Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Resumo

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Resumo

Anastasis (grego para "ressuscitar para a vida") refere-se a recuperação de células que morrem. Antes essas células se recuperar, eles passaram por checkpoints importantes da apoptose, incluindo fragmentação mitocondrial, liberação de citocromo c para o citosol, ativação de caspases, condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, blebbing membrana plasmática, o encolhimento celular, exposição da superfície celular de fosfatidilserina, e formação de corpos apoptóticos. Anastasis pode ocorrer quando os estímulos apoptóticos são removidos antes da morte, permitindo assim que as células morrem a inverter a apoptose e, potencialmente, outros mecanismos de morte. Portanto, anastasis parece envolver processos de cura fisiológicas que também poderiam sustentar as células danificadas de forma inadequada. As funções e mecanismos de anastasis ainda não estão claros, prejudicado em parte pelas ferramentas limitadas para a detecção de eventos passados ​​após a recuperação de células aparentemente saudáveis. Estratégias para detectar Anastasis permitirá estudos sobre os mecanismos fisiológicos, os perigos de células mortas-vivas em patologia da doença e possíveis terapias para modular anastasis. Aqui, descrevemos estratégias eficazes por meio de microscopia de células vivas e um biossensor caspase mamífero para identificar e rastrear anastasis em células de mamíferos.

Introdução

A apoptose (palavra grega para "cair para a morte") é geralmente aceite que é um processo de uma maneira que termina em suicídio celular ^1-7. Perturbação genética de pró-morte genes resulta na sobrevivência de células extra que de outra forma morrem em animais inteiros, incluindo as células que já iniciadas ^8,9 a via de apoptose. Da mesma forma, as manipulações genéticas permitem que as células de mamíferos saudáveis ​​que artificialmente mostrar "me come" sinais ou que perdem aderência à sua matriz extracelular para escapar da morte por fagocitose de células inteiras ou entosis, respectivamente ^10,11. No entanto, nós e outros mostrar....

Protocolo

1. Preparação de células para imagens de células vivas

1. Para facilitar a detecção de alterações morfológicas, escolher células aderentes, tais como células HeLa (carcinoma cervical humano), as células que são planas sobre o substrato para melhor visualizar alteração da membrana plasmática e organelos intracelulares.
   Nota: Reversão de apoptose tem sido observada em várias células de mamífero ^12,13, incluindo as células do fígado de rato primária, macrófagos primários, cardiomiócitos primários de rato, e também linhas celulares tais como as células de rim embrionário humano HEK-293T, macaco verde africano epiteliais renais COS -7 células mus....

Resultados

Para estudar a reversão da apoptose, células de cultura de tecido são primeiro expostos a um estímulo de morte para desencadear a apoptose. Quando as células apresentam marcas de apoptose, o meio de cultura fresco é então aplicada para lavar o estímulo e em seguida incubar as células moribundas para permitir a recuperação (Figura 1A). Aqui, a questão-chave a ser abordado é o quão longe morrendo células cultivadas individuais podem progredir para apoptose e ainda sofrer anastasis. Esta questão pode ser d.......

Discussão

Anastasis se refere ao fenômeno em que as células que tenham activado via de morte celular reverter posteriormente o processo de morrer e sobreviver. Aqui, nós demonstramos que imagens de células vivas podem ser usados ​​para confirmar que as mesmas células individuais de fato pode reverter processo de morte celular por apoptose numa fase tardia, e, em seguida, continuar a sobreviver e reproduzir. Os nossos protocolos descrever várias condições de tratamento específicas do tipo de células optimizado para induzir apoptos.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscopia confocal LSM780	Carl Zeiss
Prato de cultura com fundo de vidro	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Transparente CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 meio independente	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
Anexina V marcada com fluorescência Biovision		K201