Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrossomas consistem em um par de centríolos cercados por material de pericentriolar (PCM). Sendo os principais centros de microtúbulos organizadoras (MTOCs) em células de mamíferos, centrosomes servem como os dois pólos de fusos mitóticos em células em divisão, e, assim, ajudar a manter a integridade genômica ^1. Em células quiescentes (por exemplo, durante a fase G0), um dos dois centrioles do centrossoma, a saber, a centriole mãe, é transformado em um corpo de base, ao montar o cílio primário, um organelo sensorial salientes para fora a partir da superfície de células ^2. Uma vez que as células re-entrar no ciclo celular, os cílios são desmontados e cada centriole dirige a montagem de um procentriole na sua extremidade proximal que, gradualmente, se alonga para formar um centriole ³ madura. No início da fase S, uma estrutura semelhante a cambalhota que fornece a simetria de 9 vezes para a centriole é formada sobre a superfície de cada centriole existente e irá tornar-se a base de cada procentriole. SAS6 tchapéu é indispensável para a montagem centríolo é recrutado para formar o cubo da roda de carroça ^4-6. Outras proteínas centriolar são então montados para a cambalhota em um ambiente altamente regulado, proximal para distal maneira ^7. Depois de completar precisamente duplicação centríolo, células montar materiais pericentriolar adicionais para construir dois centrossomas funcionais até o final da fase G2 ^8. Em adição aos componentes principais centriolar ^9-11, várias outras proteínas, incluindo cinases, fosfatases, chaperones, componentes de andaime, proteínas de membrana associadas a degradação e máquinas estão associados com centrioles, corpos basais e PCM em alturas diferentes do ciclo celular ^12-16. Ele é frequentemente observado que os níveis de centrosomal muitas proteínas são temporalmente regulados por mecanismos de segmentação centrosomal e / ou degradação no proteossómica centrossomas. É importante ressaltar que as flutuações no nível centrosomal de várias proteínas, como Plk4, MPS1, SAS6 e CP110 umt diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para regular montagem centriole ^5,17-22, e no caso de MPS1 prevenir essa degradação centrosomal leva à formação de um excesso de ¹⁹ centrioles. Por outro lado, as fracções centrosomal de várias proteínas são menos lábeis em relação a piscinas citosólicas. Por exemplo siRNA mediada down-regulação da Centrin 2 (Cetn2) levou a apenas uma diminuição moderada do nível de proteína nas centrioles apesar de grande redução em toda a sua níveis de células ^23. É, portanto, essencial para medir as mudanças no nível de proteínas centrosomal no centrosome em vez de medir os níveis de proteínas inteiras celular ao avaliar suas funções específicas do centrossoma.

Neste estudo foi desenvolvido um ensaio utilizando imunofluorescência indireta (IFI) para quantificar o nível relativo de uma proteína no centrosomes. Este ensaio é desenvolvido particularmente para analisar as células que são a partir de diferentes amostrase, portanto, não pode ser trabalhada ao mesmo tempo. Estas amostras podem ser células que foram tratadas com diferentes reagentes (isto é, a droga versus controlo), recolhidas a diferentes pontos de tempo (isto é, contra perseguição de impulso), ou estão em diferentes fases do ciclo celular. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma região pequena e para normalizar o valor contra o mesmo para uma outra proteína cujos níveis não variam de acordo com as condições experimentais escolhidas. Vários estudos em biologia do centrossoma recentemente utilizados várias técnicas de microscopia quantitativa, em ambas as células vivas ou fixadas, para determinar a função específica do centrossoma de proteínas candidatas ^24-27. Semelhante aos ensaios, a presente técnica também mede a intensidade de fluorescência de fundo corrigido da proteína a testar. No entanto, a inclusão da normalização utilizando um padrão interno no presente ensaio seria provável oferecer maiorprecisão e confiança na análise de duas amostras diferentes que estão em duas lamelas diferentes. Além disso, em adição ao exame do nível de proteína no centrossomas, com pequenos ajustes este método pode ser aplicado a um conjunto diversificado de condições experimentais ou em outros locais celulares.

