A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Resumo

Este protocolo apresenta um método eficaz e fiável para transfectar humanos THP-1, macrófagos com siRNA ou de ADN de plasmídeo por electroporação com alta eficiência de transfecção elevada, mantendo a vitalidade celular e capacidade total de diferenciação de macrófagos e de polarização.

Resumo

Os macrófagos, como os jogadores-chave da resposta imune inata, estão no foco da pesquisa lidando com homeostase do tecido ou várias patologias. A transfecção com siRNA e DNA plasmídeo é uma ferramenta eficiente para o estudo de sua função, mas a transfecção de macrófagos não é uma questão trivial. Embora muitas abordagens diferentes para a transfecção de células eucarióticas estão disponíveis, apenas alguns permitem transfecção eficiente e confiável de macrófagos, mas reduziu a vitalidade celular e comportamento das células severamente alterada como capacidade diminuída para a diferenciação ou polarização são freqüentemente observadas. Por conseguinte, um protocolo de transfecção é exigido que seja capaz de transferir siRNA e o DNA de plasmídeo em macrófagos, sem causar efeitos secundários graves, permitindo, assim, a investigação do efeito do siRNA ou plasmídeo no contexto do comportamento celular normal. O protocolo aqui apresentado fornece um método para a transfecção de forma fiável e eficiente humanos THP-1 e macrófagos monocytes com vitalidade celular elevada, alta eficiência de transfecção, e efeitos mínimos sobre o comportamento das células. Esta abordagem baseia-se Nucleofection eo protocolo foi otimizado para manter a capacidade máxima para a ativação de células após a transfecção. O protocolo é adequado para células aderentes após a separação, bem como células em suspensão, e pode ser usado para pequenas e médias números de amostra. Assim, o presente método é útil para investigar os efeitos reguladores do gene durante a diferenciação de macrófagos e de polarização. Além de apresentar os resultados que caracterizam macrófagos transfectados acordo com este protocolo, em comparação com um método químico alternativo, o impacto da cultura de células de seleção médio após transfecção no comportamento das células também é discutida. Os dados apresentados indicam a importância de validar a selecção de diferentes configurações experimentais.

Introdução

Entre os componentes celulares do sistema imunitário humano, os macrófagos são de grande importância para a resposta imune inata. Suas tarefas são diversas; eles estão envolvidos na fagocitose de agentes patogénicos e material necrótico, estes desempenham um papel importante na homeostase de tecido e produzem e segregam um grande número de citocinas para regular e orquestrar a resposta imune ^1. Portanto, os macrófagos são integralmente envolvido em muitos processos fisiológicos e condições fisiopatológicas. Devido à diversidade das suas tarefas, os macrófagos são um tipo de célula muito heterogênea e multifacetada. Isto é conseguido por diferentes polarizações; dependendo macrófagos estímulos externos podem se desenvolver em diferentes fenótipos ^2. Variabilidade e o impacto dos macrófagos na resposta imune torná-los objeto de pesquisa muito interessante. A fim de elucidar seu metabólica complexa e funções de regulação, macrófagos apropriado modelos in vitro são required que refletem corretamente heterogeneidade macrófagos e variabilidade.

A transfecção de células com vectores de DNA plasmídeo ou pequenos RNAs de interferência (siRNAs), a fim de alterar a expressão genética celular tornou-se uma ferramenta amplamente utilizada e poderosa em biologia celular para investigar tanto a regulação gênica e função do gene. Atualmente existe uma grande variedade de diferentes ferramentas disponíveis para a transfecção de células eucarióticas. Estas ferramentas incluem a aplicação de vectores virais, métodos mecânicos (tais como pistolas de genes), as abordagens químicas (que dependem de polímeros ou lípidos que podem formar complexos com os ácidos nucleicos), e electroporação de células ^3. Todas estas abordagens têm as suas vantagens e desvantagens e escolher o mais adequado a partir desta matriz ampla para um tipo específico de célula e de aplicação pode ser um processo difícil e de consumir tempo.

