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Artigo de método

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

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DOI:

10.3791/52022

⸱

20 de outubro de 2014

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Neste artigo

Resumo

A manipulação da expressão gênica temporal na diferenciação de células-tronco embrionárias (ESCs) pode ser alcançada usando sistemas gênicos induzíveis. No entanto, a geração dessas linhagens celulares é cara e demorada. Este protocolo alcança a expressão rápida de um transgene na diferenciação de células derivadas de ES e subsequente análise da diferenciação hematopoiética a jusante.

Resumo

As células-tronco embrionárias (ESCs) são um excelente modelo para elucidar os mecanismos moleculares de diferenciação celular. Eles são especialmente úteis para investigar o desenvolvimento de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) precoces. A expressão gênica em ESCs pode ser manipulada por várias técnicas que permitem determinar o papel de moléculas individuais no desenvolvimento. Uma dificuldade é que a expressão de genes específicos geralmente tem efeitos fenotípicos diferentes, dependendo de sua expressão temporal. Esse problema pode ser contornado pela geração de ESCs que inducivelmente expressam um gene de interesse usando tecnologia como o sistema transgênico induzível por doxiciclina. No entanto, a geração dessas linhagens celulares induzíveis é cara e demorada. Aqui está descrito um método para desagregar corpos embrióides (EBs) derivados de ESC em suspensões unicelulares, infectando retroviralmente as suspensões celulares e, em seguida, reformando os EBs por gota suspensa. A diferenciação a jusante é então avaliada por citometria de fluxo. Usando este protocolo, foi demonstrado que a expressão exógena de um gene de microRNA no início da diferenciação ESC bloqueia a geração de HPC. No entanto, quando expresso em células derivadas de EB após a produção do mesoderma nascente, o gene do microRNA aumenta a diferenciação hematopoiética. Este método é útil para investigar o papel dos genes após a derivação do tecido específico da camada germinativa.

Introdução

As células-tronco embrionárias murinas (CTEs) são pluripotentes, permanecendo indiferenciadas e auto-renovadas na presença da citocina Fator Inibidor da Leucemia (LIF)1. Após a retirada do LIF, eles se diferenciarão espontaneamente em estruturas tridimensionais (3D) chamadas corpos embrióides (EBs)2. A arquitetura 3D permite o desenvolvimento das três camadas germinativas ectoderma, endoderme e mesoderma, que posteriormente dão origem a tipos de tecidos maduros3. As CTEs são um modelo excepcional para elucidar os mecanismos moleculares de diferenciação celular, particularmente a investigação do desenvolvimento de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) precoces4.

A expressão gênica em ESCs pode ser manipulada por várias técnicas que permitem a determinação de um papel para moléculas individuais no desenvolvimento. Uma das técnicas mais comuns é usar a recombinação homóloga para gerar linhagens ESC, que não possuem um gene de interesse5,6. Há também uma série de técnicas que têm sido usadas para superexpressar genes. A primeira técnica utilizada para modificar a expressão gênica em CTEs foi infectá-las com retrovírus recombinantes7,8. O gene de interesse, no entanto, é frequentemente silenciado à medida que as ESCs se diferenciam em tipos de células progenitoras e maduras. O uso de lentivírus tem sido bem-sucedido em limitar o silenciamento de genes expressos viralmente9. Outros vetores virais usados para superexpressão incluem adenovírus e vírus adeno-associados10. Além disso, técnicas de transfecção padrão para introduzir plasmídeos de expressão de forma estável são amplamente utilizadas para a expressão do transgene ESC11. Uma dificuldade com esses sistemas é que muitas vezes a expressão de um gene específico tem efeitos diferentes dependendo de sua expressão temporal. Por exemplo, a proteína Smad1 afeta o desenvolvimento de células hematopoiéticas de maneira diferente durante diferentes estágios do desenvolvimento da EB12,13.

