Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

Resumo

Aqui descrevemos um ensaio biológico robusto para quantificar a taxa relativa de proteólise pelo sistema ubiquitina-proteassoma. A leitura do ensaio é a taxa de crescimento da levedura em cultura líquida, que depende dos níveis celulares de uma proteína repórter que compreende um sinal de degradação fundido a um marcador metabólico essencial.

Resumo

A degradação das proteínas pelo sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) é um importante mecanismo de regulação para a homeostase da proteína em todos os eucariotas. A abordagem padrão para determinar a degradação da proteína intracelular se baseia em ensaios bioquímicos para seguir a cinética de declínio proteína. Tais métodos são frequentemente trabalhoso e demorado e, portanto, não passível de experiências destinadas a avaliar múltiplos substratos e as condições de degradação. Como alternativa, ensaios baseados em células de crescimento têm sido desenvolvidos, que são, no seu formato convencional, ensaios de ponto final, que não é possível determinar quantitativamente as mudanças relativas nos níveis de proteína.

Aqui, descrevemos um método que determina fielmente as alterações nas taxas de degradação de proteínas por acoplamento los a uma cinética de crescimento de levedura célula. O método é baseado em um sistema de seleção estabelecido em uracila Auxotrofia de URA3 -deleted células de levedura é resgatado por uma proteína repórter exogenamente expressa, Composta de uma fusão entre o gene URA3 essencial e determinante degradação (degron). A proteína repórter é concebido de modo a que a sua taxa de síntese é constante enquanto que a sua taxa de degradação é determinada pela degron. Como o crescimento celular em meio deficiente em uracilo-é proporcional aos níveis relativos de Ura3, cinética de crescimento são inteiramente dependentes da degradação da proteína repórter.

Este método mede com precisão mudanças na cinética de degradação de proteínas intracelulares. Aplicou-se a: (a) Avaliação da contribuição relativa dos factores de conjugação de ubiquitina conhecidos à proteólise (b) E2 enzima de conjugação de estrutura-função de análises (c) Identificação e caracterização de novos degrons. A aplicação do sistema baseado URA3 degron- transcende o campo de degradação de proteínas, como pode também ser adaptada para a monitorização das alterações dos níveis de proteína associados com as funções de outras vias celulares.

Introdução

O sistema de degradação da ubiquitina-proteassoma é um importante regulador da máquina, que tem sido implicado na manutenção da homeostase da proteína em todos os eucariotas. A UPS inicialmente conjuga múltiplas moléculas de ubiquitina a uma proteína-alvo, após o que a proteína poli-ubiquitina-marcado é degradado pelo proteassoma 26S. Na maioria dos casos, o passo limitante da velocidade para a degradação mediada por ubiquitina é ubiquitinação substrato, mediada por E2 e E3 conjugar enzimas ligando enzimas (ligases E3) ^1. Por conseguinte, a estabilidade intracelular de proteínas específicas reflecte a sua susceptibilidade a ubiquitina-conjugação e a actividade das suas enzimas cognatas ubiquitinação.

E3 ligases são os componentes de reconhecimento de substrato principais da UPS. Como tal, estas enzimas reconhecem degrons dentro de seus substratos que estão ausentes ou não expostos em suas contrapartes estáveis ^​​2. Por exemplo, muitos reguladores do ciclo celular must ser sintetizado e degradado de uma forma temporal específica, a fim de manter a progressão do ciclo celular em ordem. A degradação destas proteínas é muitas vezes controlada pela fosforilação, mediadas por quinases de sinalização celulares regulados ^3,4. Por outro lado, as proteínas anormalmente dobradas são reconhecidos através degrons enigmáticas. Estas são as regiões que normalmente são escondidos na estrutura nativa e estão expostos em cima estrutura perturbação. Tais degrons incluem domínios hidrófobos e segmentos de ^5-7 intrinsecamente desordenados ^8.

Desde a descoberta seminal do sistema ubiquitina-proteína para degradação e a caracterização dos seus fundamentos em lisados ​​de reticulócitos de ^9, genética de leveduras foi instrumental na descoberta de muitos dos componentes do sistema ubiquitina ^10. O sucesso da levedura como organismo modelo para a análise sistemática da degradação das proteínas pelo UPS é principalmente devido ao fato de que o UPS é altaly conservada em todos os eucariontes ^4, juntamente com a sua receptividade como um sistema experimental. De facto, os sistemas à base de levedura são vulgarmente utilizados para decifrar os mecanismos de acção da máquina ubiquitinação.

