Embolic artéria cerebral média Oclusão (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com homólogos Coágulos de sangue em ratos

Resumo

Neste artigo, demonstramos um método padrão para produzir uma oclusão embólica da artéria cerebral média com coágulos sanguíneos homólogos (ricos em fibrina) em ratos adultos. Este modelo imita de perto o AVC isquêmico humano e é adequado para o estudo pré-clínico da terapia trombolítica para AVC isquêmico.

Resumo

Terapia clínica, com uso de trombolítico ativador do plasminogênio tecidual recombinante (tPA) continua a ser o tratamento mais eficaz para AVC isquêmico agudo. No entanto, o uso de tPA é limitada pela sua estreita janela terapêutica e pelo aumento do risco de transformação hemorrágica. Há uma necessidade urgente de desenvolver modelos tempos adequados para estudar novos agentes e estratégias de trombolíticos para o tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico. Actualmente, dois tipos principais de modelos isquémicos tempos têm sido desenvolvidos em ratos e ratinhos: intraluminal MCAO sutura e embólico MCAO. Embora os modelos de MCAO via a técnica de sutura intraluminal, têm sido amplamente utilizados em investigação orientada para o mecanismo de acidente vascular cerebral, estes modelos de sutura não mimetizar a situação clínica e não são adequados para estudos trombolíticos. Entre esses modelos, o modelo OACM embólico imita AVC isquêmico humano e é adequado para a investigação pré-clínica de terapia trombolítica. Este modelo embólico foi desenvolvido pela primeira vez em ratos por Overgaard et al. ¹ em 1992 e caracteriza-se por Zhang et al., em 1997 ^2. Embora embólico OACM ganha cada vez mais atenção, existem problemas técnicos enfrentados por muitos laboratórios. Para atender às necessidades crescentes de pesquisa trombolítica, apresentamos um modelo altamente reprodutível de embólico OACM no rato, que pode desenvolver um volume de infarto previsível dentro do território da ACM. Em resumo, um tubo de PE-50 modificado é avançada suavemente a partir da artéria carótida externa (ECA) para dentro do lúmen da artéria carótida interna (ICA), até que a ponta do cateter atinge a origem da MCA. Através do cateter, um coágulo de sangue homólogo único é colocado na origem da MCA. Para identificar o sucesso de oclusão MCA, o fluxo sanguíneo cerebral regional foi monitorizada, défices neurológicos e os volumes de enfarte foi medida. As técnicas apresentadas neste artigo deve ajudar os pesquisadores a superar problemas técnicos para o estabelecimento deste modelo para a pesquisa derrame. </ P>

Introdução

O AVC é a terceira principal causa de morte nos Estados Unidos, mas as opções de tratamento para o AVC agudo permanecem limitados. No momento, a perfusão intravenosa de ativador do plasminogênio tecidual recombinante (tPA) para dissolver os coágulos de sangue é a terapêutica mais eficaz para AVC isquêmico agudo. No entanto, o uso de tPA é limitada pela sua estreita janela terapêutica e pelo aumento do risco de hemorragia intracerebral. Portanto, um modelo de acidente vascular cerebral adequado para pesquisa trombolítica é urgentemente necessária.

A artéria cerebral média (MCA) é na maioria das vezes a artéria oclusa em acidente vascular cerebral em seres humanos. Focada em esta artéria, muitos modelos animais de acidente vascular cerebral isquêmico foram estabelecidas. Actualmente, dois tipos principais de modelos de isquemia focal de roedores por oclusão da MCA foram desenvolvidos: sutura modelo MCAO e embólico modelo MCAO. Embora os modelos de MCAO via a técnica de sutura intraluminal, têm sido amplamente utilizados em investigação orientada para o mecanismo de acidente vascular cerebral, estes modelos não fazer suturasacidente vascular cerebral humano mímico, como até 80% dos acidentes vasculares cerebrais humanos são causadas por trombose ou embolia. No entanto, o modelo de acidente vascular cerebral embólico usando coágulos sanguíneos imita traço humano e é considerado adequado para o estudo do trombolítico. Este modelo embólico foi desenvolvido pela primeira vez em ratos por Overgaard et al. ¹ em 1992 e caracteriza-se por Zhang et al., Em 1997, ² e por Dinapoli et al., Em 2006, ^3. Embora embólico OACM ganha cada vez mais atenção, há problemas técnicos enfrentados por muitos laboratórios.

