Aqui apresentamos um protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Médio foi removido do HoCV-1 culturas positivas e RNA extraído a cada 24 horas para 168 horas. A capacidade de sobrevivência das células foi quantificada por coloração com azul de tripano. Partículas de vírus inteiros foram extraídos após a infecção. RNA extraído foi quantificada por qRT-PCR.
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Resumo
Resumo
O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis) é um inseto altamente vágil e polífagas encontrados em todo o sudoeste dos Estados Unidos. Esses insetos são os vetores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), uma bactéria restrita ao xilema, que é o agente causal da doença de Pierce (PD) de videira. Doença de Pierce é economicamente prejudicial; assim, H. vitripennis tornaram-se um alvo para estratégias de gestão patógeno. Um dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata vírus-01 (HoCV-01) tem sido associado com um aumento da mortalidade em H. populações vitripennis. Por causa de uma célula hospedeira é necessária para a replicação HoCV-01, a cultura de células fornece um ambiente uniforme para a replicação que é orientada logisticamente e economicamente valiosa para a produção de biopesticida. Neste estudo, um sistema para a propagação em larga escala de H. vitripennis células através de cultura de tecidos foi desenvolvido, providing um mecanismo de replicação viral. HoCV-01 foi extraído a partir de insectos de corpo inteiro e usada para inocular H. cultivadas vitripennis células em níveis variados. O meio de cultura foi removido a cada 24 h durante 168 horas, o RNA extraído e analisado com qRT-PCR. As células foram coradas com azul de tripan e contadas para quantificar a capacidade de sobrevivência de células por microscopia de luz. Partículas de vírus inteiros foram extraídos até 96 horas após a infecção, o que foi o ponto de tempo determinado antes de ser ocorreu colapso total de cultura de células. As células também foram submetidos a coloração fluorescente e visualizadas por microscopia confocal para investigar a atividade viral na F-actina apego e núcleos integridade. A conclusão deste estudo é que H. vitripennis células são capazes de serem cultivadas e utilizadas para a produção em massa de HoCV-01 a um nível apropriado para permitir a produção de um biopesticida.
Introdução
O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis Germar 1821) foi identificado como o vetor predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), o agente causal da doença da videira (PD) de Pierce na América do Norte 1. Gestão da população de insetos rapidamente se tornou o foco de investigação para combater este problema devastador para a indústria de viticultura na Califórnia e em todo o sul dos Estados Unidos. Um de sentido positivo, vírus de RNA de cadeia simples, que pertence à família Dicistroviridae, Homalodisca vírus-01 coagulata (HoCV-01) foi identificada em H. selvagem populações vitripennis e mostrado....
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Protocolo
Cultura 1 celular
NOTA: linhas celulares Homalodisca vitripennis estabelecidos pelo laboratório Dr. Wayne Hunter no Serviço de Pesquisa Agrícola do USDA (Ft. Pierce, FL EUA) foram utilizados para iniciar um estoque laboratório composto por estágios de células mistas, incluindo fibroblastos iniciais e monocamadas.
- Executar os seguintes procedimentos em ambiente estéril laboratório mantido a uma temperatura de 20-24 ° C de 25 cm 2 frascos de cultura.
- Cultivar e manter culturas de 25 centímetros dois frascos de cultura de tecidos, utilizando meio de H2G + Cigarrinha, uma modificação meios d....
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Resultados
A adesão celular e crescimento ocorreu dentro de 48 horas de passagem em ambos os pequenos e grandes frascos de cultura, a partir de culturas primárias e passagens contínuas. Crescimento de fibroblastos e desenvolvimento também foi observada dentro deste prazo. Quando frascos recém semeadas foram perturbados antes de 48 horas, houve um declínio visível na fixação das células, levando a culturas de crescimento lento e às vezes nenhum apego ou de crescimento em tudo. As células foram de aproximadamente 80% confluente dent.......
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Discussão
Crescentes preocupações em relação à entrada de espécies invasoras agrícolas têm levado a um aumento da procura de novas metodologias para se defender contra pragas e patógenos emergentes. Um foco de prevenção e gestão de doenças envolve a gestão de vetores de patógenos e era o alvo principal deste estudo. Economia desempenhar um papel vital na decisão de produzir este tipo de biopesticida para gerenciar vetores de patógenos na agricultura porque a aplicação prática precisa ser de grandes quantidades em grandes áreas, m.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Programa de Pesquisa e Educação da Doença de Texas Pierce e ao USDA-APHIS por seu apoio financeiro a este projeto. Também gostaríamos de agradecer a Hema Kothari, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em Tyler, por sua assistência com a microscopia confocal.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frascos de cultura de células Corning | Sigma Aldrich | CLS430168 | Área de superfície 25 cm2, gargalo inclinado, tampa (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Microscópio invertido e câmera | |
| Solução de tripsina-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | 0,25%, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura celular, 2,5 g de tripsina suína e 0,2 g de EDTA • 4Na por litro de Hanks′ Solução salina balanceada com vermelho de fenol |
| Greiner CELLSTAR placas de cultura multipoços | Sigma Aldrich | M8937 | 48 poços (TC tratado com tampa) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Dietilditiocarbamato de sódio trihidratado |
| Sistema de filtro a vácuo de garrafa Corning | Sigma Aldrich | CLS431206 | Membrana de acetato de celulose, tamanho do poro 0,45 μ m, área da membrana 54,5 cm2, capacidade de filtragem 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Éter hexadecílico de polietilenoglicol |
| Solução tampão de fosfato | Sigma Aldrich | P5244 | Recebido como 100 mM diluído a 10 mM com água estéril |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | Para por eletroforese |
| Brometo de etídio | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, para biologia molecular, em pó |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% de paraformaldeído | Sigma Aldrich | P6148 | Grau de reagente, cristalino |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Fosfato solução salina tamponada |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Faloidina conjugada com vermelho de rodamina | Life Technologies | R415 | A faloidina de rodamina é uma sonda de actina F de alta afinidade conjugada ao corante fluorescente vermelho-laranja, tetrametilrodamina |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| Reagente Antidesvanecimento ProLong Gold | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Sistema Confocal | Software Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Carl | Zeiss | ||
| Grace' s Meio de inseto (suplementado, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ cigarrinha componente médio |
| L-histidina monohidratada | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ cigarrinha meio componente |
| Meio 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ cigarrinha meio componente |
| Meio 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ cigarrinha meio componente |
| Hank' s Sais Balanceados (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G + cigarrinha componente médio |
| L-Glutamina (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G + cigarrinha componente médio |
| MEM, mistura de aminoácidos (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G + cigarinha componente médio |
| 1 M MgCl solução | Sigma Aldrich | M8266 | H2G + cigarrinha componente médio |
| Pen-Strep (w / glutamina) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G + cigarrinha componente médio |
| Nistatina | Sigma Aldrich | N6261 | H2G + cigarrinha componente médio |
| Gentamicina | Sigma Aldrich | 46305 | H2G + cigarrinha componente médio |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G + cigarrinha componente médio |
| Soro bovino fetal | Sigma Aldrich | F2442 | H2G + cigarrinhas componente médio |
Referências
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X.
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Reimpressões e permissões