Este problema pode ser contornado pela geração de ESCs que inducivelmente expressam um gene de interesse. O sistema mais comum para expressar inducivelmente transgenes em ESCs usa o operon de resistência à tetraciclina de E. coli (Escherichia coli). Vários sistemas diferentes de tetraciclina foram desenvolvidos. Uma das estratégias mais populares foi desenvolvida por Kyba e colegas14. Eles geraram uma linha ESC (Ainv15), que possui o gene transativador reverso de tetraciclina inserido no locus ROSA26 constitutivamente ativo. Um elemento de resposta à tetraciclina (TRE), um sítio LoxP a jusante (locus de X-over P1 do bacteriófago P1) e um de neomicina sem promotor foram introduzidos no locus HPRT (hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase) no cromossomo X. Usando uma abordagem de recombinação CRE, um gene de interesse junto com um promotor eucariótico para impulsionar a expressão do gene de resistência à neomicina pode ser inserido no local LoxP. As ESCs direcionadas corretamente são isoladas pela seleção G418. Esses clones direcionados devem ser testados quanto à expressão induzível por doxiciclina (ou tetraciclina) do transgene. Essa abordagem gerou com sucesso linhas ESC que expressam indubitavelmente HoxB4, Stat5, SCL e Smad714-17. No entanto, a geração dessas linhagens celulares induzíveis é demorada. Descrito aqui é um método para desagregar corpos embrióides derivados de ESC (EBs) em suspensões unicelulares, infectar retroviralmente as suspensões celulares em diferentes dias de desenvolvimento e, em seguida, reformar os EBs por gota pendurada. A diferenciação a jusante é posteriormente avaliada por citometria de fluxo. Neste artigo, é mostrado um exemplo de como a expressão de miRNAs em células derivadas de EB afeta a diferenciação hematopoiética. Este método é útil para investigar o papel dos genes após a derivação do tecido específico da camada germinativa.

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Protocolo

1. embrioides Corporal (EB) Formação

  1. Gelatina-se adaptar CES que foram mantidos em fibroblastos de embrião de ratinho (MEFs). CES passagem 3 vezes na placa de 6 poços de cultura de tecidos revestidas com gelatina a 0,1% para remover MEFs.
    1. Cultivar células em meio de manutenção com LIF ESC para manter as células indiferenciadas (Tabela 1). Faça células certeza nunca superior a 80% de confluência. Use baixa passagem (10 ou menos passagens após a remoção de MEFs) células de diferenciação.
  2. No dia antes da CES são cultivadas durante a diferenciação EB, a passagem das células, de forma que será de aproximadamente 50-70% confluentes no dia seguinte. Continuar a cultura de células em meio de manutenção de ESC para reter pluripotência das células.
  3. No dia da diferenciação, meios de manutenção aspirado ESC e lava-se com 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM e 11,9 mM de tampão fosfato, pH 7,4) por poço de uma placa de 6 poços.
    1. Adicionar 200 ul de 0,25% Trypsem / EDTA a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 3 min.
    2. Inactivar a tripsina / EDTA com 800 ul de meios de diferenciação. Pipeta cima e para baixo em um 2 ml pipeta sorológica com uma ponta p200 para quebrar-se as células em uma suspensão de células individuais. Certifique-se de que a ponta p200 se encaixa perfeitamente no final, para a mídia não subir entre a pipeta e interface de ponta.
    3. Pipeta cima e para baixo cerca de 5-10 vezes. Tome cuidado para não criar bolhas durante a pipetagem.
  4. Transferência de células para um tubo cônico de 15 ml. Traga-se o volume para 10 ml com PBS. Centrifugar a 315 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Remover o sobrenadante. Lavar duas vezes com 5 ml de PBS para remover a mídia restantes contendo LIF. Centrifuga-se como no passo 1.4 para cada lavagem.
    1. Ressuspender o sedimento final de células em 2 ml de meio de diferenciação (Tabela 2).
  6. Contar as células com um hemocitómetro ou contador de células e a placa 6.000-10.000 células / ml numa placa de 10 centímetros de Petri(Cultura de tecido não-tratado).
    1. Determine as exatas células / ml empiricamente para cada linha ESC. Use placas de Petri estéreis normalmente utilizados para o trabalho bacteriana ou placas de baixa adesão.
      NOTA: Para obter os melhores resultados de diferenciação, as EBs devem formar esferas que permanecem em suspensão sem anexar a placa. Teste várias marcas de placas para encontrar aquelas com menos aderência.
    2. Incubar os CES diferenciadores em um 37 ° C tecido cultura incubadora com 5% de CO 2.
Reagente Banco Concentração final Volume Empresa Número de Catálogo
DMEM 1x 410 ml S IGMA / Aldrich D5796
FBS (ES filtrada) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Não-essencial Aminoácidos 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-Glutamina 100x 1x 5 ml Life Technologies 35050
Penncillin / Estreptomicina 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoetanol 14,3 M 114 mM 4 l Sigma / Aldrich M3148
Fator Inibidor de Leucemia (LIF) 10 7 unidades / ml 1000 unidades / ml 50 ul Millipore ESG1107
ONTEÚDO "> Tabela 1: ESC Manutenção Media.