Os macrófagos são notoriamente difíceis de transfectar transfe como quase todos bem estabelecidaabordagens ction reduzir drasticamente viabilidade 'macrófagos ou interferir com o seu comportamento, ou seja, a diferenciação e em particular de polarização. Portanto, apresentamos aqui um protocolo eficiente, não-viral para transf humanos THP-1 macrófagos utilizando a tecnologia Nucleofector baseada em eletroporação, o que representa uma abordagem eletroporação otimizado exigindo quantidades reduzidas de DNA. Nucleofection é bem adequado para as células sensíveis, tais como monócitos e macrófagos. Este protocolo é uma adaptação de versões publicadas anteriormente ^4,5.

Em resumo, de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) é utilizada para diferenciar humanos Monócitos THP-1 durante 48 horas em macrófagos prematuros antes da transfecção com DNA de plasmídeo ou de siRNA. Para a transfecção os macrófagos predifferentiated são separadas enzimaticamente por tratamento Accutase eu. A transfecção é realizada usando um dispositivo Nucleofector 2b para electroporação das células. Após a transfecção, diferemciação é continuada durante mais de 24 a 48 horas, conforme necessário. Finalmente, os macrófagos maduros transfectadas são incubadas com diferentes tipos de compostos para estudos funcionais.

Esta abordagem permite a transfecção de linhas de células humanas, tais como THP-1, monócitos e macrófagos, e tem sido aplicada com êxito no passado ^6-10. Em contraste com a maioria dos métodos de transfecção química, o nosso procedimento Nucleofection modificada usando macrófagos prematura produz altas eficiências de transfecção em combinação com a viabilidade das células intactas, sem a necessidade de utilizar vectores virais ou adicionar novos compostos veiculares com efeitos secundários desconhecidos. Além disso, os macrófagos retêm o seu potencial para a diferenciação assim como a polarização, permitindo, assim, as investigações funcionais desimpedidos ¹¹ a seguir à transfecção.

Além disso, o meio de cultura de células aplicado após Nucleofection influencia fortemente estudos funcionais seguinte transfection; em particular, a capacidade dos macrófagos para a polarização pode ser influenciada pelo tipo de meio de cultura aplicadas. Aqui quatro diferentes tipos de meios de cultura celular (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 e do rato T celular médio Nucleofector) foram testados em condições desativando usando interleucina (IL) 10 Usando THP-1 macrófagos, observamos que a resposta das células de IL10 é mais forte quando o meio celular Nucleofector rato T é utilizado em comparação com os outros meios de cultura acima mencionados. Estes resultados demonstram que a optimização adequada de todas as condições de cultura de células é essencial para a transfecção bem sucedida de estudos funcionais subsequentes und como estas podem melhorar significativamente os resultados experimentais.

Como os macrófagos estão envolvidos em várias doenças humanas, muita pesquisa está focada em elucidar o comportamento dos macrófagos, bem como mecanismos reguladores que influenciam macrófagos ou por sua vez controlados por macrófagos. Portanto, este protocolo é de relevância emmuitas áreas de investigação diferentes.

Protocolo

1. Predifferentiation de THP-1 macrófagos

1. Cultivar células THP-1 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina / L-glutamina (PSG) num CO ₂ (5% ) incubadora a 37 ° C.
2. Antes de transfecção, as células dividir e transferi-los para o meio RPMI fresca como antes. Cultivar células durante 24 h.
3. Semente de 1,0-1,5 x 10 ⁷ células para um balão de cultura de tecidos de 75 cm ² ou 2,5 x 10 ⁷ células para um frasco de cultura de tecido de 150 cm ² em meio RPMI-1640 e adicionar 10% (v / v) de FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v), piruvato de sódio, 1% (v / v) de aminoácidos não essenciais, 10 ng / ml de PMA e 50 uM β-mercaptoetanol durante 48 h.

