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Artigo de método

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

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DOI:

10.3791/51964

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16 de fevereiro de 2015

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1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Resumo

Anastasis (grego para "ressuscitar para a vida") refere-se a recuperação de células que morrem. Antes essas células se recuperar, eles passaram por checkpoints importantes da apoptose, incluindo fragmentação mitocondrial, liberação de citocromo c para o citosol, ativação de caspases, condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, blebbing membrana plasmática, o encolhimento celular, exposição da superfície celular de fosfatidilserina, e formação de corpos apoptóticos. Anastasis pode ocorrer quando os estímulos apoptóticos são removidos antes da morte, permitindo assim que as células morrem a inverter a apoptose e, potencialmente, outros mecanismos de morte. Portanto, anastasis parece envolver processos de cura fisiológicas que também poderiam sustentar as células danificadas de forma inadequada. As funções e mecanismos de anastasis ainda não estão claros, prejudicado em parte pelas ferramentas limitadas para a detecção de eventos passados ​​após a recuperação de células aparentemente saudáveis. Estratégias para detectar Anastasis permitirá estudos sobre os mecanismos fisiológicos, os perigos de células mortas-vivas em patologia da doença e possíveis terapias para modular anastasis. Aqui, descrevemos estratégias eficazes por meio de microscopia de células vivas e um biossensor caspase mamífero para identificar e rastrear anastasis em células de mamíferos.

Introdução

A apoptose (palavra grega para "cair para a morte") é geralmente aceite que é um processo de uma maneira que termina em suicídio celular 1-7. Perturbação genética de pró-morte genes resulta na sobrevivência de células extra que de outra forma morrem em animais inteiros, incluindo as células que já iniciadas 8,9 a via de apoptose. Da mesma forma, as manipulações genéticas permitem que as células de mamíferos saudáveis ​​que artificialmente mostrar "me come" sinais ou que perdem aderência à sua matriz extracelular para escapar da morte por fagocitose de células inteiras ou entosis, respectivamente 10,11. No entanto, nós e outros mostraram que, sem manipulação genética de células de mamíferos saudáveis ​​normais e linhas de células também pode recuperar desde as fases iniciais da apoptose 12-15. Usando ferramentas para rastrear células individuais, demonstramos ainda mais a recuperação de estágios finais de apoptose 12,13, depois que as células passaram checkpoints importante que típicoly marcar o "ponto de não retorno" 2-6. Estes pontos de controlo de fase de apoptose tardia incluem libertação mitocondrial de citocromo c, a activação de caspases, fragmentação nuclear, e formação de corpos apoptóticos. Adotamos uma palavra composta grega "anastasis", que significa "subindo para a vida", para descrever essa inversão de apoptose à beira da morte celular 2-6.

A não ser que todo o processo de morrer recuperação é observado por imagens de células vivas, é um desafio para distinguir as células que sofreram anastasis a partir de células que nunca experimentaram eventos apoptóticos. Décadas de trabalho têm revelado que as características morfológicas de suicídio celular por apoptose são movidos por eventos bioquímicos e moleculares conservados evolutivamente 16-19. Estes eventos promover a auto-destruição das células que regulam os processos de desenvolvimento e homeostáticos em organismos unicelulares e pluricelulares, eliminando danificado ou dcélulas angerous 16-19. Enquanto as células em apoptose pode ser facilmente distinguidos por manifestações morfológicas, bioquímicas e moleculares padronizados de apoptose 1,5,6,16,20, atualmente não há nenhum marcador conhecido específico para anastasis 12,13. É importante notar que as células que sofreram anastasis parecem ser as células saudáveis ​​normais, e as células que começam a inversão apoptose apenas aparecem como células moribundas apoptóticos 12,13. Assim, novas ferramentas são necessárias para concluir com segurança que uma determinada célula sobreviver já havia experimentado processos apoptóticos ativos.

