Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem a partir do sangue periférico usando uma estratégia de reprogramação episome base e inibidores da histona deacetilase.

Resumo

Este manuscrito ilustra um protocolo para a criação de células de forma eficiente sem integração humana induzida tronco pluripotentes (iPSCs) do sangue periférico, utilizando plasmídeos epissómicos e inibidores da histona deacetilase (HDAC). As vantagens desta abordagem incluem: (1) o uso de uma quantidade mínima de sangue periférico como fonte de materiais; (2) nonintegrating vetores de reprogramação; (3) um método de custo eficaz para gerar vetores iPSCs livres; (4) uma única transfecção; e (5) a utilização de moléculas pequenas para facilitar a reprogramação epigenética. Resumidamente, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são isoladas a partir de amostras de flebotomia de rotina e, em seguida, cultivadas em factores de crescimento definidos para se obter uma população de células progenitoras de eritrócitos altamente proliferativo que é extremamente passíveis de reprogramação. Nonintegrating, plasmídeos epissómicos não transmissíveis expressando OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, e uma p53 short hairpin (sh) RNA são introduced nos eritroblastos derivados através de um único nucleofection. A cotransfecção de um epissoma que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP) permite a fácil identificação de células transfectadas. Um plasmídeo deficiente na replicação separada expressando de Epstein-Barr antigénio nuclear 1 (EBNA 1), também é adicionado à mistura de reacção para aumento da expressão de proteínas epissomais. As células transfectadas são então plaqueadas sobre uma camada de fibroblastos embrionários de ratinho irradiado (iMEFs) para a reprogramação continua. Assim que colónias-iPSC como aparece a cerca de 12 dias após nucleofection, os inibidores de HDAC são adicionados ao meio para facilitar a remodelação epigenética. Descobrimos que a inclusão de inibidores de HDAC rotineiramente aumenta a geração de colónias de IPSC totalmente reprogramado por 2 vezes. Uma vez colônias IPSC exibem morfologia típica de células-tronco embrionárias humanas (hESC), eles são cuidadosamente transferida para IMEF revestidas de placas individuais de cultura de tecidos para o crescimento contínuo e expansão.

Introdução

iPSCs são derivados a partir de tecidos somáticos via expressão ectópica de um conjunto mínimo de genes de pluripotência. Esta técnica foi inicialmente demonstrado por transdução retroviral de fibroblastos humanos com OCT4, SOX2, KLF4, e cMyc, que são altamente expressos no estado pluripotente ^1. Estes transitoriamente expressas "fatores de reprogramação epigenética" alterar perfil de expressão de paisagem e gene da célula-alvo análogo ao de células-tronco embrionárias humanas ^2. Uma vez criado, iPSCs podem potencialmente ser diferenciadas em qualquer tipo de tecido para posterior investigação. Assim, eles representam uma promessa para o uso em medicina regenerativa, doença de modelagem, e aplicações de terapia génica. No entanto, interrompendo o genoma do vírus com integrando tem o potencial de alterar a expressão do gene endógeno, influencia o fenótipo celular e, finalmente, viés resultados científicos. Além disso, as integrações aleatórias virais pode levar a deletéria e celularffects, incluindo a possibilidade de transformação maligna ³ ou re-expressão dos transgenes oncogénicos ^4. Aplicações clínicas futuras exigirá geração iPSC não-integrantes.

Epissomas, que são moléculas de DNA circular cromossômicas extra, oferecem uma estratégia para gerar custo efetivo, iPSCs livre de integração ^5. A combinação dos vectores epissomais mostrados na Tabela 1 Factores de expressar a reprogramação OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, e LIN28A. O plasmídeo pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F também contém uma p53 shRNA para a supressão temporária de TP53 para melhorar a reprogramação celular ^6. A replicação deficiente vetor pCXWB-EBNA1 promove amplificação de fatores de reprogramação e aumento da eficiência de reprogramação, proporcionando um aumento transitório na expressão EBNA1 ^7. O plasmídeo pCXLE_EGFP pode ser adicionado à mistura nucleofection com a finalidade de determining a eficiência de transfecção ou para aplicações de separação de células. Com a excepção de p-CXWB EBNA1, os plasmídeos epissomais utilizados neste protocolo contêm a origem do vírus de Epstein-Barr de replicação viral e o gene de EBNA 1, que medeiam a replicação e partição do epissoma durante a divisão da célula hospedeira ^8. Os epissomas são espontaneamente perdido com expansão sucessiva iPSC ^7. A subclonagem e caracterização de iPSCs com perda vector epissomal, que pode ser inferida a partir da perda de expressão eGFP, pode conduzir a integração iPSCs completamente livres para aplicações clínicas futuras.