2 Preparação de Nucleofection

1. Coloque Accutase eu e todas as mídias em banho de água a 37 ° C.
2. Aspirar meio de cultura de balão e substituir com 6 ml (frasco de 75 cm ²) ou 12 ml (frasco de 150 cm ²) deAccutase I e incubar durante 30 min a 37 ° C durante descolamento total de células. Observar a morfologia das células após tratamento Accutase I para assegurar que as células têm uma aparência redonda. Se algumas células ainda parecem estar ligados, lavar cuidadosamente o frasco com uma micropipeta ou bata suavemente-lo para completar o desapego. Não use raspadores de células, já que isso terá um efeito negativo sobre a vitalidade das células. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml.
3. Durante Accutase I tratamento, prepare as seguintes mídias:
   1. Preparar meio de transfecção: suplemento de meio de cultura de células com 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) de ácidos aminados não essenciais, 1% (v / v), piruvato de sódio e 5% (v / v) de soro humano (por siRNA) ou 20% (v / v) de soro humano (para o ADN do plasmídeo); preparar um volume final de 3 mL ou / amostra para uma placa de 6 poços ou de 4 ml / amostra para duas placas de 12 poços.
   2. Preparar meio de cultura: meio de cultura com suplemento de 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) de aminoácidos não essenciais, 1% (v / v), piruvato de sódio, e 5% (v / v) de huhomem de soro (por siRNA) ou 20% (v / v) de soro humano (do plasmídeo), 2,5 ng / ml de PMA e 50 uM β-mercaptoetanol; preparar um volume final de 3 mL ou / amostra para uma placa de 6 poços ou de 4 ml / amostra para duas placas de 12 poços.
4. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente.
5. Aspirar Accutase células I e ressuspender em 1 ml de meio RPMI pré-aquecido a 37 ° C; contagem de células para determinar o número de células.
   NOTA: Quando rápidos procedimentos de contagem de células automático são utilizados, os passos 2.4 e 2.5 podem ser omitidos e as células podem ser contadas imediatamente depois da separação, desde que a exposição prolongada a Accutase I é evitado.
6. Para cada amostra de transfecção preparar alíquotas em tubos de centrífuga contendo 2,0-2,5 x 10 ⁶ células.

3. Nucleofection de THP-1 macrófagos

1. Centrifugar todos os alíquotas de 10 min a 250 xg à temperatura ambiente.
2. Dilui-se o DNA de plasmídeo ou de siRNA em livre de nucleaseágua ou uma solução tampão apropriada. Manter o volume necessário de DNA de plasmídeo ou siRNA tão pequena quanto possível.
3. Prepare uma cuvete Nucleofector com 1 ug de siRNA ou 0,5 ug de ADN de plasmídeo para cada transfecção.
4. Execute uma transfecção de cada vez. Aspirar o sobrenadante dos aliquota de células.
5. Ressuspender as células peletizadas em solução Nucleofector para se obter um volume total de 100 ul de ADN / siRNA e solução Nucleofector. Manter o tempo de exposição à solução de Nucleofector puro para uma mínima e garantir que o tempo de exposição não superior a 15 min.
6. Misture células ressuspenso e de DNA / siRNA em Nucleofector tina agitando ligeiramente.
7. Células transfecção através da realização de programa de Y-001 no dispositivo 2b Nucleofector.
8. Transferir as células transfectadas para um frasco de reacção, utilizando pipetas de Pasteur de plástico descartável.
9. Imediatamente adicionar 500 mL de meio de transfecção preparado.
10. Repita os passos de 3,4-3,9 para cada amostra de transfecção.

4. Pós-Nucleofection Cuidados

1. Prepare ou 6 poços ou 12 poços de placas de células transfectadas. Pipetar 2,5 ml de meio de transfecção para cada poço de uma placa de 6 poços (1 poço / transfecção) ou 1,75 ml de meio de transfecção para cada poço de uma placa de 12 poços (poços 2 / transfecção).
2. Mistura de suspensões de células cuidadosamente com uma micropipeta.
3. Transferir as células transfectadas nas cavidades preparados (ou um poço numa placa de 6 poços ou dois numa placa de 12 poços).
4. Incubar as placas durante 4 horas numa incubadora humidificada (5% de _CO2, 37 ° C).
5. Confira o reatamento das células ao microscópio.
   NOTA: A maioria das células deve ser aderente novamente. Ocasionalmente, o prolongamento do período de incubação de 1 hora aumenta o número de células aderentes em caso de religação insuficiente.
6. Aspirar cuidadosamente meio de transfecção com uma micropipeta e substitua com uma quantidade igual de meio de cultura. Aspirar apenas um poço de cada vez.
7. Incubar as células para o período de tempo necessário para o efeito máximo de plasmídeo ou siRNA (24-72 hr). Se ultrapassar períodos de incubação de 48 horas, substitua meio após 48 horas.
8. Para o tratamento adicional com efectores (por ex., Citoquinas, agonistas, antagonistas e inibidores) utilizar meio isento de soro sem PMA e β-mercaptoetanol. Tempo ao fim do período de incubação do efector com o tempo do efeito máximo do plasmídeo ou siRNA e planear a troca do meio e adição de efector em conformidade. Não manter as células em condições isentas de soro durante mais tempo do que 24 horas.

