) de chip acoplado adequada para captar as proteínas com uma tag oligo-histidina.
2. Uso Chip:
   1. Ao usar um novo chip, tomar o chip fora da bainha, lavar cuidadosamente com água bidestilada (DDW), secar cuidadosamente líquidos remanescentes usando limpadores delicados, e certifique-se de não tocar a superfície da camada de ouro. Coloque o chip na bainha na orientação correta (a inserção é suave quando o chip é colocado corretamente).
   2. Ao reutilizar um chip, tirar o chip armazenado a partir do buffer, lavar abundantemente com DDW e seque delicadamente como dito acima, e coloque em sua bainha de origem.
      NOTA: O acúmulo de material de sucata não específico no chip pode afetar a sua "viabilidade". Isto pode ser monitorizado através da comparação do EF antes da imobilização do ligando e pós-extracção. Embora muitas medições podem serfeito usando o mesmo chip NiNTA, a questão da sua longevidade não é uma 'clara' e varia muito entre as diferentes fichas.
3. Chip de ancoragem: Abra a porta do chip sensor e colocar o chip na bainha. Ao usar um novo chip, número de série de entrada do chip para manter registro de uso. Feche a porta e pressione "chip doca '.

3. Ajustes de Temperatura

1. Definir a temperatura da célula de chip para 25 ° C (ou a temperatura preferida experimento).
2. Opcional: definir o compartimento de amostras de 7 ° C para manter as proteínas estáveis ​​ao longo da experiência.

4. Soluções para carga e decapagem

Preparar as seguintes soluções de carregamento e extracção: 0,5 mM de _NiCl2 em RB, EDTA 350 mM em RB (adicionar detergente para solução de EDTA a uma concentração final como em RB), SDS a 0,25% em H ₂ O, e HCl 100 mM em H ₂ O. Ao utilizar banheira micro-centrífugaes e não SPR tubos designados, não se esqueça de cortar as tampas dos tubos.

5. Prime do Instrumento SPR com RB

6. Iniciar um novo Run

1. Definir o caudal que irá ser utilizado durante a experiência. Para obter os resultados descritos aqui definir o fluxo para 50 mL / min.
   NOTA: Este parâmetro pode ser modificado durante o experimento.
2. Definir os caminhos de fluxo e referência subtração. Para obter os resultados descritos aqui definidos os caminhos Fc = 1 e Fc = 2, subtração Fc = 2-1.
   Nota: O programa irá exibir em tempo real a subtração de duas células medidos. Tenha em mente que este parâmetro não pode ser alterado durante o experimento.
3. Selecione o suporte de amostras adequado (que pode influenciar o consumo de volume da amostra).
4. Salve o arquivo de resultados.

7. Experimento Cycles

Cada experiência é composto de ciclos, manter um registro claro das injeções feitas em eAciclo de ch, e separar o carregamento dos ligantes, injeção em branco do buffer, ea injeção analito em ciclos diferentes.

1. Ciclo 1: preparação Chip e níquel carregamento
   1. Certifique-se que o fluxo de caminhos e são definidas de acordo com a etapa 6.1 e 6.2.
   2. Injectar EDTA 350 mM para 1 min para lavar as sobras.
   3. Definir fluxo de 10 ul / min.
   4. Injectar 0,5 mM de _NiCl2 durante 2 min.
      NOTA: Agora, a resina de chip é revestido por iões de níquel.
2. Ciclo 2: Ligantes imobilização
   1. Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo Fc = 2.
   2. Injectar Um ligando até atingir valores UC que são 10-20 vezes do seu peso molecular. Por exemplo, carregar um ligante de 50 kDa para 500-1.000 RUs. Mantenha um registro do valor RU alcançado.
   3. Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo Fc = 1.
   4. Injectar ligando B (controlo) até ao mesmo valor de EF enquanto que ligando o monitor A. sensogram subtracção (Fc = 2-1) em linha para ajudar a controlar acomprimento injecção.
   5. Conjunto de fluxo de 50 mL / min, caminho de fluxo = 1 Fc e Fc = 2, lavar o sistema para 5-20 min, até a linha de base (Fc = 2-1) estabiliza.
3. Ciclo 3: injeção em branco. Esta injecção irá servir para subtracção do branco, por conseguinte, incluir todos os componentes que vão ser injectados com a substância a analisar, com excepção do próprio analito.
   NOTA: Injecção comprimento pode variar dependendo do tempo que demora a atingir o equilíbrio (planaltos sinal).
   1. Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo = 1 Fc e Fc = 2, Fc = 2-1 subtracção.
   2. Insira o comando 'esperar' (referido a seguir como "esperar") durante 30 segundos (para ter uma linha de base estável).
   3. Injectar 15 seg RB.
      NOTA: A duração da injecção variará entre sistemas diferentes, dependendo de suas pré-equilíbrio constantes cinéticas (principalmente o k _a).
   4. Espere 120-600 sec para gravar a fase de dissociação.
      NOTA: A duração deste passo varia de acordo com o k _d: A mais lenta a dissociação do mais este passo precisa ser. Para os complexos dissociar muito lentas (k _d <10 ^-4 seg ^-1), esperar 10-15 minutos e então proceder à tona regeneração (ver adiante).
4. Ciclo 4: Injeção Analyte
   1. Copiar / colar as condições exatas usadas na injeção de referência (ciclo 3), de modo que essas duas injeções podem ser depois subtraído. Alterar a localização do slot no rack da que contém a solução de controle para aquele que detém a solução analisar. Escolha uma concentração que é um pouco acima do K _D esperado. Se nenhum conhecimento prévio está disponível, escolher um? M como um bom ponto de partida.
5. Ciclo 5: injeção de tampão
   1. Repita ciclo 3.
6. Ciclo 6: injeção Analyte
   1. Repita o ciclo de 4.
7. Ciclo 7: Chip despir
   1. Definir fluxo de 50 ul / min.
   2. Injectar EDTA 350 mM durante 1 min. Repita este passo mais duas vezes. Não use uma única injeção de 3 min, pois isso pode danificar o chip.
   3. Injectar SDS a 0,25% durante 1 min. Repita este passo mais duas vezes. Não use uma única injeção de 3 min, pois isso pode danificar o chip.
   4. Se o nível da linha de base não for atingido, injetar HCl 100 mM durante 1 min como da fase de extracção adicional.
   5. Insira o comando 'run final' que muda para o modo de espera.
8. Armazenamento Chip
   1. Desencaixar o chip sensor e levá-la para fora do instrumento.
   2. Leve o sensor fora da bainha, evite tocar a superfície, enxagúe com DDW, e coloque em um tubo de 50 ml contendo RB. Armazenar a 4 ° C.