Neste artigo, vamos demonstrar um método padrão para a produção de embólico OACM com coágulos de sangue homólogo no rato adulto, que pode desenvolver um infarto do previsível dentro do território da ACM. As técnicas apresentadas neste artigo deve ajudar os pesquisadores a superar problemas técnicos para o estabelecimento deste modelo para a pesquisa derrame.

Protocolo

Declaração de Ética: Adulto Masculino ratos Sprague-Dawley (pesando 330-380 g) foram utilizados neste protocolo. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) na LSU Health Science Center, Shreveport e está em conformidade com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório '(oitava edição, da Academia Nacional de Ciências, 2011 ).

1 Preparação da modificação do tubo de PE-50

1. Segure um tubo de 30 centímetros de comprimento PE-50 acima de uma lareira a gás por mãos, gradualmente suavizar o tubo. Gentilmente esticar o tubo.
2. Selecione um ponto no tubo alongado utilizando um paquímetro digital (Figura 1), marcá-lo e cortar o tubo PE-50 modificado em um longo segmento de 25 cm com uma ponta longa 1 cm (diâmetro externo: ,30-,34 mm).

2 Preparação de homólogos Coágulos de sangue

1. Anestesiar os ratos com isoflurano (5% para indução, 2-3% para manutenção) em 70% de _N2O e 30% de O _{2 por uma máscara facial antes da coleta de sangue. Confirme anestesia por uma pitada dedo do pé.}
2. Realizar a canulação arterial femural de um rato dador com o método publicado em ⁴ e transferir sangue da artéria femoral directamente num 20 cm de comprimento de tubo PE-50. Colocar o tubo durante 2 horas à temperatura ambiente para coagular o sangue, e em seguida reter o tubo durante 22 horas a 4 ° C. Nota: A canulação é realizado utilizando uma técnica asséptica tal como descrito na etapa 3.1. O rato doador é recuperado para posterior amostragem.
3. Cortar o tubo de PE-50 a 50 mm e segmentos de expulsar o coágulo do tubo numa placa de Petri estéril contendo solução salina normal.
4. Transferir os 50 mm de comprimento de coágulo num comprimento de 60 mm de PE-10 e tubo de ligar cada extremidade do tubo de PE-10 a uma 20 cm de comprimento de tubo PE-50 ligado a uma seringa contendo ml de solução salina normal com 23 L de agulha (Figura 2) .
5. Deslocar o coágulo por movimento alternativo contínuo de uma seringa para a outra durante 5 minutos, o que é possível remover as células de sangue a partir deo coágulo e minimizar a fragilidade dos coágulos coagulado extravascular, sem interromper o núcleo de fibrina.
6. Cortar o coágulo em um segmento de 40 milímetros de comprimento e transferir o segmento de coágulo modificado num cateter PE-50, tal como descrito na etapa 1.2, em condições assépticas. Nota: Todos os tubos PE é esterilizado com óxido de etileno.