Reagente Banco Concentração final Volume Empresa Número de Catálogo
DMEM 1x 410 ml Sigma / Aldrich D5796
FBS (User selecionados para diferenciação ideal) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Não-essencial Aminoácidos 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-Glutamina 100x 1x 5 ml Vida Tecnologia degias 35050
Penncillin / Estreptomicina 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoetanol 14,3 M 114 mM 4 l Sigma / Aldrich M3148

Tabela 2: Diferenciação Media.

2. preparação de células EB à infecção pelo Vírus

  1. Na fase de desenvolvimento desejado (entre o dia 2 e dia 3), transfira as EBs do 10 centímetros de Petri para tubo de 15 ml. Lava-se a placa com 5 ml de PBS e adicionar a lavagem para o tubo cónico.
  2. Agregar as CEs a 315 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Lave as células EB com 5 ml de PBS.
  3. Adicionar 1 ml de solução de separação de células descongelado (contendo enzimas proteolíticas e colagenolíticas) e colocar os tubos num banho de água a 37 C ° (incubadora) ou durante 30 minutos com occagitação asional (a partir de um movimento súbito ou luz vórtice).
  4. Adicionar 1 ml de mídia diferenciação. Pipeta cima e para baixo com uma pipeta 2 ml com uma ponta de pipeta p200. Colocar o tubo em banho-maria a 37 ° C de novo durante 30-60 minutos.
  5. Girar as células a 315 xg durante 5 min e lava-se as células com PBS.

Infecção 3 Vírus

  1. Ressuspender as células em 1,5 ml de meio de diferenciação. Transferência da suspensão de células para uma de 6 poços de cultura de tecidos não-placa tratada.
  2. Prepare a retrovírus por técnicas convencionais antes do tempo. Adicionar 5 a 100 mL de sobrenadante virai para células dependendo título viral. Não adicione polibrene para melhorar a infecção, pois isso inibe a reforma posterior da EBS.
  3. Spinoculate as células com o vírus por centrifugação a 2120 xg durante 90 min à temperatura ambiente.

4. Diferenciando virais células EB infectados em gotas de suspensão

  1. Adicionar 2 ml de meio de diferenciação em cada poço de infected EB suspensão de células.
  2. Pipetar 3,5 ml de suspensão de células infectadas em EB um reservatório de reagente estéril para multipipettors. Utilizar a pipeta de multipipettor 15-20 filas de oito 20 ul gotas sobre a tampa invertida da placa de Petri 15 centímetros.
  3. Adicionar 10 ml de PBS estéril ou água para a metade inferior da placa de Petri. Em seguida, inverter a tampa com as gotas e coloque sobre a placa de Petri. Certifique-se de que as gotas estão pendurados de cabeça para baixo a partir da tampa com PBS ou água abaixo para manter a câmara úmida.
  4. Coloque os pratos no 37 ° C tecido cultura incubadora com 5,0% de CO 2.
  5. Após 2 dias, recolher EB formadas na suspensão, invertendo a tampa cai e lavagem com 4,5 mL de meios de diferenciação.
    1. Transferência de Mídia e EBS para uma nova cultura 10 centímetros não-tecido placa de Petri. Lava-se a tampa, uma vez mais com 3 ml de meio de diferenciação e de transferência para a placa de 10 cm.
  6. Células colheita para análise por citometria de fluxo depois de um total de 8dias de cultura a partir da transferência inicial de células de mídia diferenciação (-LIF).

5. As células que se preparam para Análise de Fluxo Cytometer

  1. Transferir as células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 10 ml. Lava-se a placa com 5 ml de PBS e transferir para o mesmo tubo cónico.
  2. Células de pellets em 315 x g. Lave pellets com 10 ml PBS.
  3. Adicionar 1 ml de solução de separação de células descongelada e colocar os tubos num banho de água a 37 C ° durante 30 min, com agitação ocasional. Para a detecção de alguns antigénios de superfície celular, a tripsina pode ser usado em substituição.
  4. Adicionar 1 ml de mídia de diferenciação e pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 2 ml. Utilizar uma ponta de p200 para a ponta da pipeta para ajudar a quebrar-se digerido EB em suspensão de célula única.
    1. Colocar o tubo num banho de água a 37 ° C de novo durante 60 minutos a fim de que as proteínas de membrana integrais para reciclar para a superfície da célula.
  5. Sedimentar as células a 315 xg durante 5 min.
  6. Lave o wi célulasth 0,1% Albumina de soro bovino Fracção V (BSA) preparada em PBS (PBS / BSA) e incuba-se as células com anticorpos específicos fluorescente etiquetado.