Inerente ao processo de geração iPSC é a supressão de genes específicos de linhagem e reactivação de genes associados à pluripotência. Regulação da expressão gênica ocorre em vários níveis dentro do núcleo, incluindo a modificação de DNA e da cromatina para permitir que fatores de transcrição, elementos de DNA reguladoras e acesso RNA polimerase ao alvogenes. A remodelação da paisagem epigenética através de modificações da cromatina globais é um componente chave para a re-expressão do programa genético pluripotência. Uma modificação da cromatina específico que é importante na regulação da expressão génica é a acetilação das histonas em determinados resíduos de lisina, que permite o acesso aos genes-alvo através da diminuição da tensão da bobina de histona-ADN. Inibidores de HDAC são pequenas moléculas que têm sido mostrados para melhorar iPSC reprogramação e hESC auto-renovação ^9,10, provavelmente devido ao apoio do Estado acetilada ^11. O protocolo descrito abaixo, adaptado a partir de uma publicação anterior, utilizando os lentivírus integrando ^12, proporciona um método passo-a-passo para a geração de iPSC optimizado a partir de sangue periférico utilizando epissomas e inibidores de HDAC. As concentrações de inibidor de HDAC aqui utilizados são metade daqueles descritos por Ware et al. ^9, e foram rotineiramente levou a um aumento de 2 vezes na colónias IPSC completamente reprogramadas padrão maisprotocolos de reprogramação epissómicos sem inibidores de HDAC. Este nível de reprogramação está a par com a eficiência que observamos com os métodos de lentivírus. Usando este protocolo, temos gerado de forma eficiente iPSC de indivíduos como velhos como 87 anos de idade.

Protocolo

Consentimento informado, aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional da Cancer Research Center Fred Hutchinson e as crianças "s Hospital of Philadelphia, foi obtido de pacientes antes de coletar amostras de sangue periférico. Foram observadas Todas as diretrizes institucionais. Todos os experimentos com animais, incluindo geração e MEF formação de teratomas foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional.

1. Ficoll separação de PBMC e Expansão da Erythroblasts - Dia 0

1. Dilui-se sangue periférico de 1: 1 com Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS). Em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 15 ml, a camada cuidadosamente 7 ml de sangue diluído em 3 mL de temperatura ambiente Ficoll-Hypaque.
2. Centrifuga-se a amostra a 400 xg durante 30 min.
3. As PBMC irão ter resolvido para a interface entre o plasma e o Ficoll-Hypaque, visto como uma camada branca turva. Usando uma pipeta estéril, recolher o PBMCs em um tubo de 15 ml. Levar o volume até 10 ml, utilizando DPBS.
4. Usando um hemocitômetro, contar as PBMC.
5. Pipeta de 2 x 10 ⁶ PBMC em um tubo de 15 ml separado e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Girar as restantes células e congelamento a uma concentração de 2 x 10 ⁶ PBMC / ml em 90% de soro fetal bovino (FBS) a sulfóxido / 10% de dimetilo (DMSO).
6. Prepare meio de expansão: meio isento de soro QBSF-60 (protegido da luz) + penicilina / estreptomicina (1%) + ácido ascórbico (50 ng / ml) + factor de células estaminais (SCF, 50 ng / ml) + a interleucina 3 (IL 3, 10 ng / ml) + eritropoietina (EPO, 2 U / ml) + insulin-like growth factor 1 (IGF-1, 40 ng / mL) + dexametasona (1 uM; proteger da luz; descongelar uma alíquota fresca cada um dos meios alterações).
7. Ressuspender 2 × 10 ⁶ PBMC em 2 ml de meio de expansão acabado de fazer e colocar em um poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços e incubar numa incubadora a 37 ° C humidificado com uma atmosfera de 5% De O _2, 5% de CO _2, e 90% de _N2.
8. No dia 3 eo dia 6, substituir a mídia.
   1. Recolher as células e lava-se a bem com 2 ml de QBSF-60 para recolher quaisquer células restantes.
   2. Centrifuga-se a suspensão de células a 300 xg durante 5 min e aspirar o sobrenadante.
   3. Ressuspender as células em 2 ml de meio de expansão e nova devolvê-las para a mesma placa de 12 poços.