3. Embolic artéria cerebral média Oclusão (Figura 3A, B)

1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos por autoclavagem (mínimo 121 ° C, 15 PSI, por 15 min). Higienizar a mesa de cirurgia e equipamentos cirúrgicos associados com 70% de etanol.
2. Anestesiar os ratos com isoflurano, conforme descrito no passo 2.1. Teste da profundidade da anestesia através da realização de uma ponta de aperto em ambos os pés traseiros, e qualquer movimento observado (retirada da pata), indica que o animal não seja suficientemente anestesiado para fazer a cirurgia. Aplique uma pequena quantidade de pomada veterinário em ambos os olhos para evitar a secura sob anestesia. Raspar a pele no pescoço e cabeça ventral reregiões com cortador elétrico para expor as áreas da pele.
3. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento. Insira uma sonda rectal, controlar e manter a temperatura do corpo entre 36,5-37,5 ° C, utilizando uma unidade de controlo cobertor homeotérmica.
4. Desinfetar a pele raspada e pele circundante com 10% de iodopovidona seguido por 70% de etanol.
5. Faça uma incisão na linha média 2 cm de comprimento no pescoço sob um microscópio de dissecação. Use retratores para expor o campo cirúrgico e dissecção da artéria carótida comum direita (CCA), artéria carótida externa (ECA), artéria carótida interna (ACI) e artéria pterigopalatina (PPA), isenta de nervos circundantes e fáscia (Figura 3A). Nota: Antes da cirurgia, mudar luvas estéreis se não houver assistente ajuda a preparar o animal.
6. Dissecar o CCA livre dos nervos que rodeiam (sem prejudicar o nervo vago) e coloque um estéril sutura 5-0 seda sob a artéria. Amarre um nó corrediço (# 1) e compreender a sutura usando uma pequena hemostat e puxe ensinado em direção ao corpo.
7. Dissecar o ECA e seus dois ramos, a artéria occipital (OA) e da artéria tireoidiana superior (STA). Coagular dois ramos usando uma unidade eletrocirúrgica veterinária. Coloque dois pedaços de estéreis 6-0 seda sob o ECA.
8. Separa-se as duas sedas colocados por baixo da artéria, uma peça para a cabeça (extremidade distal) e o outro na direcção do corpo. Amarre uma ligadura apertada (# 2) no lado mais próximo da cabeça, segure a seda com pequenas hemostatos e puxe ensinado em direção à cabeça. Prepare um nó frouxo (# 3) com a outra de seda para usar mais tarde.
9. Dissecar o ICA e PPA dos nervos circundantes (sem causar danos ao nervo vago). Amarre o PPA com um 6-0 (# 4). Faça um nó corrediço com 6-0 ao redor do ICA (# 5). Alternativamente, o clipe de ICA usando um clipe microvascular.
10. Corte um pequeno buraco (meia thru) na ECA entre o apertado (# 2) e soltos (# 3) ligaduras com uma tesoura primavera Vannas de estilo. Insira o modificada 50 PE-banheirae contendo coágulo de sangue na incisão e avançar para a bifurcação da CCA. Aperte a ligadura solta (# 3) em torno do lúmen apenas o suficiente para garantir a preservação da mobilidade do tubo em que habitam.
11. Corte o ECA no site do pequeno buraco para liberar o coto e posicionar o tronco abaixo da bifurcação da ECA e da ACI; isso vai permitir que o tubo modificado facilmente deslizar para o ICA. Abra o ICA e avançar suavemente o tubo a partir do lúmen da ECA na ICA até que a ponta do cateter atinge a origem da MCA (~ 17 mm da bifurcação). Nota: Antes de introduzir a ponta do tubo para o CEA, estéril a superfície exterior do tubo com etanol a 70%, e, em seguida, lava-se com solução salina normal estéril.
12. Injectar o coágulo através da modificação do cateter PE-50, juntamente com 10 ul de solução salina durante 10 segundos, utilizando uma seringa Hamilton de 100 l (Figura 3B).
13. Retirar o cateter da ECA cinco minutos mais tarde. Amarre o ECA e reabrir CCA. Suturar a incisão no pescoço.

4 Monitoramento Regional Cerebral Blood Flow (rCBF)

1. Antes de oclusão MCA, fazer um 1,2 centímetros de comprimento incisão na linha média do couro cabeludo em expor o osso do crânio. Retire os tecidos no osso do crânio com um raspador dental e swaps de algodão estéril. Nota: Antes da cirurgia, a área do couro cabeludo exposto e pele circundante são desinfetados com 10% de iodopovidona seguido por 70% de etanol.
2. A broca de 1,5 mm de orifício de trépano diâmetro localizado a 2 mm posterior e 5 mm lateral ao bregma usando uma rebarba esférica de aço inoxidável de 0,7 milímetros (Figura 4).
   Nota: Mantenha a dura intacta.
3. Coloque a sonda de 0,5 milímetros acima da superfície da dura-máter. Monitorizar o rCBF a 0 (linha de base), 5, 15, 30, 60, 90, e 120 minutos após a embolização e continuar a 5, 15, 30, 45, e 60 min após a administração intravenosa de tPA. Depois da última medição de rCBF, a incisão no couro cabeludo é fechada por sutura. Nota: Antes da incisão no pescoço medimos rCBF como base antes MCA Occlusião. Oclusão pós MCA medimos rCBF após o fechamento da sutura de incisão no pescoço. Assim, a incisão do pescoço é mantida estéril.