Estudando a degradação da proteína por meios bioquímicos normalmente requer uma preparação de extractos celulares. Enquanto proteínas da célula animal pode ser extraída sob condições relativamente suaves que preservem as interacções e função de proteínas, a presença de uma parede celular de levedura ¹¹ robusto no requer consideravelmente mais severas condições de perturbação, que podem afectar a recuperação de proteína. De fato, diferentes procedimentos de levedura rompimento celular variam consideravelmente em sua capacidade para recuperar proteínas intactas em quantidades que representem corretamente a sua abundância relativa celular. Além disso imprecisão é inerente aos diferentes métodos empregados para a determinação das taxas de degradação de proteínas específicas: experimentos metabólicos à base de rotulagem 'pulse-chase' seguido de immunoprecipitation, para isolar proteínas específicas ^12, muitas vezes não é estritamente quantitativa. Assim, quando a degradação da proteína é comparada por este método, cuidado extra deve ser tomado na interpretação dos resultados. Para contornar este inconveniente, um ensaio perseguição cicloheximida alternativa (CHX) podem ser empregados ^12. Neste ensaio, o inibidor da tradução é adicionado a culturas de células e alterações temporais nos níveis em estado estacionário da proteína são subsequentemente monitorizados. No entanto, o uso de CHX está limitado às proteínas com semi-vidas relativamente curtas (<90 min), como a inibição de longa duração da síntese de proteínas é citotóxica. Notavelmente, ambos os ensaios mencionados acima requerem a utilização de anticorpos específicos para a proteína, o que nem sempre estão disponíveis.

Para superar estas limitações técnicas, os investigadores têm desenvolvido vários métodos que não requerem a extracção de células e proteínas manuseamento directo. Uma abordagem baseia-se no estabelecimento de sim auxotróficoestirpes st, obtidos por deleção dos genes que codificam enzimas metabólicas essenciais. Tais genes incluem HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, que codifica para as enzimas necessárias para a biosíntese de aminoácidos, bem como URA3 que codifica OMP-descarboxilase (Ura3), uma enzima essencial da pirimidina ribonucleótido biossíntese. Ura3 tem sido amplamente utilizado em estudos de degradação de proteínas. Nestes ensaios, a expressão constitutiva de Ura3 resgata o crescimento de células ura3 em meio deficiente em ^uracilo-13. Consequentemente, desestabilizando Ura3 através da fusão de um degron pode diminuir o crescimento das células em meio mínimo sem uracilo. Este método tem sido utilizado em vários estudos de degradação de proteínas, incluindo a identificação dos determinantes da degradação ^{5, 14} e ligases E3 ubiquitinação auxiliar factores ¹⁵ e a descoberta de novos UPS degrons ^16. Todos estes métodos empregues crescimento celular em placas de agar como o ensaio de leitura. No entanto, tele critério de crescimento (crescimento positivo / negativo), enquanto robusto e eficiente, é principalmente qualitativa e não fornece informação quantitativa que é importante para avaliar a potência de um degron ou a contribuição relativa dos diversos fatores de degradação auxiliares.

Temos, portanto, desenvolvidos e utilizados vetores de levedura e métodos de rastreio que permite uma análise sistemática e quantitativa da degradação de proteínas pela URA3 -degron sistema de fusão. O protocolo baseia-se em um ensaio de manusear fácil que mede a cinética do crescimento na cultura líquido sob condições selectivas (gils) e na geração de curvas de crescimento padrão. Cinética de crescimento de levedura são caracterizados por três fases principais - o atraso, o exponencial (log) e da fase estacionária. Cálculo da cinética de replicação de levedura durante a fase log em condições selectivas, que é determinada pelos níveis de expressão do Ura3-degron, fornece uma medição imparcial o quantitativof degradação da proteína. Este método pode ser aplicado para medir e comparar as taxas de degradação de vários substratos UPS simultaneamente em múltiplas linhagens e sob várias condições.

Protocolo

1. Cultura celular

1. Transformar as células de levedura auxotróficos, adequados, tais como Try467 (Tabela 2), com um plasmídeo contendo (a) um URA3 -degron de fusão e (b) um marcador de selecção adicional para metabólica plasmídeo e manutenção.
   NOTA: Um exemplo de um plasmídeo adequado é YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Este é um plasmídeo integrativo de levedura contendo uma proteína de fusão que compreende de Deg1 - degron um derivado da transcrição de levedura. factor de mat2 ^17, epitopo FLAG - para a detecção por imunotransferência, Vma12 - uma proteína ER estável, e Ura3 ^15,18 (Figura 3A). (Ver Tabela 3 para os plasmídeos usados ​​neste estudo e para exemplos adicionais de plasmídeos apropriados.)
2. Para a selecção da manutenção do plasmídeo e, manter as células em placas de agar sintético adequado sob uma Definido (SD) meio sem marcadores de selecção amino ácidos 19 (Por exemplo, Deg1 -UV é selecionada e mantida sob SD-LYS meios seletivos).
3. Cultivar células S / N a 30 ° C num meio SD selectivo adequado para manutenção do plasmídeo, até uma fase estacionária é alcançada. Cresça as células em tubos de ensaio ou em uma placa de 96 cavidades, dependendo do número de amostras a serem examinadas (ponto 2).

