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DOI:

10.3791/51953

⸱

25 de setembro de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Médio foi removido do HoCV-1 culturas positivas e RNA extraído a cada 24 horas para 168 horas. A capacidade de sobrevivência das células foi quantificada por coloração com azul de tripano. Partículas de vírus inteiros foram extraídos após a infecção. RNA extraído foi quantificada por qRT-PCR.

Resumo

O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis) é um inseto altamente vágil e polífagas encontrados em todo o sudoeste dos Estados Unidos. Esses insetos são os vetores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), uma bactéria restrita ao xilema, que é o agente causal da doença de Pierce (PD) de videira. Doença de Pierce é economicamente prejudicial; assim, H. vitripennis tornaram-se um alvo para estratégias de gestão patógeno. Um dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata vírus-01 (HoCV-01) tem sido associado com um aumento da mortalidade em H. populações vitripennis. Por causa de uma célula hospedeira é necessária para a replicação HoCV-01, a cultura de células fornece um ambiente uniforme para a replicação que é orientada logisticamente e economicamente valiosa para a produção de biopesticida. Neste estudo, um sistema para a propagação em larga escala de H. vitripennis células através de cultura de tecidos foi desenvolvido, providing um mecanismo de replicação viral. HoCV-01 foi extraído a partir de insectos de corpo inteiro e usada para inocular H. cultivadas vitripennis células em níveis variados. O meio de cultura foi removido a cada 24 h durante 168 horas, o RNA extraído e analisado com qRT-PCR. As células foram coradas com azul de tripan e contadas para quantificar a capacidade de sobrevivência de células por microscopia de luz. Partículas de vírus inteiros foram extraídos até 96 horas após a infecção, o que foi o ponto de tempo determinado antes de ser ocorreu colapso total de cultura de células. As células também foram submetidos a coloração fluorescente e visualizadas por microscopia confocal para investigar a atividade viral na F-actina apego e núcleos integridade. A conclusão deste estudo é que H. vitripennis células são capazes de serem cultivadas e utilizadas para a produção em massa de HoCV-01 a um nível apropriado para permitir a produção de um biopesticida.

Introdução

O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis Germar 1821) foi identificado como o vetor predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), o agente causal da doença da videira (PD) de Pierce na América do Norte 1. Gestão da população de insetos rapidamente se tornou o foco de investigação para combater este problema devastador para a indústria de viticultura na Califórnia e em todo o sul dos Estados Unidos. Um de sentido positivo, vírus de RNA de cadeia simples, que pertence à família Dicistroviridae, Homalodisca vírus-01 coagulata (HoCV-01) foi identificada em H. selvagem populações vitripennis e mostrado para aumentar a mortalidade nessas populações 2-4, enquanto diminuem a resistência do inseto aos inseticidas.

Desenvolvimento de métodos para efetivamente traseira infectado H. vitripennis à idade adulta em um ambiente de laboratório têm sido difíceis porque H. vitripennis têm necessidades nutricionais específicas de palco diferentes que exigem uma variedade de plantas hospedeiras 5-8. Instalações específicas são necessárias para H. vivo traseira vitripennis nos Estados Unidos; por conseguinte, a cultura celular é mais económico e uma alternativa viável, assim como cada vez mais importante para HoCV-01 e detecção da replicação 2,9. Embora métodos básicos para se estabelecer culturas de células de H. vitripennis são descritos, estes métodos não têm sido utilizados para a produção comercial de agentes de controlo biológico, tais como vírus 2.

O objectivo global dos processos seguintes é para produzir uma elevada concentração de HoCV-01 apropriada para utilização como um agente de controlo biológico. A replicação viral requer uma célula viva, que é por isso que cultivar com sucesso e otimizando H. vitripennis culturas é vital para o progresso de produzir níveis rentáveis ​​de vírus.

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Protocolo

Cultura 1 celular

NOTA: linhas celulares Homalodisca vitripennis estabelecidos pelo laboratório Dr. Wayne Hunter no Serviço de Pesquisa Agrícola do USDA (Ft. Pierce, FL EUA) foram utilizados para iniciar um estoque laboratório composto por estágios de células mistas, incluindo fibroblastos iniciais e monocamadas.