Resultados

Usando este protocolo para a transfecção de células THP-1 com ARNsi macrófagos normalmente atingir taxas de transfecção de 90% acima sem redução significativa da vitalidade celular. Figura 1 mostra os dados representativos que caracterizam o estado das células 24 horas após a transfecção com siARN marcado com fluorescência contra o não-transfectadas controle, que não foram tratados com reagentes Nucleofection e pulso ou siRNA, mas recebeu todas as mudanças de meios de cultura como amostras transfectadas. Na Figura 1A a morfologia celular é mostrada de acordo com a medição de citometria de fluxo. As imagens microscópicas são mostrados na Figura 1B Figuras 1C e 1D representam as baixas taxas de apoptose (controle: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). E necrose (controle: 2,0%; Nucleofection: 3,2%), indicando a vitalidade das células afetadas. Necrose e apoptose são ligeiramente mais elevada para a amostra transfectadas como transfectadas células THP-1 são mais macrófagosdifícil de separar do que as células não transfectadas, assim, a probabilidade de danos às células durante aumentos de descolamento. Finalmente a eficiência de transfecção é apresentada na Figura 1E. Como toda a população transfectada é deslocada contra o controlo, isso indica que todas as células são transfectadas que é confirmado por imagens microscópicas de fluorescência (Figura 2B). Ambos os dados de citometria de fluxo, bem como as imagens microscópicas de fluorescência indica que todas as células são transfectadas de forma consistente com a distribuição homogénea de siRNA entre células, bem como no interior das células. Isto está em contraste com muitos reagentes de transfecção químicos, para comparação Figuras 2A e 2B mostram os respectivos dados de citometria de fluxo de fluorescência e imagens microscópicas de um agente químico de transfecção usando uma abordagem baseada em lípidos. Estes dados mostram que duas populações distintas de células transfectadas pode ser detectada. A primeira população é semelhante à das células transfectadas seguinasa Nucleofection. Eles são caracterizados por uma baixa fluorescência global e da distribuição homogénea de siRNA dentro das células. A segunda população é marcada por uma fluorescência mais intensa que se origina a partir de aglomerados intracelulares muito brilhantes de siRNA. A morfologia celular permanece inalterada para ambas as abordagens de transfecção como mostrado por contraste de interferência diferencial na Figura 2C. As transfecções usando o DNA de plasmídeo de forma eficaz o rendimento resultados semelhantes, para exemplos, consulte Robenek et al. (2009) ⁹ ou Xie et al. (2006) ^7.