A apoptose é geralmente assumido como uma cascata irreversível porque é um processo de destruição rápida e maciça. Embora possa demorar alguns minutos para dias para algumas células para iniciar a apoptose, uma vez que as mitocôndrias têm lançado fatores apoptogénicas como citocromo c para o citosol 21,22, caspases pode ser ativado dentro de 5 minutos 23,24, seguido por citoplasmática econdensação nuclear dentro de 10 min 25-27, e morte celular pouco depois 25-27. Caspases activadas orquestrar a apoptose por clivagem e inactivação de componentes estruturais e funcionais importantes para o propósito de demolição 2,28 celular, tais como o inibidor da endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases também ativar fatores pró-apoptóticos, como BID membro família Bcl-2, que transloca para a mitocôndria para promover a liberação mitocondrial do citocromo c 31,32. Atividade Caspase também resulta em exposição na superfície celular de phosphatidylserine como um "me comer" sinal para a promoção engulfment de morrer células por macrófagos ou células vizinhas através de fagocitose 33. Além disso, os eventos apoptóticos tornar mitocôndrias disfuncionais, interrompendo bioenergética celular e metabolismo 34,35,36. Assim, a recuperação de tal destruição parece intuitivamente improvável.

Contrariamente ao original esperarções, as células podem reverter o processo de morte celular por apoptose, mesmo numa fase tardia. Ao monitorar continuamente o destino de morrer células em cultura, observou-se a reversibilidade da fase de apoptose tardia em um intervalo de células primárias e linhas de células 12,13. A remoção do estímulo morte permitiu a recuperação das características evidentes de apoptose, tais como a fragmentação mitocondrial, a condensação da cromatina, danos no ADN, de vesículas de membrana do plasma, a exposição da superfície celular de fosfatidilserina, a libertação de citocromo c mitocondrial, activação de caspases, fragmentação nuclear, encolhimento da célula, e formação de corpos apoptóticos. Estas observações levantam questões sem respostas sobre as funções, as consequências, e os mecanismos de anastasis. Para responder a estas perguntas, um pré-requisito é para identificar com segurança as células que sofreram anastasis. Aqui, descrevemos os métodos de microscopia ao vivo e um biossensor caspase para detectar células que já inverteu apoptose fase tardia e then sobreviveu.

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Protocolo

1. Preparação de células para imagens de células vivas

  1. Para facilitar a detecção de alterações morfológicas, escolher células aderentes, tais como células HeLa (carcinoma cervical humano), as células que são planas sobre o substrato para melhor visualizar alteração da membrana plasmática e organelos intracelulares.
    Nota: Reversão de apoptose tem sido observada em várias células de mamífero 12,13, incluindo as células do fígado de rato primária, macrófagos primários, cardiomiócitos primários de rato, e também linhas celulares tais como as células de rim embrionário humano HEK-293T, macaco verde africano epiteliais renais COS -7 células musculares cardíacas de rato, HL-1 células, os fibroblastos de rato NIH 3T3, furão (Mustela putoris furo) CRL1656 células do cérebro, células A375 de câncer de pele humana, células de câncer testicular CRL1973 humanos, células pequenas humanos H446 de carcinoma de pulmão de células, o câncer de fígado humano As células HepG2, células MCF-7 de cancro da mama humanos, células PC3 cancerosas humanas da próstata e células de neuroblastoma SH-SY5Y humanos.
  2. Pré-lavagem de lamelas de vidro de vidro placas de cultura de célula inferior com etanol absoluto para limpeza e esterilização.
    Nota 1: O uso de pratos de vidro de fundo é recomendado para alta qualidade de contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia, e alta confocal ampliação ou microscopia de epi-fluorescência (ver discussão).
    Nota 2: Para ampliações elevadas (40X, 60 / 63X ou 100X objetivos e altas aberturas numéricas 1.3 ou 1.4), o uso de placas de cultura de células com fundo de vidro mais fino (espessura 0,085-,16 mm) proporciona longas distâncias para a imagem latente de trabalho (Veja Protocol 3 ).
  3. Dependendo do tipo de célula, placas de cultura de vidro de fundo pode necessitar de revestimento com poli-d-lisina (0,1 mg / ml), colagénio (solução 0,01% em ácido acético 0,01 M) e / ou fibronectina (5 ug / ml) antes da semeadura células.
    Nota: A optimização do tipo e concentração de agente de revestimento é necessário para diferentes linhas de células. Células HeLa podem aderir directamente sobre o vidro, sem revestimento. No entanto, algumas células, Such como rato musculares cardíacas HL-1 células, não podem aderir diretamente para superfícies de vidro, mas exigem protocolos de cultura e de revestimento específicas 37.
  4. Semente de ~ 2-3 x 10 5 células em 35 milímetros de vidro pré-revestidas placas de cultura de células e incubar inferior a 37 graus Celsius (° C) com 5% de CO 2 durante um dia para alcançar 80% de confluência.
    Nota 1: As condições óptimas de densidade das células, tempo de incubação, e as condições de cultura podem variar, dependendo do tipo de célula. Confluência celular pode afetar a resposta apoptótica de células (Veja o Protocolo 2). Em alta confluência, as células podem ser menos sensíveis às mesmas concentrações de estímulos apoptóticos.
    Nota 2: Evitar o excesso de células confluentes, como alta densidade celular pode obscurecer alterações morfológicas de células individuais e suas organelas.