2. Preparação de células para análise

1. Quando um pequeno número de amostras (N≤15) está a ser ensaiada, diluir as células e substituir o meio como se segue:
   1. Dilui-se 50 ul de células a partir de uma cultura D / N com 150 ul de meio SD por poço numa placa de 96 poços (fundo claro). Note-se, a primeira amostra é designado como branco contém apenas médio.
   2. Determinar os valores de OD ₆₀₀ amostras na placa de 96 poços utilizando um leitor de microplacas.
   3. Calcula-se a OD efectiva ₆₀₀ em cada poço pela multiplicação da leitura de OD ₆₀₀ pelo factor de diluição (x4), a partir which o valor da leitura do branco é subtraído. Normalizar os valores resultantes dividindo por 0,55 para obter um caminho de comprimento calculado de 1 cm de acordo com a lei de Beer-Lambert. Note-se, este valor é constante quando se mede o OD ₆₀₀ de 200 ul de células em uma placa de 96 poços padrão.
   4. Calcule o volume exato necessário para a obtenção de células de levedura em montante equivalente a _DO600 de 0,25 e transferir para um tubo Eppendorf.
   5. Girar as células a alta velocidade (12.000 xg) durante 1 min.
   6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio selectivo apropriado (ver secção 3.1) para se obter _DO600 de 0,25.
   7. Transferir 200 uL das estirpes diluídos para um novo poço de uma placa de 96 poços.
2. Quando um grande número de amostras (N> 15) estão a ser testados, diluir as células e substituir o meio, sem medição OD ₆₀₀ anterior, como segue:
   1. Transferir 10 ml de células estacionáriascrescida O / N em uma placa de 96 poços para uma nova placa de 96 poços contendo 190 ul (diluição de 1:20) dos meios selectivos apropriados (ver secção 3.1).

3. cinética de crescimento em cultura líquida em condições selectivas (Gils)

1. Use os seguintes meios para medições de crescimento utilizando o repórter Ura3-degron:
   1. Para controles positivos de crescimento da levedura em condições não restritivas, o uso plasmídeo mídia SD seletiva (ver secção 1.2). Se nenhuma selecção plasmídeo é necessária, por exemplo, quando se usa um plasmídeo integrativo, tal como Deg1 -UV, meio SD contendo todos os aminoácidos necessários (SD completa) pode ser utilizado.
   2. Para amostras experimentais de medição de crescimento sob condições restritivas, use meio SD-URA.
2. Definir um leitor de microplacas multimodo para:. Uma temperatura de incubação de 30 ° C, OD ₆₀₀ intervalos de medição de 15 minutos, e um ciclos orbitais e lineares de agitação de 1 min a cada sete minutos
   NOTA: Esta-dual mode tremor foi otimizada para obter uma distribuição homogênea de células; no entanto, outros modos de agitação ou mesmo nenhuma agitação pode funcionar tão bem.
3. Incubar as células a 30 ° C num leitor de microplacas O / N ou até que as células tenham atingido a fase estacionária (12-24 h).
4. Exportar os dados brutos em um arquivo de planilha.
5. Determinar a cinética de crescimento de leveduras utilizando MDTcalc, um programa de software personalizado que calcula o tempo mínimo (em horas) para as células para dobrar seu tamanho populacional (Minimal tempo de duplicação (MDT); para mais detalhes ver seção 4).

4. O cálculo do tempo de duplicação Minimal (MDT): Princípios do Algoritmo MDTcalc

NOTA: Princípios do algoritmo MDTcalc, utilizando uma amostra representativa de células de levedura Try467 (Tabela 2) cultivadas em meio completo SD, são ilustrados na Tabela 1 e na Figura 1, que mostra uma folha de cálculo e dados de crescimento parcelas, respecpectivamente.

