Emparelhados Recordings células inteiras em organot�icas fatias do hipocampo

Resumo

As gravações de pares são gravações simultâneas de grampo de patch de células inteiras de dois neurônios sinapticamente conectados, permitindo a caracterização eletrofisiológica e farmacológica precisa das sinapses entre neurônios individuais. Aqui descrevemos a metodologia detalhada e os requisitos para estabelecer esta técnica em culturas de fatias organotípicas do hipocampo em qualquer laboratório equipado para eletrofisiologia.

Resumo

As gravações de pares envolvem gravações simultâneas de patch clamp de células inteiras de dois neurônios sinapticamente conectados, permitindo não apenas a caracterização eletrofisiológica direta das conexões sinápticas entre neurônios individuais, mas também a manipulação farmacológica do neurônio pré-sináptico ou pós-sináptico. Quando realizado em culturas organotípicas de fatias de hipocampo, a probabilidade de dois neurônios estarem sinapticamente conectados é significativamente aumentada. Essa preparação permite prontamente a identificação de tipos de células, e os neurônios mantêm sua morfologia e propriedades de função sináptica semelhantes às do tecido cerebral nativo. Uma grande vantagem dos registros de células inteiras emparelhadas é a informação altamente precisa que ele pode fornecer sobre as propriedades da transmissão sináptica e plasticidade que não são possíveis com outras técnicas mais rudimentares que utilizam estimulação axonal extracelular. Gravações de células inteiras emparelhadas são frequentemente percebidas como muito desafiadoras para serem executadas. Embora existam aspectos desafiadores nessa técnica, as gravações pareadas podem ser realizadas por qualquer pessoa treinada em clampeamento de patch de células inteiras, desde que critérios metodológicos e de hardware específicos sejam seguidos. A probabilidade de obter gravações emparelhadas sinapticamente conectadas aumenta significativamente com fatias organotípicas saudáveis e micromanipulação estável, permitindo a obtenção independente de gravações de células inteiras pré e pós-sinápticas. Embora os pares de células piramidais CA3-CA3 sejam mais amplamente utilizados na preparação do hipocampo de fatia organotípica, essa técnica também foi bem-sucedida em pares CA3-CA1 e pode ser adaptada a qualquer neurônio que esteja sinapticamente conectado na mesma preparação de fatia. Neste manuscrito, fornecemos a metodologia detalhada e os requisitos para estabelecer essa técnica em qualquer laboratório equipado para eletrofisiologia.

Introdução

Os receptores de glutamato mediar a maior parte da transmissão sináptica excitatória nas sinapses no sistema nervoso central. Os dois subtipos principais de receptores de glutamato ionotrópicos localizadas na cabeça da coluna de a membrana pós-sináptica, são N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-proprionic ácido (AMPA). No potenciais de membrana em repouso, os receptores de AMPA carregam a maior parte da corrente pós-sináptica durante a transmissão sináptica. No hipocampo, o receptor de NMDA desempenha um papel importante no desencadeamento de alteração no número de receptores de AMPA na membrana pós-sináptica: actuando como um "detector de....

Protocolo

Declaração de Ética Animal:

Os protocolos descritos neste manuscrito seguir as orientações de cuidados de animais estabelecidos pela The University of Auckland e da Universidade de Stanford. P7 crias de ratos foram sacrificados por decapitação rápida. Dissecação do hipocampo é então realizada tal como descrito imediatamente abaixo.

1. Organotípicas Hippocampal Fatia Cultura

1. Preparação
   1. Prepare Médio dissecção (usado somente para dissecar o cérebro). Combinar 200 mL de Meio Essencial Mínimo, 2 ml de solução de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de cada, em NaCl a 0,85%), 5 ml de soluç....

Resultados

Conectividade Synaptic é evidente, estimulando o neurônio pré-sináptico para disparar um potencial de ação por meio de um pulso de corrente de despolarização (tipicamente 20-50 aa para 20 ms), através do eletrodo de registro. O rastreio da corrente pós-sináptica é, em seguida, examinadas para a presença de um EPSC monossináptico evocado no curta (<5 ms) e latências consistentes após o pico do potencial de acção pré-sináptico (Figura 3A). Na maioria das experiências múltiplas neurónios pós-sinápticos .......

Discussão

Aqui nós descrevemos os requisitos para estabelecer gravações de células bem sucedidos emparelhados inteiras em culturas organotípicas do hipocampo. Gravações emparelhados também pode ser realizada em várias preparações, incluindo fatias agudas e sistemas de culturas dissociadas ^26,27. Embora o foco aqui foi sobre a indução de mais formas de plasticidade sináptica (nomeadamente LTP e LTD), é importante ressaltar que as gravações de células inteiras emparelhados em organotípica, fatia aguda e dissociado prepar.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Minimum Essential Medium			Stable
Solução de penicilina-estreptomicina			Banho de tecido raso
HEPES solução			DIC câmera
1 M Tris solução			Amplificador
Hank' s Solução Equilibrada de Sal			Sérum para Computador
Cavalos			Mesa de isolamento de vibrações
Espátulas			Microscópio vertical
Pincel			Software de aquisição e análise de dados Picador
		de tecidos manual	Extrator de eléctrodos
#2 Papel			Gaiola de Faraday
#5 Fórceps
Inserções de
			CO2
Capuz de dissecção Capuz
			de classe II

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