6 Análise do Fluxo Citometria de Progenitores hematopoiéticos

  1. Colocam-se 10 6 células EB derivados em 5 ml 12 x 75 mm redondo tubo inferior. Para ajustar as definições de compensação citômetro de fluxo, use esferas de compensação de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Células de pellets em 315 x g. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em solução de PBS / BSA residual no tubo.
  3. Para detectar ESC HPCs, incubar as células com anticorpos fluorescentes rotulado: anti-rato CD41-PE (R-Phycoerytherin) e anti rato-CD117 (c-kit) -APC / Cy7 (aloficocianina Cyanine 7).
    1. Dilui-se os anticorpos 1: 100 em PBS / BSA. Adicionar 100 ul de anticorpo diluído em cada amostra. Determine a diluição correta de anticorpos para cada fornecedor, clone, e muito ou anticorpo. Determinar a diluição óptima para a marcação de células individualmente.
  4. Incubar as amostras em gelo no escuro durante 30 min.
  5. Adicionar 2 ml de células de PBS / BSA e pelotas a 315 xg durante 5 min.
  6. Aspirar o sobrenadante e pellet ressuspender em 300 mL de PBS ou outro tampão isotônica.
  7. Filtrar ressuspensas células através de um coador de células tampão (0,35 M) para remover grandes agregados celulares.
  8. Analise as células em um citômetro de fluxo.

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Resultados

Nestes estudos gelatinizadas RW4 (derivado de 129X1 / SvJ rato tensão) CES foram utilizados. EB foram isolados em 3 dias de diferenciação. Para melhores resultados, os CEs deve ser de forma esférica e não aderentes (Figura 1A, B). Após spinoculation com vírus que co-expressam a GFP marcador fluorescente, juntamente com um gene de interesse, EB foram reformada pelo método de gota suspensa. EB foram reformados com sucesso a partir de suspensões de células preparadas a partir de 2,0, 2,5 e 3,0 dias CEs. No...

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Discussão

Como discutido acima, os clones do CES por indução que expressam um gene de interesse pode ser gerada usando sistemas de doxiciclina, no entanto, a geração destas linhas é demorado e trabalhoso. Descrito no presente protocolo é um método de expressar um gene de interesse em suspensão de células individuais preparados a partir de derivados CES CEs. Estas células infectadas são então reformada em EBs por enforcamento queda para examinar diferenciação subseqüente. No exemplo (Figura 3), é mostrado que a ex...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros competitivos para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um Pilot and Feasibility Grants do Indiana University School of Medicine Center (IUSM) para Excelência em Hematologia Molecular (NIDDK, 5P30DK090948). Financiamento adicional foi fornecido por um Subsídio de Aprimoramento Biomédico da IUSM. Gostaríamos de agradecer à Dra. Karen Cowden Dahl por comentar o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMSigma/AldrichD5796
β-mercaptoetanolSigma/AldrichM3148
FBS (ES Screened)HycloneSH30070.03E
FBS (Defined)HycloneSH30070.03
Aminoácidos Não EssenciaisLife Technologies11140
L-GlutaminaLife Technologies35050
Penn/StrepLife Technologies15070
Tripsina/EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMilliporeESG1107
ACCUMAXMilliporeSCR006
Tripsina/EDTALife Technologies25200
Falcon Placas de Cultura de Tecidos 6- poçoFisher Scientific08-772-1B
Falcon Placas não tratadas 6 poçosFisher Scientific08-772-49
Placa de Petri Falcon 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Placa de Petri Falcon 15 cmFisher Scientific08-757-148
Falcon Tube 5 mlFisher Scientific14-959-11A
Falcon Tube 5 ml com tampa de filtro de célulasFisher Scientific08-771-23
Reservatórios estéreis brancosEUA Scientific111-0700
Rato anti-rato CD41 PE-conjugadoBiolegend133906
Rato anti-rato CD117 APC/CY7-conjugadoBiolegend105826
RW4 ESCsATCCCRL-12418

Referências

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