2. Aplicação e remoção de Apoptotic celular Estímulos

  1. Pouco antes da utilização, pré-misturar o agente de indução de apoptose com 37 ° C, meio de cultura celular. Etanol (3,6-4,5% Vol / vol) serviu como indutor de apoptose na presente demonstração.
    Nota 1: Os dados publicados e não publicados demonstram que as células também pode reverter a apoptose, que é desencadeada por outros estímulos apoptóticos 12,13, tal como dimetil sulfóxido (DMSO, 8% v / v, durante 24 horas), estaurosporina (STS, 0,5 uM para 1 hr), e o taxol (1 uM durante 12 horas). Optimização de dosagem para o desencadeamento de apoptose é necessário para diferentes tipos de células para alcançar a dosagem mínima que pode desencadear a maioria das células na população que sofre apoptose.
    Nota 2: Pré-mistura de agentes indutores da apoptose por meio de cultura de células é importante para evitar a exposição desigual das células a estímulos apoptóticos.
  2. Imagem de um grupo de células de saúde no prato de cultura de células antes de se aplicar o agente de indução de apoptose para estabelecer morfologias da linha de base.
  3. Remover o meio original da placa de cultura de células, e, em seguida, aplicam-se 2 ml de agente indutor de apoptose pré-misturado com o prato dedesencadear células para sofrerem apoptose. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 (ou outras condições de cultura normais).
  4. Após a incubação, as células observar pela luz, de epi-fluorescência ou microscopia confocal para monitorizar a progressão de características apoptóticas.
    Nota 1: As células que sofrem apoptose exibirá características morfológicas, bioquímicos e moleculares de apoptose que podem ser detectados por microscopia e biossensores baseados em fluorescência (Veja Protocolos 3 e 4).
    Nota 2: O tempo de incubação das células com diferentes indutores de apoptose variará, dependendo do tipo de célula, condições de células (tais como o estado dos nutrientes e de confluência), e a dose de estímulo aplicado morte. Titulação cuidadosa pode não ser necessária.
  5. Quando as células exibir marcas de apoptose, remover agente de indução de apoptose por lavagem das células uma vez com água morna (37 ° C, ou outra temperatura de cultura normal) meio de cultura de células fresco.
    Nota 1: As células em apoptose são mais frouxamente ligados ema placa de cultura, é importante aplicar e remover suavemente meio de modo que as células não serão lavados.
    Nota 2: As células suspensas ao vivo pode ser recuperado a partir do sobrenadante por centrifugação suave (160 xg durante 1 min) e foi adicionado de volta para o prato de cultura.
  6. Incubar as células a 37 ° C com 2 ml / prato de 35 milímetros de meio de cultura celular fresco em 5% de CO 2. Como alternativa, o uso de meio condicionado (sem células meio de cultura recolhidos a partir de células saudáveis) para aumentar ainda mais a sobrevivência das células em apoptose.
    Nota: Lavagem e incubando as células com meio fresco permitir que a maioria das células para inverter a apoptose induzida por etanol após exposição ao etanol, 12,13. No entanto, repetindo este passo de lavagem pode ser necessária quando as células são expostas a outros estímulos apoptóticos (ver discussão).