2. reprogramar células por Nucleofection - Dia 9

1. Pipetar os plasmídeos de reprogramação para um tubo de 1,5 ml estéril Eppendorf (Tabela 1).
2. Misture a solução nucleofection com suplemento (fornecido pelo fabricante) e pipeta em um estéril de 1,5 ml tubo Eppendorf.
3. Pipetar 2 ml de meio de expansão em um poço de uma placa de 12 bem e coloque numa atmosfera humidificada de 37 ° C incubadora (5% _{de O2,} 5% de CO _2, e 90% de _N2) por razões de equilíbrio antes da adição de células.
4. Recolher océlulas de cultura e lavar o poço com 2 ml de QBSF-60 para recolher as células restantes.
5. Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min e aspirar o sobrenadante.
6. Lavam-se as células por ressuspensão em 5 mL de DPBS e centrifugar a 300 xg durante 5 min.
7. Aspirar o sobrenadante.
8. Ressuspender o pellet celular em 100 ml de solução nucleofection + Suplemento, tendo o cuidado de evitar a geração de bolhas.
9. Pipeta a suspensão de células para dentro do tubo contendo os plasmídeos de reprogramação, pipeta-se para baixo e, uma vez, e pipetar a amostra para o fundo da cubeta nucleofection.
10. Coloque a cuvete na máquina nucleofection e executar Programa de T-019.
11. Transferir 100 ul da expansão pré-aquecido médio (a partir da placa de equilíbrio no Passo 2.3) na cuvete nucleofection.
12. Recolher imediatamente a totalidade da amostra e depósito para o poço de pré-aquecido médio Expansão. Evite recolher o, flutuando restos de células mortas branco.
13. Colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C incubadora (5% _{de O2,} 5% de CO _2, e 90% N ₂₎ para o crescimento.

3. chapeamento células alimentadoras - Dia 10 ou 11

1. No dia 10, as células da placa de alimentação.
   1. Brasão uma placa de 6 poços de cultura de tecidos com gelatina.
      1. Pipeta de 1 m de gelatina a 0,1% em Solução Salina Tamponada de Hank (HBSS) para cada poço da placa.
      2. Colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C incubadora durante pelo menos 5 min.
      3. Imediatamente antes da utilização, aspirar a solução de gelatina a partir da placa.
   2. Descongelar um frasco de 2 x 10 ^{6 de} fibroblastos de rato embrionários irradiadas a 3000 cGy em 10 ml de pré-aquecido MEF Meios (Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + penicilina / estreptomicina (1%)).
   3. Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 12 ml de MEF Mídia e pipeta de 2 ml into de cada poço revestido com gelatina a placa de 6 poços. Colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C incubadora (5% _{de O2,} 5% de CO _2, e 90% N ₂₎ até o dia 12.

4. cultivo de células em células alimentadoras e Alterando Médio - Dia 12

1. Coletar as células nucleofected em um tubo de 15 ml e recolher todas as células restantes lavando as bem com 2 ml de QBSF-60. Centrifuga-se a amostra a 300 xg durante 5 min.
2. Prepare reprogramação Meio: Iscove Modificado por Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + não animal de L-glutamina (1 mM) + ácidos aminados não essenciais (NEAA, 1%) + penicilina / estreptomicina (1%) + β -mercaptoetanol (0,1 mM) + factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, adicionado na alimentação fresca, 10 ng / ml) + ácido ascórbico (adicionado fresco na alimentação, 50 ug / ml).
3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 12 ml de Meio A reprogramação. Pipeta de 2 ml por cavidade da suspensão de células ema placa de 6 poços de células alimentadoras (como foi preparada na secção 3). Centrifugar a placa a 50 xg durante 30 min à temperatura ambiente.
4. Colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C incubadora (5% _{de O2,} 5% de CO _2, e 90% N ₂₎ para o crescimento. Altere a Reprogramação Médio em dias alternados até colônias IPSC começam a aparecer (1-2 semanas).
5. Preparar células estaminais embrionárias humanas Meio: DMEM / F12 1: 1 + KO substituição Serum (20%) + penicilina / estreptomicina (1%) + NEAA (1%) + não animal de L-glutamina (1 mM) + piruvato de sódio (1%) + bicarbonato de sódio (0,12%) + β-mercaptoetanol (0,1 mM) + bFGF (adicionado fresco na alimentação, 10 ng / ml)
6. Prepare inibidores de HDAC: butirato de sódio (adicionado fresco em alimentação, 100 M), ácido suberanilohidrox�ico (SAHA, acrescentou fresco na alimentação, 200 nM). Uma vez colônias IPSC aparecer, começam a alimentar as células com inibidores de células estaminais embrionárias humanas Médio + HDAC, mudando médio a cada dia.
   NOTA: o butirato de sódio é uma pequena molécula que é adsorvido para os tubos de plástico, tor conseguinte armazená-lo em um tubo de vidro de borosilicato, a 4 ° C.

5. Clones Isolando IPSC

1. Uma vez colônias IPSC são grandes o suficiente para ser isolado (20-25 células), buscá-las com uma pipeta P20.
2. Preparar os inibidores de HDAC: butirato de sódio (adicionado fresco a alimentação, 100 uM), SAHA (adicionado fresco a alimentação, 200 nM)
3. Coloque as colônias isoladas para iMEFs em pratos individuais mm 35 contendo inibidores de HDAC hESC Médio + + Clonagem & Recovery suplemento.
4. O dia após a colheita das colônias, mudar o meio de inibidores de células estaminais embrionárias humanas Médio + HDAC.
5. Mudar o meio todos os dias até as colónias IPSC estão prontos para passaging.
6. Retirar os inibidores de HDAC do meio uma vez colônias estabilizar em passagem 2-3.