  1. Executar os seguintes procedimentos em ambiente estéril laboratório mantido a uma temperatura de 20-24 ° C de 25 cm 2 frascos de cultura.
  2. Cultivar e manter culturas de 25 centímetros dois frascos de cultura de tecidos, utilizando meio de H2G + Cigarrinha, uma modificação meios de abelha WH2 10 (Tabela 1).
  3. Incubar frascos de cultura a 24 ° C, com ~ 53% de humidade.
  4. Use um microscópio invertido com uma ampliação total (MT) de 100X para acompanhar o crescimento da cultura, por exemplo, verificar se há algum crescimento celular anormal, monitorização de quaisquer contaminantes potenciais, e verificar o progresso de crescimento em todo o culsuperfície tura.
  5. Realize uma mudança médio completo (~ 4 ml de meio de cultura por frasco) a cada 7-10 dias sem perturbar a superfície da cultura.
  6. Passa culturas quando a superfície da cultura é aproximadamente de 80% coberta por um crescimento celular (confluente) usando 0,25% de tripsina contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para dissociar as células. Adicionar ~ 2 - 3 ml de tripsina a cada balão de cultura e expor a cultura (s) para a enzima durante curtos períodos de tempo (5-10 min) para obter a dissociação de células completas.
  7. Adicionar uma quantidade igual de meio fresco para o frasco de cultura (s) (~ 2 - 3 ml) para parar a actividade da enzima e transferem toda a solução para um tubo cónico de centrifugação.
  8. As células por centrifugação a 4 ° C durante 6 min a 350 x g.
  9. Retirar o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e adicionar ~ se 8 ml de meio fresco a cada tubo. Gentilmente homogeneizar células usando uma pipeta.
  10. Culturas desdobramento à 1: 2 proporção de 25 centímetros 2 frascos (~ 4 ml de soluti celularem por balão) e deixam as culturas recentemente transmitidos em repouso por 48 horas para permitir que as células em suspensão para fixar firmemente à superfície do frasco.
    NOTA: O cultivo de células de 48 poços em placas estéreis de cultura de tecido com uma superfície de crescimento de 1 cm 2, também é possível e que pode ser mantida na mesma forma como frascos de cultura, com uma redução do volume de meio de cultura para ~ 250 mL.

2 Extracção vírus inteiro

  1. Homogeneizar corpos inteiros de vírus H. positivo vitripennis em tampão fosfato, pH ~ 7,2, com tri-hidrato de dietilditiocarbamato de sódio a 0,02% (DETCA) por rotação durante ~ intervalos de 10 segundos até que não haja mais de grandes aglomerados de tecido presente. Extracto de vírus através de centrifugação a superspeed 124.500 xg durante 4 horas a 4 ° C ou 22.000 xg durante 16 horas a 4 ° C. Se se formar um precipitado na parte superior, retire-os com um cotonete estéril 11.
  2. Descartar o sobrenadante.
  3. Coletar o sedimento edissolvem-se com 5 mL de 10 mM de tampão de fosfato (sem DETCA), pH ~ 7,2, contendo 0,4% de ácido Na-desoxicólico e 4% de éter de polietileno glicol de hexadecilo (Brij 52).
    1. Para misturar o sedimento assim, remover o pellet a partir do lado do tubo e esmagar até que em solução, se necessário.
    2. Adicionar mais tampão fosfato 10 mM, em incrementos de 5 ml ~ para ajudar a pelota entrar em solução, se necessário, e combinar-se dois tubos 11.
  4. Centrifuga-se a solução a 300 xg durante 15 minutos 11.
  5. Remover o sobrenadante e passar a solução através de um filtro de 0,45 mm, e recolher o filtrado em tubo grande coleção 11.
  6. Transferência filtrado para uma membrana de diálise com um peso molecular de corte (MWCO) de 3,5 kD, utilizando pequenas quantidades de tampão fosfato 10 mM (pH 7) contendo nenhum DETCA 11, se necessário.
  7. Colocar a membrana de diálise num copo grande cheio com ddH2O a 4 ° C. Alterar o DDH 2 O a cada hora fou 5-6 horas, até que se forme um precipitado branco na membrana 11.
  8. Recolhe-se o vírus purificada a partir de dentro da membrana e sujeitar a solução de vírus de 100% de uma série de diluições de 10 vezes por adição de 10 ul de solução de 90 ul de ddH 2 O. Subsequentemente juntar 10 ul de uma diluição de mais 90 ul de ddH2O até atingir uma diluição de 1: 100.000.
  9. Solução vírus armazenar a -80 ° C.

