A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Resumo

Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.

Resumo

Lesão cerebral isquêmica é uma das condições mais comuns e devastadoras que comprometem a função cerebral adequada e muitas vezes leva a persistir déficits funcionais nos pacientes afetados. Apesar dos esforços de pesquisa intensiva, ainda não existe uma opção de tratamento eficaz disponível, que reduz a lesão neuronal e protege os neurônios nas áreas isquêmicas da morte secundário atrasado. A investigação nesta área, tipicamente envolve a utilização de modelos animais e elaborados problemáticos. Culturas fatia organotípica Entorhino-hipocampal desafiados com privação de oxigênio e glicose (POG) são estabelecidos em modelos in vitro que mimetizam isquemia cerebral. O aspecto inovador deste estudo é que as alterações dos vasos sanguíneos do cérebro são estudadas, além de alterações neuronais ea reação tanto do compartimento neuronal e compartimento vascular podem ser comparados e correlacionados. Os métodos apresentados neste protocolo ampliar substancialmente as aplicações potenciais da ouabordagem da cultura fatia ganotypic. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado por meios bastante simples em culturas organotípicas de fatias e leva a danos de confiança e reprodutível no tecido neural. Isto está em contraste com os experimentos em animais complexos e problemáticos induzindo acidente vascular cerebral e isquemia in vivo. Ao ampliar a análise para incluir o estudo da reação da vasculatura poderia fornecer novas maneiras de como preservar e restaurar as funções cerebrais. A abordagem da cultura fatia apresentado aqui pode se transformar em uma ferramenta atrativa e importante para o estudo da lesão isquêmica cerebral e pode ser útil para testar medidas terapêuticas potenciais com vistas a neuroproteção.

Introdução

O sistema nervoso central é particularmente sensível a uma perda ou redução do fornecimento de oxigénio e glicose pela vasculatura. Mesmo um tanto curta interrupção do fornecimento de sangue para o cérebro pode induzir uma perda permanente da função das áreas cerebrais relevantes que levam às síndromes típicas tempos. Além da perda de neurônios nas áreas afetadas primários, há normalmente uma perda neuronal atraso adicional através de danos secundários. Infelizmente, até agora, nenhum tratamento neuroprotector para a redução da morte neuronal secundária estava disponível ^um. Os esforços de pesquisa para estudar os mecanismos de lesão secundária se baseiam na utilização de modelos animais de isquemia cerebral como a oclusão da artéria cerebral média e de várias técnicas de oclusão trombótica (para uma revisão recente ver ^2). Em paralelo, também devido a limitações e preocupações éticas com o uso de modelos animais, cultura fatia organotípica de vários tecidos do sistema nervoso central têm sido utilizados que permitam o study de reações neuronais para vários tipos de lesões ^3-5.

Para estudar a reacção neuronais sob condições que imitam a lesão cerebral isquémica, o sistema modelo de privação de oxigénio glicose (OGD) foi desenvolvido. Neste modelo, as culturas de fatia são temporariamente expostos a um meio que carece de glicose, tendo sido equilibrada com o gás de azoto na ausência de oxigénio. Com um tal tratamento, é possível induzir a lesão neuronal e perda, que é bastante semelhante ao observado após lesão isquémica in vivo ^{de 6, 7.} No hipocampo, um tal tratamento induz a perda neuronal em CA1 especificamente, mas não no área CA3 ou do giro dentado do hipocampo. Em contraste, o estudo de reacções vasculares em culturas de fatias até agora não tem sido amplamente realizadas. Uma razão óbvia é a falta de circulação e de vasos sanguíneos de perfusão no modelo de cultura de fatia. Contudo, mostrámos previamente que é possível manter bvasos Lood em CNS fatia culturas por vários dias ^{8, 9.}

O objetivo geral deste método é monitorar não só o destino dos neurônios após POG, mas estender o estudo para o destino e remodelação da vasculatura que é uma parte importante da resposta a uma lesão. Até agora, os estudos têm exigido a utilização de experiências com animais (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). No protocolo apresentado aqui, vamos detalhar como tais estudos podem ser feitos em culturas fatia organotypic entorhino-hipocampal desafiou tanto a hipóxia ou por lesões excitotóxicos seguida da análise de ambos os sobrevivência e vasos sanguíneos reações neuronais. Este protocolo é baseado em um estudo publicado anteriormente sobre o assunto ¹⁰ e pode ser útil para qualquer laboratório interessado em interações neurovasculares no SNC.