Resultados

Três dias após nucleofection e antes do plaqueamento das células em nucleofected iMEFs, a eficiência de nucleofection bem sucedida deve ser estimado por microscopia de fluorescência para eGFP. A Figura 1 mostra uma experiência típica nucleofection com aproximadamente 5-10% da população total de células que expressam eGFP.

Colónias IPSC reprogramado vão começar a aparecer cerca de duas semanas após nucleofection. As colônias são geralmente circular, com bordas bem definidas e...

Discussão

Para a geração de iPSC bem sucedido ao usar este protocolo, existem várias advertências importantes que devem ser considerados. Durante a fase de expansão de eritroblastos, o cronograma de mudança de mídia devem ser rigorosamente seguidas, como desvios podem levar à estimulação ineficiente da população de células progenitoras alvo e uma menor eficiência de geração da IPSC. É importante fazer novo meio de expansão com dexametasona fresco com cada mudança de meios de comunicação; e o meio de base QBSF-60 e dexametasona de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Armazene a 4 ° C. Aqueça à temperatura ambiente antes de usar.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Loja em 4 ° C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Loja em 4 °C.
soro fetal bovino (FBS)	Life Technologies	10437028	Armazenar a -20 &graus; C até que seja necessário. Descongelar, alíquota, armazenar a 4 ° C.
dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Armazenar em temperatura ambiente.
QBSF-60 meio sem soro	Fisher Scientific	50-983-234	Loja em 4 ° C.
penicilina/estreptomicina	Life Technologies	15140122	Store a 4 °C.
Kit de nucleofector de linha celular V	Lonza	VCA-1003	Armazenar a 4 °C.
Solução de gelatina a 2%	Sigma-Aldrich	G1393	Armazenar a 4 ° C, liquefazer em 37 &graus; C banho-maria antes de usar.
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Loja em 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Loja em 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Loja em 4 °C.
L-glutamina, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Alíquota, congelar a -20 ° C.
aminoácidos não essenciais (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Armazene em 4 ° C, longe da luz.
DMEM / Ham's F12, 1: 1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store a 4 ° C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Alíquota, congelar a -20 °C.
piruvato de sódio, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Armazenar a 4 ° C.
bicarbonato de sódio, 7,5%	Life Technologies	25080094	Store a 4 ° C.
fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Fazer estoque de 10 mg/ml em DPBS, alíquota, congelar a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.
butirato de sódio	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Faça 2000x estoque (400 mM) em DPBS, alíquota, congele a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.
Clonagem de células hES e Suplemento de Recuperação	Stemgent	01-0014-500	Armazene a -20 ° C até que seja necessário. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.
Matriz BD qualificada pela ESC	BD Biosciences	35-4277	Descongele durante a noite no gelo às 4 > C, alíquota em tubos pré-resfriados usando pontas de pipeta pré-resfriadas. Armazene a -20 > C até que seja necessário. Descongele aos 4 graus; C, use imediatamente.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Alíquota, congelar a -20 ° C.
ácido ascórbico, em pó	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Faça 5 mg / ml de estoque em DPBS, filtro estéril, armazene a 4 ° C.
fator de células-tronco humanas recombinante (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μ g / m estoque em SFEM, alíquota, congelamento a -20 ° C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.
interleucina humana recombinante 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Faça 100 μ g/ml de estoque em SFEM, alíquota, congelar a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.
eritropoietina (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Faça 1000 U/ml de estoque em SFEM, alíquota, congele a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.
fator de crescimento semelhante à insulina humana recombinante 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μ g/ml de estoque em SFEM, alíquota, congelar a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M7522	Faça estoque de 1000x (100 mM) em DPBS.
dexametasona	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Faça 50x estoque (50 μ M) em DPBS, filtro estéril, armazenar a 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Faça 2.000x estoque (400 mM) em DPBS, alíquota, congele a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.
Placa de cultura de tecidos de 12 poços	Fisher Scientific	08-772-29
Tubo cônico de 15 ml	Sarstedt	62553002
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Placa de cultura de tecidos de 6 poços	Fisher Scientific	08-772-1B
Placas de cultura de tecido de 35 mm	BD Biosciences	353001
Pipetas sorológicas descartáveis de 10 ml	Fisher Scientific	13-675-20
Pipetas sorológicas descartáveis de 5 ml	Fisher Scientific	13-675-22
Pipetas sorológicas descartáveis de 2 ml	Fisher Scientific	13-675-17
20 μ l pontas de pipeta, pontas de barreira	Genessee	24-404
pipetas de vidro Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
auxiliar de pipeta	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624