3. replicação viral

  1. Células de sementes em placas de cultura de 48 poços e crescem todas as linhas até o crescimento celular é de 80% confluentes (cerca de 72 horas pós-pass se as células estão crescendo a uma taxa média).
  2. Inocular cada linha de células com o vírus diluído em série, uma vez o crescimento das células atinge a confluência, isto é, uma linha de uma diluição de 1:10, uma linha de uma diluição de 1: 100, etc, excepto para a linha de cima. Utilizar a linha superior como um controlo e adicionar 10 uL de ddH2O a cada poço como controlo de volume.
    1. A fim de estabelecer uma concentração de células a partir da linha de base para comparação com as contagens de células experimentais, dissociam-se e contam a primeira cavidade de cada fileira, antes da inoculação inicial de todos os poços das culturas com vírus.
  3. Monitor de placas de cultura de todas as 24 horas após a inoculação virai para qualquer alteração de cor no meio indica uma alteração do pH e de quaisquer alterações na morfologia celular.
  4. Imagem uma coluna da placa de teste, em cada ponto do tempo, utilizando um microscópio invertido em 100X TM.
  5. Remover todo o meio da coluna, que foi representada por imagem em cada ponto de tempo de 24 horas e armazená-lo a curto prazo a -20 ° C, durante a extracção de ARN viral e quantificação ou a longo prazo a -80 ° C.
  6. Dissociar as células dos poços, após a remoção do meio como anteriormente descrito nos passos 1,6-1,9, utilizando apenas ~ 250 uL de EDTA a 0,25% de tripsina e meio fresco para parar a actividade da enzima e ~ 250 ul de meio fresco para re-suspender a Pelle célulat.
  7. Adicionam-se 10 ul de 0,4% de azul tripano mancha para cada tubo contendo as células para realizar a contagem de células após a dissociação das células por cada período de 24 horas durante uma semana. Permitir mancha para descansar por 10 min antes de realizar a contagem de células.
    1. Efectuar a contagem de células no espaço de 1 hora de exposição à mancha ou células viáveis ​​irão começar a absorção de manchas, bem como as células não viáveis.
  8. Lentamente, adicionar 10 ml da solução de células coradas para cada lado de um hemocitómetro padrão utilizando uma micropipeta. Permitir que a solução a adoptar-se por acção capilar, para evitar bolhas de ar.
  9. Conte o número de células viáveis ​​(não-coradas) em ambos os lados do hemocitómetro (o equivalente a quatro contagens dos 16 quadrados no hemocitómetro). Efectuar a contagem de células para cada poço da coluna que foi removida.
  10. Calcular a média das contagens das células de cada coluna usando a seguinte fórmula para se obter o número total da contagem de células: (média do número de células / 4) x factor de diluição = número de células 10 x 4 ml. Esta é a densidade de células ou o número de células viáveis ​​na cultura.

4 Extração Vírus de Cultura de Células

  1. Remover tratado H. vitripennis células de balões de cultura como anteriormente descrito nos passos 1,6-1,8, utilizando apenas ~ 250 uL de EDTA a 0,25% de tripsina e meio fresco para parar a actividade da enzima.
  2. Descartar o sobrenadante.
  3. Extracto de vírus a partir de células de cultura de acordo com o protocolo anteriormente descrito nos passos 2,3-2,8.

Extração de RNA 5.

  1. Extrair RNA de amostras de meio colhidas durante cada ensaio de vírus de uma semana, utilizando uma extracção de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidina concebido para amostras líquidas por protocolo do fabricante.
  2. Loja extraiu amostras a -80 ° C.