A escolha do meio de cultura de células após a transfecção é de grande importância; Por conseguinte, diferentes meios de cultura de células foram testadas em comparação. Os meios de comunicação selecionados são adequados para o cultivo de células THP-1 e foram escolhidos de acordo com as recomendações da Lonza como mídia aplicável para pós-Nucleofection cultivo. Figura 3 representa o MEDIAT siRNAed knockdown eficiência usando um siRNA dirigido contra IL10RB (interleucina 10 do receptor de cadeia β) mRNA. Para todos os meios testados a expressão de IL10RB foi significativamente reduzido para cerca de 10 a 20% do nível de controlo (Figura 3). No entanto, as células transfectadas são diferentes dependendo do meio de cultura no seu potencial de polarização. THP-1 transfectadas com os macrófagos ou siRNA de controlo ou inespecífica IL10RB específicos siRNA foram cultivadas em diferentes meios, após a transfecção e tratados com IL-10. Subsequentemente, os níveis da SOCS3 gene induzida por IL-10 (supressor de sinalização citocina 3) no nível de expressão de ARNm foi medido por RT-qPCR. As diferenças entre o meio de cultura ocorre em relação à extensão da indução da expressão de mRNA SOCS3 (Figura 4), ​​as induções para cada um dos meios testados rato T celular Nucleofector Médio, LGM3, X-VIVO 20 e IMDM foram de 19,5 [17,7-21,5 ], 11,5 [8,5-15,7], 8,0 [4,6-14,2] e 7,2 [5,6-9,5] vezes, respectivamente. Aaplicação Refore do meio Nucleofector Rato T celular é vital. Além disso, as diferenças no efeito do knockdown de IL10RB na expressão SOCS3 após o tratamento de IL-10 eram observáveis, os níveis de expressão de mRNA SOCS3 foram reduzidos para 9,5 [8,8-10,3] dobra na célula do rato T médio Nucleofector, 2,1 [1,1-4,1] dobrar em LGM3, 4,8 [3,2-7,2] vezes em X-VIVO 20 e 3,3 [2,7-3,9] dobrar em IMDM. Estes valores correspondem a uma redução de expressão SOCS3 na mídia diferente a 49%, 18%, 60% e 45%, respectivamente. Redução da expressão de IL-SOCS3 induzida por 10, após a transfecção de IL10RB siRNA confirma a regulação negativa sucedida de IL10RB pela transfecção.

Figura 1 Caracterização de THP-1 transfectadas macrófagos. O estado característico das células é afectado, como revelado por microscopia de luz e análise de citometria de fluxo de co transfectadasntrol contra células THP-1 transfectadas com os macrófagos de acordo com o protocolo apresentado. THP-1, macrófagos foram diferenciadas com 10 ng / ml de PMA durante 48 horas e transfectadas com marcado por fluorescência (Alexa 488) de controlo não específico de siRNA. 24 h depois da transfecção, quer imagens de células vivas foram tomadas (B), ou as células foram descoladas por tratamento Accutase I e analisadas por citometria de fluxo (A). A apoptose e necrose de coloração foi realizada utilizando anexina V-ficoeritrina (PE) (C) e 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D). A eficiência de transfecção (E) foi determinada por citometria de fluxo utilizando a etiqueta fluorescente ligado ao siRNA. O sinal de fluorescência das células transfectadas (preto) é mostrado contra o sinal de controle (cinza). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 Comparação da distribuição intracelular de siRNA após Nucleofection contra lipofec�o THP-1. Células foram diferenciadas para 48 horas de acordo com este protocolo e, em seguida transfectadas quer por Nucleofection ou por lipofec�o. Os resultados apresentados foram obtidos a lipofecção, utilizando o kit Xtremegene siRNA de acordo com as recomendações do fabricante, com uma razão de carga de reagente de siRNA de 4: 1. 