3. Viver Microscopia celular

  1. Recomendamos o uso de um confocal ou epi-fluorescência microscópio invertido com controle ambiental (37 ° C,5% de CO 2) para a microscopia de células vivas.
    Nota: Também é possível para a imagem das células utilizando microscópios verticais com um objetivo de imersão de água. Mergulhar o objectivo directamente para o meio de cultura para células de imagem. No entanto, as células podem ser esmagados pela objectiva de imersão durante a focagem.
  2. Pré-aquecer o microscópio (como câmara ambiental controle, palco incubadora, e aquecedor objetiva), pelo menos 2 horas antes de imagem.
    Nota: Isto permite que componentes de microscópio para alcançar termo-equilíbrio, de modo que pode evitar o desvio de focagem e de mudança de plano xy, devido à expansão e contracção térmica dos componentes.
  3. Coloque um 35 milímetros prato de vidro de fundo das células em cultura (Veja Protocolo 1) no palco de um microscópio invertido e capturar imagens de células usando um plano de Apochromat objetiva de 40X ou 63X com uma abertura numérica (NA) 1.3 ou 1.4 para a imagem latente de células do fundo do prato através de lamelas de vidro.
    Nota: Evite aplicar mais de 2 ml de meioprato inferior a 35 mm de vidro, como o peso do meio poderia causar curvatura do fundo de vidro, o que torna difícil a imagem um campo de células no mesmo plano focal.
  4. Manter as células a 37 ° C ou a temperatura normal correspondente durante todo o processo de imagiologia.
    Nota: O processo de apoptose, e provavelmente à reversão de apoptose, depende de actividades enzimáticas sensíveis à temperatura. Por conseguinte, a manutenção de células a 37 ° C (por exemplo com um microscópio de fase superior incubadora) é importante em todo o experimento. Diminuição da temperatura poderia abrandar a resposta apoptótica e a resposta de recuperação após a remoção do estímulo por apoptose.
  5. Use um dispositivo de umidade ou colocar uma película transparente (ver Materiais) na placa de cultura para reduzir a perda de água por evaporação a partir do meio.
    Nota: a folha poderia interromper a polaridade da luz para microscopia DIC. Restaurar polaridade ajustando o polarizador no caminho da luz.
  6. Manter o pH nameio de cultura de células (pH 6,8 -7,3) por incubação em 5% de CO 2 com uma câmara de controlo do ambiente no microscópio.
    Nota: A manutenção do pH no meio de cultura pode também ser alcançada através da adição de tampão HEPES, ou por meio de CO 2 usando -independente comercial (ver Materiais). As condições óptimas podem variar, dependendo do tipo de célula.
  7. Minimizar fluorescência / laser (excitação intensidade da luz) a exposição a células durante o processo de imagem para evitar fototoxicidade, reduzindo a intensidade de fluorescência para o mais baixo necessário para obter imagens de alta qualidade de células / estruturas subcelulares ou biossensores expressas (detalhes no protocolo nº 4).