Aqui, nós combinamos nosso ensaio microscopia quantitativa, com uma estratégia de pulso-chase BrdU para comparar as células de diferentes fases do ciclo celular. Em vez de utilizar técnicas de paragem do ciclo celular e padrão de libertação para o estudo de vários pontos de tempo do ciclo celular, as células que crescem de forma assíncrona são incubadas com BrdU para marcar as células em fase S, e as células marcadas são perseguidos durante vários tempos (tipicamente 4-6 h). A maioria das células marcadas estará em fase S imediatamente após o pulso. O comprimento da perseguição é escolhida de modo que após a perseguição, células marcadas será no final de S, G2 ou mitose, o que pode ser verificado por características morfológicas, tais como- posição de centrossomas no que diz respeito ao nuclei, a distância entre os centrossomas, condensação de cromossomas, etc. Assim, o comprimento da perseguição depende da duração média de S, G2 e M de fase num tipo de célula particular. Uma vez que esta abordagem evita a inibidores do ciclo celular, tais como a hidroxiureia, a afidicolina, nocodazol, etc, que permite uma análise mais fisiologicamente relevante do ciclo celular.

Assim, demonstramos aqui que o ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa sozinho, ou em combinação com BrdU de pulso-caça ensaio, é uma técnica simples e poderosa para medir com precisão as mudanças relativas no nível centrosomal de uma proteína candidata durante um ciclo celular perturbado. Foi medido o nível de centrosomal VDAC3, uma proteína que, recentemente identificado em centrossomas além de mitocôndrias ^16,28, utilizando estes ensaios. Os resultados obtidos aqui verificar a nossa observação anterior de que a piscina centrosomal de VDAC3 é regulada pela degradação, e também varia em um dependen ciclo celulart modo ^16, além disso validando a aplicabilidade deste método.

1. Cultura celular

1. Use telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) nas células epiteliais pigmentares da retina imortalizadas (hTERT-RPE1; referido aqui como RPE1).
   NOTA: células RPE1 são células humanas quase diplóides, não transformadas que são comumente usados ​​para estudar a montagem centríolo e ciliogênese. Estas células seguem um ciclo de duplicação centríolo normais coordenado com um ciclo celular regulamentado.
2. Uma passagem quase confluentes 100 milímetros prato de cultura de células de células RPE1 a 1: 5 de diluição da cultura original para uma nova placa de 100 mm contendo 10 ml de meio DME / F-12 (1: 1) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina (meio completo é referido como DME / meio F-12). Crescer as células a 37 ° C na presença de 5% de CO _2.
   1. Incubar 12 milímetros lamelas de vidro redondas com 50 ml de HCl 1 N num copo de vidro coberto, S / N, sem agitação, a 60 ° C em um banho-maria ou incubadora.
   2. After descartando a solução de ácido, lavar as lamelas três vezes em 100 ml de água destilada, por incubação durante 15 minutos com agitação ocasional. Repetir a lavagem de modo semelhante em 70% de etanol e 95% de etanol.
   3. Secam-se as lamelas de cobertura, espalhando-os individualmente para fora em um papel mata-borrão em laboratório uma cabine de segurança biológica, seguido por esterilização por radiação UV durante 60 min.
3. Coloque 2-4 lamelas secas em um 35 milímetros de cultura de células prato. Dilui-se a solução de fibronectina ou fibronectina como polímero de engenharia (concentração estoque de 1 mg / ml) para uma concentração de 25 ug / ml em cultura de células de PBS.
   1. Coloque 80-100 ul da solução diluída em cada lamela e incubar durante 60 min a revestir o lado superior da lamela. Lave as lamelas três vezes usando PBS antes de adicionar meio completo.

2. Células crescendo e tratamento de células com inibidores de proteassoma

1. Passagem 2 x 10 ⁵ assincronamente crescercélulas ing RPE1 em cada 35 milímetros prato contendo lamelas e crescer as células em 2 ml de meio completo. Substituir o meio de cultura a cada 24 horas com meio completo fresco pré-aquecido.
   1. Para analisar o efeito de inibição do proteassoma no nível centrosomal da proteína de teste (aqui VDAC3 ou γ-tubulina), crescem as células em dois pratos de 35 mm para 44 hr. Substituir o meio de cultura com meio completo e adicione ou MG115 ou DMSO como controlo do solvente a uma concentração final de 5 uM ou 0,05%, respectivamente. Ao mesmo tempo, adicionar BrdU para as células a uma concentração final de 40 uM e incubar as células durante 4 horas.
   2. Transferência de cada lamela em uma placa de 24 poços. Adicionar 500 mL de metanol arrefecido a cada poço e incubar a placa à temperatura de -20 ° C durante 10 minutos para fixar as células sobre as lamelas. Lavar imediatamente as lamelas três vezes com 500 ul de tampão de lavagem (1x PBS contendo 0,5 mM _MgCl2 e 0,05% de Triton X-100).
2. Colha o residualas células a partir da placa de 35 mm e centrifugação das células a 1000 xg durante 5 min. Usar o sedimento celular para avaliar a proteína total por Western blotting (passo 6).