Protocolo

Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva do Conselho Comunidades Europeias de 22 de Setembro de 2010 (2010/63 / UE) e foram analisados ​​e autorizados pelas autoridades suíças.

1 Configurando culturas fatia Organotípicas Entorhino-hipocampo

1. Prepare entorhino-hipocampal culturas organotípicas (EHOSCs) de pós-natal filhotes dia 4 (P4) do mouse usando o método de incubação ^4,11 estática. Aqui, utilizam ratinhos C57BL6 e CB6F1.
   1. Tome cerca de 30 min por rato filhote para a preparação de culturas fatia, ou seja, 3 horas para uma ninhada de seis filhotes de rato. Realizar todas as etapas em condições estéreis em uma bancada de fluxo laminar com instrumentos cirúrgicos esterilizados.
   2. A fim de evitar uma possível interferência a partir da posição do corte ao longo do eixo do septo-temporal, usar apenas o hipocampo fatias de metade do septo. Se não for indicado de outra forma, realizar todos os passos à temperatura ambiente.
2. Corte tele cabeça de um filhote de cachorro P4 rato com uma tesoura cirúrgica. Sem anestesia é necessário para este passo.
   1. Remover o crânio em volta do cérebro e identificar a fenda entre a extremidade caudal dos hemisférios cerebrais e mesencéfalo. Cuidadosamente remover a parte do cérebro para rostral do mesencéfalo do crânio e colocá-lo no meio de preparação de gelado consistindo em MEM suplementado com uma forma estabilizada de L-glutamina.
3. Continue a dissecção sob microscópio estereoscópico com o cérebro estar imerso no gelo médio preparação frio. Remover meninges remanescentes dos hemisférios corticais. Identificar o hipocampo na superfície caudal medial do hemisfério e separá-lo em conjunto com o córtex entorrinal adjacente do resto do cérebro.
   1. Transferir o tecido de um cortador de tecido e cortado 400 um de espessura, sob condições assépticas, transversal ao eixo septo-temporal do hipocampo.
4. Coloque as fatias sobre ceinserções de cultura II (aproximadamente 6 fatias por pastilha) e incubar em placas de 6 poços com 1 ml por poço de meio de incubação (47 ml de MEM, 25 ml de Meio Eagle, 25 ml de soro de cavalo, 1 ml I glutamax, 1 ml de uma solução estéril de glicose a 10%, pH 7,3) numa atmosfera húmida com 5% de CO _2, a 37 ° C. Troca da mídia no dia seguinte e, em seguida, a cada dois dias até uma semana.