4. Estratégias para a detecção e seguimento Anastasis durante e após apoptóticos Eventos

  1. Blebbing Plasma membrana, condensação citoplasmática, o encolhimento celular e formação de corpos apoptóticos (Veja Figuras 1A - C, E).
    1. Execute time-lapse dife de células vivasrential contraste de interferência (DIC) ou microscopia de contraste de fase para acompanhar um grupo de células de saúde e observar sua morfologia celular (Veja Protocol 3 para microscopia de células vivas, e veja a discussão).
      Nota 1: Reduzir a intensidade da fonte de luz para a imagem latente contrato DIC / fase para evitar a fototoxicidade para as células.
      Nota 2: Se DIC e microscopia de contraste de fase não estão disponíveis, use CellTracker manchar o citosol para delinear a morfologia de células vivas para microscopia confocal ou epi-fluorescência e monitorar a morfologia celular.
    2. Aplicar estímulo para desencadear a morte celular de células que sofrem apoptose (Ver Protocolo 2 para a aplicação e remoção de estímulos apoptóticos).
    3. Observar as células tratadas por características morfológicas de apoptose, tais como formação de bolhas de membrana plasmática, condensação citoplasmática, encolhimento celular e formação de corpos apoptóticos (Figuras 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Lave estímulos morte, e as células re-abastecimento por meio fresco quando as células displacaracterísticas morfológicas y da apoptose.
      Nota 1: Aplicar estímulo da morte celular ou de mudar o meio de cultura celular na fase de microscópio durante lapso de tempo de imagem de células vivas pode ser conseguido através da utilização de uma câmara de cultura de células de perfusão, ou pode ser realizada directamente sobre o prato de cultura de células por pipetagem cuidadosa sem tocar o prato, durante os intervalos entre as imagens.
      Nota 2: sistemas de compensação de desvio de focagem para evitar uso fora de foco das células, devido à perda de termo-equilíbrio do sistema de microscópio após a mudança do meio de cultura de células (ver discussão).
    5. Contínua imagiologia lapso de tempo para rastrear o destino das células que exibem marcas de apoptose. As células que revertem a apoptose pode reparar danos e recuperar o normal morfologia plana (Figuras 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Fragmentação mitocondrial, o DNA / condensação da cromatina, ea fragmentação nuclear (Ver Figuras 1D, 1F, 1G).
    1. Para visualizar mitochondria, células mancha com 50 nM MitoTracker corante fluorescente verde-vermelho / vermelho escuro /, e simultaneamente manchar o núcleo com 10 ug / ml de Hoechst 33342 corante nuclear azul em meio de cultura durante 20 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
      Nota 1: Reduzir a concentração de corantes e duração da incubação para evitar a toxicidade e reduzir a fluorescência de fundo, quando necessário. Optimizar as condições de coloração para obter uma boa relação sinal-ruído com a quantidade mínima de corante e tempo de incubação para a coloração.
      Nota 2: Use as manchas fluorescentes para as mitocôndrias como MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, ou MitoTracker Verde FM, que não vaza para fora da mitocôndria durante a apoptose. Isto permite a visualização da morfologia mitocondrial durante a apoptose e anastasis. Veja os materiais e equipamentos para a tabela detalhes sobre essas manchas.
    2. Mantenha as células coradas no escuro para evitar a fotodegradação.
    3. Remover o excesso de corante por lavagem das células3 vezes com 37 ° C, solução salina tampão fosfato (PBS) ou solução de meio de cultura celular fresco, com 1 min de incubação em meio fresco entre cada lavagem, e, em seguida, ainda mais em incubar o meio fresco durante 20 min antes da lavagem final para permitir excessiva manchas a sair das células para reduzir o sinal de fundo não específico para imagiologia.
      Nota: Reduza os tempos de incubação com meio celular após coloração pode resultar em alta fundo para imagens.
    4. Realize em tempo real confocal de células vivas ou microscopia de epi-fluorescência para as células saudáveis ​​da imagem antes da indução de apoptose é aplicada (Veja Protocol 3 para microscopia de células vivas).
      Nota: As células saudáveis ​​exibir mitocôndrias tubulares e núcleos redondos, na maioria dos tipos de células (Figuras 1D, 1F, 1G).
    5. Desencadear células a sofrer apoptose (ver Protocolo 2 para a aplicação e remoção de estímulos apoptóticos para as células).
    6. Continue time-lapse microscopia de células vivas para observar alterações na morpholog mitocondrial e nuclearies imediatamente após o estímulo é aplicado a morte das células. Observar as células para exibir marcas de apoptose, tais como a fragmentação mitocondrial e inchaço, condensação de cromatina e fragmentação nuclear, em contraste com as células saudáveis ​​que exibem mitocôndrias e núcleos tubulares redondos.
    7. Quando as células exibir marcas de apoptose, lavar e fornecer células com meio fresco, e continuar a imagiologia de lapso de tempo para rastrear o destino das células. As células que revertem apoptose recuperar mitocondrial normal e morfologia nuclear (Figuras 1D, 1F, 1G).
      Nota: Executar microscopia DIC em paralelo quando possível obter informação adicional para o acesso as fases de apoptose por meio da observação das alterações da morfologia celular no mesmo grupo de células (Ver 4.1 Protocolo para a microscopia DIC).
  3. Detecção de liberação mitocondrial do citocromo c, utilizando células que expressam estavelmente um -GFP fusão citocromo c protein (Ver Figura 2).
    1. Mancha células expressando estavelmente citocromo c -GFP 23,24 com MitoTracker Red rotular mitocôndrias de células polarizadas (Veja Passos 4.2.1 a 4.2.3 para mitocôndrias coloração de células vivas).
    2. Execute microscopia confocal de células vivas ou epi-fluorescência em tempo real para rastrear células saudáveis ​​(Detalhes no Protocolo n.º 3 para imagens de células vivas).