1. Subtrair OD ₆₀₀ valores em branco, obtido no respectivo poço, a partir de cada uma das leituras obtidas no poço da amostra. Separe as diferenças resultantes de 0,55 (por placas de 96 poços) para corrigir o comprimento do percurso da luz. Traça-se os valores finais (Tabela 1, Trans.) Contra o tempo para produzir a curva de crescimento de levedura real (OD ₆₀₀ / hr) (Figura 1A).
2. Calcular o log ₂ (OD ₆₀₀₎ para cada um dos valores transformados para converter a fase logarítmica de crescimento em uma curva linear (Figura 1B).
3. Calcular o declive de um intervalo de 10 pontos temporais (N = 10) começando no tempo 0 e movendo um ponto de tempo de cada vez até N <10 (Tabela 1, Pista; Figura 1C).
4. Calcula-se o valor inverso de cada inclinação para obter o tempo necessário para a população de células para dobrar (Tabela 1, 1 / Declive; Figura 1C). Calcula-se o mínimo1 / valor Slope para determinar o MDT (Tabela 1, retângulo preto; Figura 1C). Extrai-se a MDT calculada para células na amostra (Tabela 1, 1 / Slope, rectângulo preto) a partir do intervalo de tempo seleccionado (Tabela 1, delineada pelo rectângulo vermelho, as Figuras 1B, 1D).
   NOTA: A taxa de crescimento celular em meio SD-URA é inversamente proporcional ao MDT.

5. Usando MDTcalc

1. Copie os arquivos de programas suplementados em uma pasta designada no computador.
2. Verifique se o arquivo de planilha que contém os dados de crescimento é salvo e fechado. Abra o programa de aplicação MDTcalc para ver o início da tela aparece.
   1. Insira as informações necessárias, como demonstrado na Figura 2:
      1. Em 'Caminho do arquivo ", clique no retângulo à direita para localizar o arquivo de planilha.
      2. Em 'Nome de folha ", escrever o nome da planilha onde tele dados brutos está localizado.
      3. Em "Posição inicial", insira coordenar a planilha de tempo 0 da primeira amostra.
      4. Em 'coluna Time', insira a letra que define a localização da coluna ponto de tempo (tempo deve ser fornecido em segundos).
      5. Sob 'coluna em branco ", inserir a carta que define a localização da coluna em branco (geralmente, mas não necessariamente no poço A1 da placa de 96 poços).
      6. Em 'valor OD', escolha o valor mínimo transformado OD ₆₀₀ necessário para o início do cálculo MDT (geralmente ,15-0,25). A definição deste valor impede cálculos de MDT para as culturas em fase de latência, devido à diluição excessiva para que MDT é calculado apenas para as amostras que chegam ao valor _DO600 definido ou superior.
   2. Uma vez que o último valor foi inserido, pressione o botão "calcular" na parte inferior da tela. Certifique-se de que a barra de progresso na direita muda gradualmente para green. Não abra o arquivo de planilha durante o processo de cálculo.
   3. Exportar os dois conjuntos de dados que aparecem automaticamente na tela após a conclusão do cálculo MDT em uma planilha. Certifique-se de que os dados incluem: (a) o valor MDT para cada bem que passa o teste do valor OD mínimo (como definido na seção 5.2.1.6) e (b) o ponto do intervalo a partir do qual o MDT foi calculado o tempo inicial (Iniciar tempo).

Resultados

Investigar o papel das enzimas da via Doa10 na degradação de um substrato de repórter

Para testar a validade do método gils que foi comparado com um ensaio de degradação de tradicional. Esta experiência avalia a contribuição relativa dos componentes da membrana localizada ER-Doa10-ligase E3 complexo de ^20,21 para a degradação do substrato de proteína repórter de controlo de qualidade Deg1- VU (Figura 3A). O plasmídeo Deg1- VU foi...

Discussão

Aqui nós descrevemos um ensaio baseado no crescimento celular para determinar a taxa de degradação da proteína relativos, denominado 'A cinética do crescimento em cultura líquida sob condições selectivas "(Gils). O ensaio Gils tem várias vantagens: é simples de configurar, aquisição e análise de dados é simples e é extremamente modular. Consequentemente, Gils podem ser aplicadas simultaneamente para várias amostras em um amistoso formato de placa de multi-usuário que também pode ser adaptado a automação para ap...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Base de nitrogênio de levedura Difco sem aminoácidos e sulfato de amônio	BD Biosciences	233520	Para crescimento de levedura em meio SD mínimo.  Os aminoácidos a serem fornecidos são: Arginina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Felinalanina, Treonina, Triptofano
Sulfato de amônio	Sigma - Aldrich	A4418
Glicose	Sigma - Aldrich	16325
Adenina	Sigma - Aldrich	A8626
Uracil	Sigma - Aldrich	U0750
Aminoácidos	Mais Alto pureza disponível
Placas de 96 poços	Nunc	167008	Qualquer outra marca compatível pode ser usada
Ciclohexade	Sigma - Aldrich	C7698	Trabalhando conc. 0,5 mg/ml
Infinite 200 PRO series	Tecan		Para incubação de leveduras e medições OD600. Qualquer outro leitor compatível com controle de temperatura pode ser usado.
Software MDTcalc			Experimental