8. análise de dados usando o software designado Avaliação

1. Execute as seguintes etapas para processar os dados brutos obtidos por SPR antes derivação dos parâmetros cinéticos.
   1. Usando o software de avaliação, abertao arquivo de resultados, selecione ciclos 3-6 Fc = 2-1 (referência de dados subtraídos).
   2. Axis mudança:
      1. Ciclos de Exibição 3-6.
      2. Zero o valor do eixo Y da linha de base (o tempo de espera de 30 segundos em cada ciclo inicial) para todos os quatro curvas.
   3. Alinhamento do eixo X- das quatro curvas. Escolha recursos pronunciados (por exemplo, pontos de início de injeção ou acabamento) para alinhar perfeitamente os quatro curvas ao longo do eixo-X. Definir a hora de início de objecto de análise (ou tampão de controlo) a zero.
2. Subtração de Referência
   1. Subtrair a resposta de base por subtracção da curva do ciclo 3 a partir da curva de ciclo curva 4 e 5 do ciclo a partir da curva de ciclo 6. Utilização da operação de subtracção curva que pode ser encontrado no eixo Y desloca menu.
      ATENÇÃO: É importante realizar esta etapa em que anula quaisquer componentes inespecíficos (não relacionados à substância) que podem ter influenciado o índice de refração superfície.
      1. Salve as curvas subtraídos em tele folha do projeto com um nome diferente.
   2. Referem-se a estas curvas como "duplamente curvas subtraídos": o primeiro é a subtracção 2-1 subtracção realizada em ambas as injecções, e o segundo é a subtracção de uma curva de outro.
      NOTA: Essa referência dupla é o padrão ouro em experimentos SPR.
   3. Sobrepor as curvas subtraídos realizando mudança de eixo, como explicado antes.
3. Determinação de constantes cinéticas e os ajustes do modelo
   1. Realização de uma experiência cinética
      1. Injectar uma série de concentrações de analito 6-7 para ter um confiável de dados para determinação de constantes cinéticas. Escolha concentrações de analito a partir de 10 vezes superior a 10 vezes inferior à estimativa K _D, em diluições 2-3-dobra. Incluir o "zero" a concentração, mais tarde utilizado para subtração dupla referência (ver acima). Realizar injeções em triplicata e em ordem aleatória.
      2. Alinhare subtrair todas as curvas em relação ao eixo Y e eixo-X antes de tentar modelo de ajustamento.
   2. Montagem Modelo
      1. Selecione um programa de análise adequado.
         NOTA: A maioria dos programas de adaptação disponíveis oferecem vários modelos que podem ser aplicadas para a montagem e determinação das constantes cinéticas.
      2. Aplicar o modelo mais simples (Langmuir) assumindo uma reversível 1: 1 a interação entre o analito e o ligando para o encaixe. A menos que convencer os dados estão disponíveis a partir de outros métodos experimentais para a existência de uma interação mais complexa, use sempre o modelo de Langmuir simples.

Resultados

No sistema aqui descrito, um chip NiNTA é usado para imobilizar o transportador de membrana marcada com His ^6,7. Sendo um homo-dímero, cada transportador é duplamente marcado, melhorando a sua ligação ao chip NiNTA. Após o carregamento de níquel, ligando A (o transportador de interesse) é imobilizada em Fc = 2, até ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A tarja preta). Em seguida, utilizando o mesmo caudal e da duração da injecção, ligando B (do ligando de controlo) injecta-se Fc = 1, inici...

Discussão

SPR é um método altamente sensível para estudar interações moleculares, e muitas vezes é a única abordagem que permite o monitoramento em tempo real das interações transitórios (mas importantes). Um exemplo é a interacção transiente aqui apresentada, que não poderia ser detectado por qualquer outro método (ensaios de pull-down, ensaios de lipossomas de sedimentação ^6). Além disso, enquanto que outros métodos são limitados ao equilíbrio medições (seja qualitativo ou quantitativo), SPR é uma das únicas técnicas...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAavaliação	Software GE Healthcare
Biacore T200	GE Healthcare
Cloreto de níquel	Sigma	N6136
Tungstato de sódio dihidratado	Sigma	T2629
Cloreto de sódio	Bio-Lab LTD.
Base Trizma	Sigma	T1503
Ácido etildilamina-tetracético sal dissódico di-hidratado (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecil-β-D-Maltopiranosídeo (DDM)	Affymetrix	D310
Solução de dodecil sulfato de sódio	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Ácido clorídrico	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Filtro de membrana	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC transportador	Lewinson lab
RbsBC ABC transportador	Lewinson lab
Laboratório			Lewinson