      Nota: O sinal -GFP citocromo c localiza principalmente nas mitocôndrias das células saudáveis ​​(Figuras 2A i, 2B).
    3. Desencadear células a sofrer apoptose (ver Protocolo 2 para a aplicação e remoção de estímulos apoptóticos para as células). Continuar microscopia de lapso de tempo para observar a translocação de citocromo c -GFP de mitocôndrias para o citosol (Figuras 2Aii-iii, 2B).
      Nota: libertação mitocondrial de citocromo c para o citosol é um marcador mitocondrial de permeabilização da membrana exterior (MOMP)4, um passo crítico no dependente da mitocôndria apoptose 21,22
    4. Quando as células exibir o sinal -GFP citocromo c no citoplasma, remover o estímulo da morte celular, e fornecimento de células com meio fresco (Ver Protocolo 2). Continue imagem time-lapse para acompanhar o destino de células com GFP cytosolic.
      Nota: As células que revertem apoptose recuperar a morfologia celular normal, e reduzir o seu sinal -GFP citocromo c cytosolic presumivelmente através de degradação ou translocação de volta para a mitocôndria (Figuras 2Aiv-vii, 2B).
    5. Capturar imagens DIC em paralelo para obter informações adicionais para acessar os estágios de apoptose pela observação de alterações na morfologia celular em células individuais ou grupo de células (Ver Protocolo 4.1 para microscopia DIC).
  4. Detecção da actividade de caspase utilizando um biossensor caspase (Ver Figura 3)
    1. Células transfecção com a caspase biossensores NES-DEVD-YFP-NLS para16 a 24 horas antes de submetê-los a um estímulo de apoptose 13.
    2. Manchar as culturas transfectadas com Hoechst 33342 para rotular núcleos celulares (Veja Passos 4.2.1 a 4.2.3 para a coloração de células vivas nuclear).
    3. Execute microscopia confocal de células vivas ou epi-fluorescência em tempo real para rastrear células saudáveis ​​(Detalhes no Protocolo n.º 3 para imagens de células vivas).
      Nota: O sinal de biossensor NES-DEVD-YFP-NLS localiza principalmente no citosol de células saudáveis, devido ao seu sinal de exportação nuclear (NES) (Figuras 3A, 3C e 3Bi, ver Discussão).
    4. Desencadear células a sofrer apoptose (ver Protocolo 2 para a aplicação e remoção de estímulos apoptóticos para as células). Continue microscopia de lapso de tempo para observar a translocação nuclear de YFP.
      Nota: A activação de caspases cliva o motivo DEVD na caspase biossensores NES-DEVD-YFP-NLS, resultando em YFP-NLS translocação desde o citosol para o núcleo (Figuras 3A, 3Bii-iv, ver Discussão).
    5. Quando as células exibir YFP nuclear, remova o estímulo por apoptose, e as células de abastecimento por meio fresco (Veja Protocolo 2).
      Nota: As células que invertem a apoptose recuperar a morfologia celular normal, mas reter o sinal YFP nuclear (Figuras 3 BV-x, células 1 e 2, e 3D).
    6. Continue imagem time-lapse para rastrear o destino das células que exibem YFP nuclear.
      Nota: O sinal YFP nuclear se tornará degradadas várias horas depois que as células se inverteram apoptose (Figuras 3B, vi-x, Cell 1, Veja Resultados e Discussão) presumivelmente através dos mecanismos normais de apuramento de células, como a degradação do proteassoma.
    7. Capturar imagens DIC em paralelo para obter informação adicional para o acesso as fases de apoptose por observação de alterações na morfologia celular em células individuais ou um grupo de células. (Veja Protocol 4.1 para microscopia DIC).
  5. Exposição de superfície celular de fosfatidilserina (Ver Figura 4)
    1. Semear as células em glass lamelas para atingir 80% de confluência celular (Ver Protocolo 1).
    2. Co-manchar as células com MitoTracker vermelho fluorescente e azul Hoechst 33342 mancha para mitocôndrias e núcleos, respectivamente (ver Passos 4.2.1 a 4.2.3 para mitocondrial de células vivas e coloração nuclear).
    3. Acionar células a apoptose por meio de um indutor de apoptose (Veja Protocolo 2).
    4. Aplicar fluorescente marcado com anexina V (ver Materiais) para corar as células apoptóticas 10 min a 37 ° C antes da remoção do indutor de apoptose para detectar a exposição de fosfatidilserina sobre a superfície de células apoptóticas.
      Nota 1: saudável células não são coradas com anexina V a fosfatidilserina porque normalmente é sequestrado no-folheto interno da membrana plasmática da célula 38. As células apoptóticas são coradas com anexina V, que se liga a fosfatidilserina na superfície celular (Figuras 4A e 4B).
      Nota 2: fluorescente marcado com anexina V, também pode ser aplicado para corar as células apoptóticas immediately após a remoção do indutor de apoptose, com 10 minutos de incubação.
    5. Remover estímulo da morte celular, lavar as células marcadas com PBS quente ou meio fresco uma vez, e, em seguida, fornecer células com meio fresco durante 2 horas a 37 ° C com 5% de CO 2 (Ver Protocolo 2).
      Nota 1: As células que reverteram a apoptose recuperar a morfologia normal e reter sinal V anexina marcado por fluorescência depois de recuperar a morfologia normal (Figuras 4A e 4B).
      Nota 2: O sinal de anexina V diminui com o tempo em células recuperadas (ver discussão).
    6. Fix células em pontos de tempo seleccionados com paraformaldeído a 4% contendo 8% de sacarose em 1x PBS durante 20 min no escuro à temperatura ambiente, e lava-se as células fixadas, com PBS por 3 vezes para remover células paraformaldeído antes da montagem sobre lâminas de vidro com lamelas de montagem antifade (Veja Materiais) para microscopia confocal ou epi-fluorescência e observar anexina V em células após a remoção da apoptose indutor.
      Nota 1: A sacarose em fixador preserva estrutura da membrana celular durante a fixação.
      Nota 2: Guardar a solução de paraformaldeído em escuro a 4 ° C para evitar a degradação.
      Nota 3: Aquece-se a solução de paraformaldeído a temperatura ambiente antes de ser aplicada a células de fixação para evitar um choque frio para as células.