24 horas após a transfecção as células foram ou isolada com Accutase I para análise por citometria de fluxo ou avaliados microscopicamente com células vivas. (A) A eficiência de transfecção e da distribuição de siRNA por célula dentro da população foi determinada por citometria de fluxo utilizando a etiqueta fluorescente ligado ao siRNA, controlos sem siARN transfectadas são mostradas a cinzento, amostras transfectadas com siARN são mostrados em preto. (B) A microscopia de fluorescênciaas imagens que mostram a distribuição intracelular de siARN marcado com fluorescência (Alexa Fluor 488); a barra da escala representa 40 um. Imagem de contraste de interferência diferencial correspondente à imagem de fluorescência (C); a barra de escala representa 40 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Knockdown de IL10RB Figura 3 siRNA mediada em células THP-1 transfectadas macrófagos. THP-1 foram transfectadas com os macrófagos de acordo com o protocolo estabelecido. Após transfecção as células foram cultivadas em quatro meios de cultura, ou seja, do rato T celular médio Nucleofector (A), IMDM (B), LGM3 (C), e X-Vivo 20 (D), suplementado, tal como descrito na secção de Protocolo. Cvaras ou foram transfectadas com o controlo não específico siRNA (Ctrl) ou IL10RB específica siRNA (IL10RB). Como controles adicionais as seguintes amostras foram incluídos: controle de impulsos, ou seja. As células que sofreram transfecção na ausência de siRNA (Pulso), e um meio de controlo, ou seja. células que receberam apenas as mudanças de meios de cultura, mas permaneceu, se não tratada. 24 horas após a transfecção as células foram incubadas em meio livre de soro com ou sem 50 ng / ml de IL-10 por mais 24 horas. Expressão IL10RB foi medido por RT-qPCR; diagramas mostram a média de três experiências independentes, as barras de erro representam o erro padrão da média; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 vs Ctrl. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4.-dependente IL10 regulação de SOCS3 após knockdown de IL10RB transfectadas em células THP-1 macrófagos. THP-1 foram transfectadas com os macrófagos de acordo com o protocolo descrito. Após transfecção as células foram cultivadas em quatro diferentes meios de cultura de células T do rato meio Nucleofector (A), IMDM (B), LGM3 (C) e X-Vivo 20 (D) suplementado, tal como descrito na secção de Protocolo. As células foram transfectadas, quer com o controlo não específico siRNA (Ctrl) ou IL10RB específica siRNA (IL10RB). Como controlos adicionais, as seguintes amostras foram incluídos: o controlo de impulsos, isto é, as células que sofreram transfecção na ausência de siNRA (Pulso), e um meio de controlo, ou seja. células que receberam apenas as mudanças de meios de cultura, mas permaneceu, se não tratada. 24 horas após a transfecção as células foram incubadas em meio livre de soro com ou sem 50 ng / ml de IL-10 por mais 24 horas. SOCS3 expression foi medido por RT-qPCR; diagramas mostram a média de três experiências independentes, as barras de erro representam o erro padrão da média; *, # P <0,05; **, ## P <0,01; ***, ### P <0,001 vs Ctrl e vs. Ctrl + IL-10, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo descrito aqui apresenta uma maneira confiável e eficiente para transf THP-1 macrófagos, que são geralmente bastante difícil para transf. A transfecção pode ser conseguida com a eficiência de transfecção de 90% para acima de siRNA, sem redução significativa da vitalidade celular. Eficiências de plasmídeos pode ser menor devido ao seu tamanho, mas de transfecção eficiência de cerca de 70% podem ser normalmente alcançados. A eficiência de knockdown mediada por siARN pode atingir 80 a 90%, dependendo do siRNA aplicada. Uma grande vantagem deste protocolo é que ele não interfira com a diferenciação celular. Após transfecção as células ainda responder normalmente a diferenciação agente PMA (Figura 1A a 1B e Figura 4) ^12. Além polarização celular por estímulos de citocinas, tais como IL-10 ou com LPS / IFN-y não é afectada ^{de 12,} embora este também depende fortemente do meio seleccionada para cultura após a transfecção de ums mostrado na Figura 4.