Cuidados 5. Pós-operatório

1. Injectar 2,5 mL de solução salina por via subcutânea para evitar desidratação e injectar Buprenex (0,05 mg / kg, SC), imediatamente após a cirurgia a cada 6-12 horas e quando necessário para alívio da dor.
2. Pare de anestesia isoflurano. Colocar o rato numa câmara de recuperação veterinária 37 ° C (manter animais quente) e manter observação. Geralmente, leva 10 min para o rato para se recuperar da anestesia. Em seguida, coloque o animal em uma gaiola esterilizado, coloque um pouco de comida molhada em uma placa de Petri na gaiola, e voltar a gaiola para sala de esterilização animal.
3. 24 horas após o derrame, a eutanásia ratos com uma overdose de pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal, IP).

6. Neurological Pontuação Deficit

1. Execute o placar Bederson antes e 2 horas após a embolização. Use uma classificação de scale de 0-3 como descrito anteriormente ^5: 0, levantando o rato pela cauda, ​​a animais que se estende para ambos os membros anteriores e apresentando o piso sem outros déficits (movimento normal); 1, elevando o rato pela cauda, ​​flexionar o membro anterior contralateral; 2, diminuição da resistência à pressão lateral (e membro anterior flexão), sem circular; 3, o mesmo comportamento de grau 2 com circulando.
   NOTA: Os ratos que mostram Bederson score = 0 (sem déficit) em 2 horas após a embolização são excluídos do estudo mais aprofundado.

Resultados

A fluxometria de Doppler a laser (LDF) foi utilizado para monitorizar rCBF durante a indução da isquémia cerebral ^6,7. Muitos laboratórios, incluindo o nosso laboratório tem usado rCBF para identificar os animais com oclusão MCA bem sucedido, mas os limites de linha de base variou entre os laboratórios que estão relacionados com o local de medição. A sonda do LDF está posicionado a 2 mm posterior a 5 mm lateral ao bregma como descrito anteriormente ^6. rCBF foi monitorizada nos tempos 0, 5, 15, 30, ...

Discussão

Neste estudo, foi demonstrado um método padrão para a realização de um modelo de acidente vascular cerebral embólico MCAO em ratos, em que a origem da MCA é tapada por um coágulo rico em fibrina. A principal vantagem deste modelo é: a oclusão da haste de MCA com um coágulo de sangue ricos em fibrina, é semelhante ao derrame tromboembólico em humanos, o modelo de acidente vascular cerebral embólico é adequado para a realização de investigação pré-clínica da terapêutica fibrinolítica, e que este modelo pode desenvolver um...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto	Chemical	Sigma	T8877
Equipamento de vaporizador de anestesia		Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Micro broca recarregável de alta velocidade	Equipamento	de Belas Ciências	18000-17
Tesouras curvas	Equipamento	de Belas Ciências	14117-14
Fórceps Dumont (Médico # 7)	Equipamento	Ferramentas de Ciências Finas	11270-20
Fórceps Dumont (Médico # 5) Equipamento		Ferramentas de Ciências Finas	11251-35
Tesoura de mola	estilo VannasEquipamento	Fine Science Tools	15000-03
Câmara de recuperação veterinária	Equipamento	Serviços Peco	V1200
Equipamento de bomba de seringa Genie plus		Kent Scientific Corporation
Equipamento de matriz cerebral de rato		Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Paquímetro digital	Equipamento	Instrumentos de Precisão Mundial	501601
Microscópio de Dissecção	Equipamento	Instrumentos de Precisão Mundial	PZMTIII-BS-LWD
Equipamento de seringa Hamilton			modelo 710
Unidade de controle de cobertor homeotérmico	Equipamento	Harvard Aparelho
Equipamento de tosquiadeira elétrica		Braintree Scientific	CLP-9931
Equipamento de unidade eletrocirúrgica veterinária		MACAN Manufacturing Company	MV-9
Equipamento de medidor de fluxo sanguíneo		Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipamento	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
Seringa de 1 ml	Consumível	Becton, Dickinson and Company	Consumível
agulha 309659 23 G	Consumível	Becton, Dickinson and Company	305143
Consumível	agulha de 30 G	Consumível Becton, Dickinson and Company	305106
Tubo PE-50	Consumível	Consumível Becton, Dickinson and Company	427517
Consumível
sutura de seda		Aparelho Harvard	723287
5-0 Sutura de seda	Aparelho Harvard	consumível 517607

Ferramentas Ferramentas de dede