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Resultados

Para estudar a reversão da apoptose, células de cultura de tecido são primeiro expostos a um estímulo de morte para desencadear a apoptose. Quando as células apresentam marcas de apoptose, o meio de cultura fresco é então aplicada para lavar o estímulo e em seguida incubar as células moribundas para permitir a recuperação (Figura 1A). Aqui, a questão-chave a ser abordado é o quão longe morrendo células cultivadas individuais podem progredir para apoptose e ainda sofrer anastasis. Esta questão pode ser d...

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Discussão

Anastasis se refere ao fenômeno em que as células que tenham activado via de morte celular reverter posteriormente o processo de morrer e sobreviver. Aqui, nós demonstramos que imagens de células vivas podem ser usados ​​para confirmar que as mesmas células individuais de fato pode reverter processo de morte celular por apoptose numa fase tardia, e, em seguida, continuar a sobreviver e reproduzir. Os nossos protocolos descrever várias condições de tratamento específicas do tipo de células optimizado para induzir apoptos...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz por sugerir a palavra "anastasis" para descrever a reversão da apoptose; Douglas R. Green para as células HeLa que expressam estavelmente o citocromo c -GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner para H446 células; Lamb Heather de assistência em desenho dos desenhos animados para o vídeo; Yee Hui Yeo para valiosa discussão deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), a Bolsa de Estudos Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), bolsa Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Foundation Research fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH) e Universidade Comitê Grants do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação Life Sciences Research.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscopia confocal LSM780Carl Zeiss
Prato de cultura com fundo de vidroMatTek CorporationP35G-0-14-C
Transparente CultFoiCarl Zeiss000000-1116-084
CO2 meio independenteLife Technologies18045-088
CellTrackerLife TechnologiesC34552
Mitotracker Red CMXRosLife TechnologiesM-7512
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399
Anexina V marcada com fluorescência BiovisionK201

Referências

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