Existem várias opções dentro do procedimento que pode ser modificado, a fim de adaptar o protocolo para requisitos específicos. Como mostrado na Figura 4, as células de reagir de forma diferente ao mesmo estímulo IL10, dependendo do meio de cultura seleccionado após a transfecção. Isto indica que a composição do meio tem uma forte influência sobre o comportamento celular. Como o efeito impostas pelo meio pode ser diferente para diferentes estímulos experimentais, é possível que a forma optimizada pode mudar e, por conseguinte, há uma necessidade de se verificar a adequação do meio de diferentes experiências de forma independente. No entanto, o meio RPMI-1640, que é a forma padrão usada para cultivo de células THP-1, tem provado ser pouco adequado para o cultivo após transfecção como observou-se uma significativa perda de vitalidade das células. Além disso, o protocolo pode também ser aplicado para monócitos THP-1 sem diferenciação induzida por PMA antes deste,obviamente, elimina a necessidade de separação de células durante o processo, mas todos os passos restantes não têm de ser ajustados. Os monócitos THP-1 podem ser diferenciadas em seguida, se necessário.

Os elementos mais críticos do protocolo são, em primeiro lugar o desapego e em segundo lugar o tempo necessário para a transfecção. A separação deve ser realizada o mais suavemente possível, a fim de manter a viabilidade celular elevada. Portanto, recomendamos o desprendimento enzimática relativamente leve por Accutase I em relação aos métodos bastante agressivos, como tripsinização. Outros métodos, tais como descolamento de tratamento com Lidocain ou raspagem foi encontrado para ser um pouco prejudicial e não deve ser utilizada. No caso de que 30 minutos de tratamento Accutase I não deve ser suficiente para retirar todas as células propriamente este geralmente é uma indicação de uma solução armazenada de forma incorrecta ou expirou Accutase I ou de vários ciclos de congelamento-descongelamento. Temos obtido bons resultados, armazenando pequenas alíquotas de Accutase I a -20 °C para reduzir o número de ciclos de congelamento e descongelamento. No entanto, quando existe descolamento insuficiente ou substituir Accutase I com Accutase fresco ou aumentar o tempo de incubação de até 1 h. Além toque suave ou a lavagem do frasco ou placa pode ajudar descolamento. No que diz respeito ao tempo necessário para a transfecção o tempo de exposição das células à solução de Nucleofector puro tem grande impacto na sobrevivência celular e, assim, deverá ser tão curto quanto possível. A melhor maneira de conseguir isso é a realização de cada transfecção de cada vez (Passos 2,10-2,15) e não vários transfections em paralelo.

Se a eficiência knockdown é baixo, o que normalmente não é causada por uma baixa eficiência de transfecção, mas isto pode ser facilmente verificado através de citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência e de siARN marcado com fluorescência ou um plasmídeo que codifica a GFP. Principalmente a causa é um siRNA ou plasmídeo de DNA ineficiente. Sob estas circunstâncias deve considerar-se a aumentar a quantidade de siRNA (até 2-3 ug) ouo plasmídeo de ADN (até 1-2 mg) ou a utilização de um siRNA ou vector de expressão diferente, se disponível. Alternativamente, os resultados satisfatórios podem também ser conseguido através da utilização de uma associação de várias diferentes siRNAs dirigidos contra o mesmo alvo. Além disso, as experiências de cursos de tempo pode ser necessário determinar com precisão o período de efeito máximo, o qual é geralmente atingido após 24 a 72 h após a transfecção.

Para além da transfecção por electroporação, existem ainda as técnicas bem estabelecidas para a transfecção de células de mamíferos. Frequentemente são utilizados sistemas de agentes de transfecção químicas que podem formar complexos com o ácido nucleico de carga e, em seguida, facilitar o transporte para as células. Os reagentes mais usados ​​são ou baseados em diferentes espécies de lípidos, ou pode ser escolhido a partir de um número de polímeros catiónicos ^3. Para tanto se aproxima de uma variada seleção está disponível comercialmente. Estes reagentes de transfecção oferecem a vantagem de que eles são geralmenteé fácil de usar, não exigem muito tempo, e trabalhar com células aderentes, bem como, eliminando assim a necessidade de destacamento. Infelizmente, os macrófagos são bastante difíceis de transfectar por estes métodos como eles não proliferam significativamente in vitro e possuem mecanismos de defesa contra ADN citosólica externa ^13-15. Assim, as abordagens química transfecção resultam frequentemente numa diminuição acentuada da viabilidade celular. No entanto, como mostrado na Figura 2, há agentes de transfecção químicos que podem ser transferidos com sucesso siRNA em macrófagos, mas como citometria de fluxo (Figura 2A) e de microscopia de fluorescência (Figura 2B) as análises indicam que eles não conseguem atingir a mesma distribuição homogénea de siRNA dentro das células como obtido por Nucleofection. Na verdade, os dados de citometria de fluxo indicam que duas populações diferentes de células transfectadas ocorrer, em primeiro lugar, com uma população semelhante de fluorescência que as células após Nucleofection é detectado e em segundo lugar, há uma população com mais intensa fluorescência. Confirmação definitiva ainda é necessário, mas supõe-se que a primeira população é na microscopia de fluorescência idênticas às células que apresentam uma distribuição homogénea de siRNA fluorescente dentro do citoplasma, enquanto a segunda população susceptível corresponde às células com aglomerados muito brilhantes. Os dados da citometria de fluxo mostrado na Figura 2A resultados sugerem que Nucleofection em menos de siRNA por célula do que a abordagem alternativa lipofecção. No entanto, os dados da Figura 3 mostra que, mesmo a quantidade comparativamente pequena de siRNA incorporada por Nucleofection já é suficiente para 80 a 90% knockdown do gene alvo. Portanto, o montante adicional de siRNA incorporado pela segunda população após transfecção química é muito provável excedente e é, portanto, mais propensos a causar efeitos colaterais indesejáveis ​​do que para aumentar ainda mais a eficiência knockdown. Além de queformação de aglomerados intracelulares já é em si mesmo indesejável uma vez que estas moléculas não são siRNA provavelmente funcional ou, pelo menos, menos eficiente do que as moléculas de siRNA livres e pode causar efeitos fora do alvo. Além disso, a verdadeira natureza destes aglomerados ainda não está clara. É possível que estes pontos brilhantes representam endossomas, indicando que o siARN foi internalizada pelas células mas, subsequentemente, soltar a partir dos endossomas falhou e o siRNA permanece presa e, por conseguinte, ineficazes. Em alternativa, os pontos podem ser aglomerados que são formadas intracelularmente. Avaliações funcionais da transfecção química estão pendentes, portanto, não há indicações definitivas sobre a eficiência knockdown pode ser feito, no entanto, ainda a existência de duas populações distintas já é desfavorável, pois isso significa que todos os resultados descrevem a média de ambas as populações, este, portanto, não corresponde à quer das populações. Por essa razão é Nucleofection a abordagem superior.