6. RT-PCR

  1. Estabelecer padrões virais para RT-PCR, executando PCR tradicional usando opar de iniciadores HoCV RT-PCR o iniciador 1 (5'-frente GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', reverso 5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') com o vírus isolado a partir de todo o corpo H. vitripennis.
  2. Produto de PCR sujeita a electroforese em gel, durante 60 minutos a 120 V num gel de agarose a 2% contendo 0,1% de brometo de etídio.
  3. Excisar as bandas do gel e purifica-se utilizando um kit de extracção de gel, conforme o protocolo do fabricante.
  4. Piscina tudo excisadas e produto gel purificado e ainda purificar por precipitação básica etanol. Eluir o produto a precipitação em cerca de 30 ul de Tris EDTA (TE) para aumentar a concentração total da amostra.
  5. Quantificar o nível de cDNA em amostras combinadas através de espectrofotometria utilizando 260/230 configurações de comprimento de onda para a detecção de ácido nucleico.
  6. Executar uma série de diluição em série de dez vezes da amostra purificada variando de 57 ng / mL a 57 ag / mL (10 -18). Realizar a diluição em série semelhante à descrita in 2.8 com os ajustes feitos para a diferença de requisitos de concentração.
  7. Determinar os limites de detecção da série de diluição através da realização de qRT-PCR, utilizando um kit de qRT-PCR com quantificação fiável de transcritos de baixa abundância.
    NOTA: As concentrações virais inferior a 5 x 10 -3 cópias não são detectáveis.
  8. Extrair RNA de amostras experimentais como descrito anteriormente no passo 5.1 e utilizando espectrofotometria de quantificar.
  9. Normalizar todas as amostras extraídas de 5 ng / mL, utilizando água livre de nuclease.
  10. Realizar qRT-PCR em todas as amostras, em duplicado, como reacções de 25 ul usando um kit de um único passo de qRT-PCR, com a capacidade para detectar números de cópias baixo como se segue: 50 ° C para manter 10 min; 95 ° C espera por 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg; derreter 50-99 ° C durante 5 segundos em cada passo.
    1. Faça a mistura principal para que cada mistura de reação contém 12,5 mL de maste 1xmistura r, 1,0 ul (0,3 mM) de iniciador para a frente, 1,0 ul (0,3 mM) de iniciador reverso, 0,25 ul de transcriptase reversa e de quantidades variáveis ​​de modelo com base em valores de normalização.
    2. Levar o volume total de reacção de 25 ul com RNase isenta de água.
    3. Incluir cinco concentrações padrão em cada PCR executado com os seguintes números de cópias: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, e 5 x 10 -2 cópias. Definir o limite para cada corrida até um pouco abaixo uma fluorescência de 10x -2.5 para reduzir o ruído durante a aquisição precoce no início de cada execução.

7. microscopia confocal

  1. Cultivar células Homalodisca vitripennis em um doze poços contendo lamínulas de vidro com 18 mm de diâmetro em cada poço.
  2. Inocule uma coluna na placa de cada 24 h durante um período de quatro dias, uma vez que uma monocamada é alcançado. Assegurar que cada column contém também um controle, uma diluição baixa viral (1:10) bem e uma diluição viral alta (1: 100.000) também. Utilizar soluções de vírus obtidas a partir do passo 2.8.
  3. Remova toda a mídia no quinto dia e lavar as células duas vezes com 1x PBS (pH 7,4).
  4. Fixar as células com paraformaldeído a 4% frio, a 4 ° C durante 30 min.
  5. Adicionar 500 ul de 1x tampão de fosfato salino (PBS) para as células e lava-las durante 10 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo a baixa velocidade. Lavam-se as células três vezes.
  6. Adicionar 500 ul de 0,1% de Triton X-100 às células para permeabilizar eles. Deixar assentar durante 10 min à temperatura ambiente.
  7. Lave as células uma vez, como descrito anteriormente no passo 7.5.
  8. Adicionar 500 ul de uma solução a 5% de albumina de soro bovino (BSA) para bloquear as células à temperatura ambiente. Deixe descansar por 2 horas e depois retire.
  9. Diluir estoque rodamina faloidina vermelho-conjugado (RCP) 1: 250 em 1x PBS contendo 5% BSA e adicionar 250 ul da diluição a cada poço a mancha de F-actina.
  10. Placa de cobertura em alumínio fóleo para evitar que o corante de branqueamento e incubar as células a 4 ° CO / N.
  11. Retirar a RCP após 12 h de incubação e substituí-la com 250 ul de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (250 ug / ml) diluídas em PBS 1x contendo 5% de BSA, para corar os núcleos das células .
  12. Incubar as células contendo DAPI, à TA durante 1 hora.
  13. Lave as células três vezes com PBS 1x, como descrito anteriormente no passo 7.5.
  14. Remova cuidadosamente as lamelas dos poços e montar a lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem com um reagente anti-fade.
  15. Permitir que os slides para secar lightproof caixas até visto sob o microscópio confocal. Ver de lâminas preparadas para, logo que possível, como corantes podem desaparecer rapidamente.
  16. Imagem de células marcadas, utilizando um sistema confocal equipado com um microscópio que contém uma lente de 63X (óleo)-apochromate plano.
    1. Defina os comprimentos de onda do laser para 543 ± 10 nm de excitação e 575 ± 10 nm de emissão para Rhoadmine phalloidin vermelho-conjucated, E 369 ± 10 nm de excitação e de emissão de 450 ± 30 nm para DAPI.
    2. Use ganho idêntico e partiu-configurações para o detector de obter todas as imagens.
    3. Processar imagens usando o software apropriado para o processamento de imagem e de triagem e de importação desejada imagens em um software gestão de imagem.