2 In Vitro hipóxia e oxigênio-glicose Privação com reperfusão

1. Ver Tabela 1 para um horário exato momento do procedimento. EHOSCs de cultura para 5 dias (DIV5) antes da exposição a hipoxia ou POG. Neste ponto de tempo mudar a forma de meio de incubação contendo 25% de soro de cavalo para meio isento de soro, com a seguinte composição: meio Neurobasal com suplemento B27 a 2%, 1% de glucose e glutamax adicional de 0,1%.
2. Preparar o meio OGD como detalhado em 7 de referência .As concentrações finais dos componentes é a seguinte: 0,3mM de _CaCl2, 70 mM de NaCl, 5,25 mM de _NaHCO3, 70 mM de KCl, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, 2 mM de _MgSO4 e 10 mM de sacarose a pH 6.8. Adicionar 1 ml de meio a cada poço OGD de duas placas de cultura de tecidos de 6 poços.
   1. Perfundir a forma OGD com N ₂ durante 1 hora, em uma câmara de hipoxia e, em seguida, vedar e manter S / N em uma incubadora a 37 ° C.
   2. Use tiras de anaeróbios como indicadores de hipóxia. Considere o meio estar livre de oxigénio quando a cor das tiras mudou de rosa para branco.
   3. Para a indução da hipóxia, utilizar meio isento de soro com glucose, em vez de meio de OGD. Antes da utilização, o meio de perfundir com N _2, em uma câmara de hipoxia como descrito acima para o meio de OGD.
3. Antes de as fatias são expostas a OGD, perfundir a forma OGD novamente com N ₂ durante 30 min. Adicionar 2 mL de uma solução 1 mg / ml de iodeto de propídio (PI) de solução por cavidade (para uma concentração final de 2 ug / ml) para as fatias, durante 30 min e seleccionarapenas fatias saudáveis ​​para experimentação, conforme indicado por um reduzido número de células positivas para PI.
4. Utilizar o modelo de exposição OGD e reperfusão indicado na Figura 1. Privar fatias de oxigénio ou apenas (hipoxia) ou de oxigénio e glicose (POG), durante 15 min.
   1. Para a indução de hipoxia ou OGD, transferir as fatias em forma OGD e manter por 15 minutos em câmara de hipóxia. Certifique-se de que todos os fluidos que permanecem nos lados da peça inserta são aspirados para longe quando as culturas são comutados de forma regular para OGD médio e para trás.
   2. Após a hipoxia ou OGD, substituir o meio de OGD com meio isento de soro e oxigenado culturas são deixados a recuperar durante 3, 24 ou 48 horas em meio isento de soro na incubadora normal a 37 ° C com 5% de CO _2. Adicionar PI novamente antes da fixação para a determinação da morte celular.

3. tratamentos farmacológicos de Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

1. Culture EHOSCs durante 5 dias (DIV5) em meio de incubação antes de exposição a tratamentos farmacológicos. Iniciar os tratamentos farmacológicos ou durante ou imediatamente após a OGD OGD quando fatias são transferidas para meio isento de soro.
2. Tratamentos para proteção contra POG.
   1. Adicionar 100 | iM 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2.3-diona (CNQX) ou 1 uM a tetrodotoxina (TTX) ao meio de cultura durante a indução OGD (durante 15 min) ou imediatamente após a indução OGD durante 30 min. Em seguida, incuba-se meio isento de soro durante 48 horas normóxica antes da fixação.
3. Os tratamentos para a indução da morte excitotóxica.
   1. Após 5 dias de incubação em culturas de meio interruptor para meio isento de soro contendo 100 uM (RS) -α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ácido (AMPA), durante 30 min.
   2. Retire o meio de cultura contendo AMPA por aspiração (ter o cuidado de remover qualquer meio residual em inserções), em seguida, transferir as fatias para placas novas com acesso médio e soro normalmantê-los por 48 horas, até a fixação.

4. Fixação e Imunocoloração de Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

1. O iodeto de propídio (PI) a coloração.
   1. Adicionar PI durante 30 min para o meio de cultura de fatias de vida, a uma concentração de 2 ug / ml. Ver culturas vivas com um microscópio invertido equipado com óptica de fluorescência e selecione fatias para mais tratamentos. Para a coloração de PI em combinação com imuno-histoquímica, adicionar solução de PI 30 min antes da fixação das culturas.
2. A fixação das fatias.
   1. Remover o meio de cultura da placa de 6 poços e adicionar 3 ml de preparado de fresco a 4% de paraformaldeído (PFA) a cada poço. Em seguida, colocar a placa de 6 cavidades em uma geladeira e fixar O / N a 4 ° C.
   2. Remover a solução de PFA no dia seguinte e as fatias de lavar 3-4 vezes com tampão fosfato salino (PBS).
3. A remoção das fatias a partir da cultura de células insert e procedimento de bloqueio para imuno-histoquímica de secções de livre flutuação.
   1. Retirar cuidadosamente e retire as fatias das inserções de cultura utilizando uma arte pincel do tamanho 0 ou menor. Transferir cada faixa individual num poço de uma placa de 96 poços preenchidos com tampão de bloqueio (PBS com 3% de soro de cabra normal (NGS) e 2% de Triton-X100). Manter as fatias em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente, sob agitação constante por um agitador orbital.
4. A imunocoloração das culturas de fatias
   1. Para a marcação dos vasos sanguíneos usar policlonal anti-laminina a uma diluição de 1: 200 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100.
   2. Para os neurónios rotulagem utilizar anti-microtúbulo associado proteína 2 (MAP2), a uma diluição de 1: 500 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100.
   3. Incubar as fatias com anticorpos primários durante 48 horas a 4 ° C com agitação constante. Após o período de incubação, lavá-las em PBS com 0,5% Triton-X100 em 3-4 vezes.
   4. Dilui-se anticorpos secundários 1: 500 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100. Incubar as fatias durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro, com os anticorpos secundários conjugados com Alexa fluoróforo. Use de cabra anti-coelho adequado ou anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com Alexa 350 ou 488.
   5. Remover a solução de anticorpo secundário e lava-se as fatias de três vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS); montá-los em lâminas de vidro e lamela as lâminas com Mowiol.
5. Microscopia das fatias coradas
6. Ver as fatias manchadas ou em um microscópio padrão com equipamentos de epifluorescência ou com um microscópio confocal. Tire fotos com uma câmera apropriada. Para algumas imagens, inverter o contraste de fluorescência, a fim de produzir vasos com uma coloração escura sobre um fundo claro (Figuras 5 e 6).