No entanto, há também limitações ao processo de transfecção descrito aqui. Uma vez que as células têm que estar em suspensão em células aderentes Nucleofection precisa ser desmontada, o que apresenta um factor de stress adicional para as células. Além disso, todo o protocolo é bastante moroso. Desde transfecções não podem ser realizadas simultaneamente, mas tem que ser realizada rapidamente, a fim de evitar os danos celulares, o número de amostras seja limitada a cerca de 8-10 por experiência. Assim, esse protocolo não é adequado para projetos de rastreio de elevada capacidade. Para aplicações de alto rendimento diferentes sistemas Nucleofector estão disponíveis. Em primeiro lugar, existe o sistema 4D-Nucleofector que proporciona um formato de tira 16 bem. Para ainda maior rendimento, há o sistema de transporte de 96 poços e 384 poços sistema HT Nucleofector. No entanto, como estes sistemas mais recentes trabalham com eletrodos de Polímeros Condutores em vez de alumínio e, portanto, condições elétricas, ou seja, programas e composition de solução Nucleofector, ter mudado de acordo, ele precisa ser determinado se o nosso protocolo pode ser transferida para esses sistemas.

No entanto, apesar destas limitações do protocolo apresentado aqui se obter uma transfecção eficaz e fiável de células THP-1, que é superior a todas as outras abordagens não virais. Este protocolo permite a investigação dos efeitos de expressão genética alterada, em células THP-1, que em todos os outros aspectos diferenciam e segregam, normalmente e, portanto, mostram como pequenos efeitos secundários de transfecção quanto possível.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Aminoácidos, não essenciais	PAA	M11-003
Tubos de centrífuga (15 ml)	TPP	TPP91015
Soro fetal de bezerro (FCS gold)	PAA	A15-151
Kit de nucleofector de monócitos humanos	Lonza	VPA-1007	Contém solução de nucleofector, cubetas e Pasteur pipetas
Soro humano fora do coágulo	Lonza	C11-020
Meio de Dulbecco modificado de Isove (IMDM) com 25 mM HEPES e 25 mM L-glutamina	Lonza	12-722F
Meio de crescimento de linfócitos 3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Meio Nucleofector de células T de camundongo	Lonza	VZB-1001
Nucleofector 2b	Lonza	AAD-1001
Penicilina / estreptomicina / L-glutamina (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Médio (RPMI 1640)	PAA	E15-840
siRNA / plasmídeo
piruvato de sódio (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 leucemia humana	monócitos CLS	300356
Frascos de cultura de tecidos (75 cm²; 150 cm²)	TPP	TPP90076/TPP90151
Placas de cultura de tecidos (6 poços; 12 poços)	Tubos TPP	TPP92406/TPP92012
(1,5 ml)	StarLab	S 1615-5500
Água (sem nuclease) ou tampão
X-Vivo 20 com gentamicina	Lonza	BE04-448Q
β-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148