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Resultados

A adesão celular e crescimento ocorreu dentro de 48 horas de passagem em ambos os pequenos e grandes frascos de cultura, a partir de culturas primárias e passagens contínuas. Crescimento de fibroblastos e desenvolvimento também foi observada dentro deste prazo. Quando frascos recém semeadas foram perturbados antes de 48 horas, houve um declínio visível na fixação das células, levando a culturas de crescimento lento e às vezes nenhum apego ou de crescimento em tudo. As células foram de aproximadamente 80% confluente dent...

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Discussão

Crescentes preocupações em relação à entrada de espécies invasoras agrícolas têm levado a um aumento da procura de novas metodologias para se defender contra pragas e patógenos emergentes. Um foco de prevenção e gestão de doenças envolve a gestão de vetores de patógenos e era o alvo principal deste estudo. Economia desempenhar um papel vital na decisão de produzir este tipo de biopesticida para gerenciar vetores de patógenos na agricultura porque a aplicação prática precisa ser de grandes quantidades em grandes áreas, m...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Programa de Pesquisa e Educação da Doença de Texas Pierce e ao USDA-APHIS por seu apoio financeiro a este projeto. Também gostaríamos de agradecer a Hema Kothari, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em Tyler, por sua assistência com a microscopia confocal.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frascos de cultura de células CorningSigma AldrichCLS430168Área de superfície 25 cm2, gargalo inclinado, tampa (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71OlympusMicroscópio invertido e câmera
Solução de tripsina-EDTASigma AldrichT40490,25%, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura celular, 2,5 g de tripsina suína e 0,2 g de EDTA • 4Na por litro de Hanks′ Solução salina balanceada com vermelho de fenol
Greiner CELLSTAR placas de cultura multipoçosSigma AldrichM893748 poços (TC tratado com tampa)
DETCASigma Aldrich228680Dietilditiocarbamato de sódio trihidratado
Sistema de filtro a vácuo de garrafa CorningSigma AldrichCLS431206Membrana de acetato de celulose, tamanho do poro 0,45 μ m, área da membrana 54,5 cm2, capacidade de filtragem 500 ml
Brij 52Sigma Aldrich388831Éter hexadecílico de polietilenoglicol
Solução tampão de fosfatoSigma AldrichP5244Recebido como 100 mM diluído a 10 mM com água estéril
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgaroseSigma AldrichA5304Para por eletroforese
Brometo de etídioSigma AldrichE7637BioReagent, para biologia molecular, em pó
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCR kitQiagen204243
4% de paraformaldeídoSigma AldrichP6148Grau de reagente, cristalino
PBSSigma AldrichP5368Fosfato solução salina tamponada
Triton X-100Sigma AldrichX100
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma AldrichA2153
Faloidina conjugada com vermelho de rodaminaLife TechnologiesR415A faloidina de rodamina é uma sonda de actina F de alta afinidade conjugada ao corante fluorescente vermelho-laranja, tetrametilrodamina
DAPISigma AldrichD9542
Reagente Antidesvanecimento ProLong GoldLife TechnologiesP36934
LSM510 Meta Sistema ConfocalSoftware Carl Zeiss
LSM Zen 2007 CarlZeiss
Grace' s Meio de inseto (suplementado, 1x)Sigma AldrichG8142H2G+ cigarrinha componente médio
L-histidina monohidratadaSigma AldrichH8125H2G+ cigarrinha meio componente
Meio 199 (10x)Sigma AldrichM4530H2G+ cigarrinha meio componente
Meio 1066 (1x)Sigma AldrichC0422H2G+ cigarrinha meio componente
Hank' s Sais Balanceados (1x)Sigma Aldrich51322CH2G + cigarrinha componente médio
L-Glutamina (100x)Sigma AldrichG3126H2G + cigarrinha componente médio
MEM, mistura de aminoácidos (50x)Sigma Aldrich56419CH2G + cigarinha componente médio
1 M MgCl soluçãoSigma AldrichM8266H2G + cigarrinha componente médio
Pen-Strep (w / glutamina)Sigma AldrichG6784H2G + cigarrinha componente médio
NistatinaSigma AldrichN6261H2G + cigarrinha componente médio
GentamicinaSigma Aldrich46305H2G + cigarrinha componente médio
DextroseSigma AldrichD9434H2G + cigarrinha componente médio
Soro bovino fetalSigma AldrichF2442H2G + cigarrinhas componente médio

Referências

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