5 Determinação da densidade de vasos Regional nas culturas

1. Quantificar o vessel com base na densidade de vasos passagens como descrito na Referência 8.
2. Use fatias manchadas para laminina para essas medições. Sobreponha as imagens gravadas de aumento de 10x com uma grade 6 x 6, onde cada grade é igual a 100 x 100 mm por metro quadrado, área total de 0,25 milímetros ^2.
3. Sobreposição três dessas redes na região CA1, CA3, DG, e CE (Figura 2). Conte as embarcações que cruzam as linhas do grid.
4. Para a obtenção de resultados com uma boa relevância estatística, fazer medições em pelo menos três experiências independentes, cada uma das quais os dados a partir de 3 filhotes de rato com três fatias por ratinho filhote.
5. Determine o valor médio das passagens de navio da grades para cada região e realizar uma análise estatística por ANOVA com correção de Bonferroni como post hoc teste (p <0,05 considerada significativa), utilizando software estatístico adequado.

Resultados

Oxygen privação de glicose e hipóxia induzir a morte neuronal e redução dos vasos sanguíneos, especificamente na região CA1 do hipocampo.
OGD ou privação de oxigénio e durante 15 min, sozinho induziu uma forte indução de morte celular como observado por coloração com iodeto de propídio, especificamente na área CA1 do hipocampo (Figura 3), semelhante ao descrito anteriormente ^7. Com marcadores para visualizar a rede de vasos sanguíneos, verificou-se que a densidade dos vasos sang...

Discussão

Com os métodos aqui apresentados, hipocampo culturas organotípicas de fatias pode ser utilizado como uma ferramenta versátil para estudar alterações plásticas no tecido neural após a lesão. Enquanto as culturas organotípicas de fatias tenha sido utilizado no passado para o estudo de reacções neuronais após isquemia ^{6, 7,} o novo aspecto do estudo simultâneo de alterações vasculares aumenta significativamente as aplicações potenciais do presente método. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado po...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Essencial Mínimo MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	forma estabilizada de L-glutamina
Inserções de cultura de células Millicell	Millipore	PICM03050
Meio basal Águia	Gibco	41010-026
Soro de cavalo	Gibco	26050-088
Meio neurobasal	Gibco	21103-049
Suplemento B27	Gibco	17504-044
Tiras anaeróbicas	Sigma-Aldrich	59886
Solução de iodeto de propídio	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R& D sistemas	0169-10
CNQX	R& D systems	0190/10
TTX	R& D systems	1078/1
anti-laminina policlonal	Sigma-Aldrich	L9393
anti-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti-mouse 350	Sondas Moleculares	A11045
Alexa anti-mouse 488	Sondas Moleculares	A11001
Alexa anti-coelho 350	Sondas Moleculares	A11046
Alexa anti-coelho 488	Sondas Moleculares	A11008
Software de estatísticas	GraphPad Software	GraphPad Prisma
McIlwain helicóptero de tecidos	Ted Pella	10180
Câmara de hipóxia	Billups-Rothenberg	MIC-101