3. BrdU de pulso e Chase Ensaio para analisar os níveis de proteínas em diferentes fases do ciclo celular

1. Para analisar a variação do nível de uma proteína (aqui VDAC3, SAS6 ou Cep135) em centrossomas em diferentes fases do ciclo celular, as células crescer em dois pratos de 35 mm contendo lamelas de 44 horas. Substituir o meio de cultura com meio completo contendo 40 uM de BrdU e incubar as células durante 4 horas na incubadora de cultura de células.
2. A partir de um prato, transferir as lamelas a uma placa de 24 poços para fixar as células utilizando metanol arrefecido tal como descrito no passo 2.1.2.
3. Após o pulso de BrdU 4 h, remover o meio contendo BrdU, lave as células uma vez com PBS e uma vez com meio completo, adicionar meio fresco, e depois crescer as células na ausência de BrdU durante vários tempos (geralmente mais 4 hpara células RPE1) antes de fixar as células tal como descrito no passo 2.1.2.
   NOTA: Para as células RPE1, a maioria das células positivas para BrdU são em S tardia ou fase G2 após uma perseguição de 4 h. Isso deve ser determinada de forma independente para cada tipo de célula.

4. Immunostaining

1. Incubar as células fixadas em lamelas em 200 ul de tampão de bloqueio (2% de BSA e 0,1% de Triton X-100 em PBS 1x), durante 30 min.
   1. Incubar as células com uma mistura de anticorpos primários (tipicamente uma produzidos em coelho e outra levantada em rato) diluído em tampão de bloqueio O / N a 4 ° C numa câmara humidificada.
   2. Para fazer uma câmara úmida, colocar uma toalha de papel molhado na metade inferior de uma caixa de ponta da pipeta vazio 1.000 l. Coloque uma tira de Parafilm na superfície da cremalheira, e detectar uma gota (15-20 ul) da solução de anticorpo para o Parafilm para cada lamela para ser incubados. Inverter uma lamela para uma gota de solução de anticorpo (de modo que as células estão imersos) e pertoa tampa da caixa de ponta.
   3. Inverta lamelas novamente e devolvê-los de volta para o 24 bem prato. Lavar as lamelas e, em seguida, incuba-los na mistura de 150 ul de anticorpo secundário (aqui corante conjugado anti-coelho verde-fluorescente e o corante vermelho fluorescente conjugado anti-rato diluído em tampão de bloqueio) durante 1 h à TA. Lavam-se as lamelas três vezes.
      NOTA: Os anticorpos secundários fluoróforos são sensíveis à luz. Proteja as amostras da luz durante os passos 4.1.3-5.1.2.
2. Preparar para a coloração anti-BrdU por fixação das células coradas RPE1 novamente com 500 mL de metanol arrefecido a -20 ° C durante 10 min, tal como descrito no passo 2.1.2. Lavam-se as lamelas três vezes.
   NOTA: Este fixação prende a marcação com anticorpos primários e secundários da proteína (s) de interesse durante o processo de hidrólise ácida no passo seguinte.
   1. Incubar as células em 200 ul de HCI 2 N durante 30 min à TA. Neutraliza-se com 300 ul de 1 M de Tris-Cl, pH 8, umad lavar as células por três vezes com tampão de lavagem.
   2. Bloquear as células novamente usando 200 ul de tampão de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente.
   3. Incubar as células com anticorpo de rato anti-BrdU (diluído em tampão de bloqueio) durante 45 min a 37 ° C numa câmara humidificada. Devolver as lamelas de volta para o prato de 24 poços, lavá-los e depois incubar com o corante azul-anticorpo conjugado fluorescente anti-rato secundária (diluído em 150 ul de tampão de 24 poços prato de bloqueio durante 1 h à TA.
3. Lavam-se as lamelas três vezes. Detectar uma gota (aproximadamente 3-6 L) de uma solução de montagem antifade contendo reagente sobre uma lâmina de vidro de microscópio. Inverter uma lamela, com o lado da célula a virada para baixo, para a solução de montagem. Limpe o excesso de líquido, pressionando suavemente a lamela contra o slide usando tecido de limpeza suave. Aplicar transparente unha polonês ao longo da borda da lamela para selá-lo para a lâmina de microscópio.

5. Imunofluorescência Imagem acquisition e Análise

1. Utilize uma objectiva de imersão em óleo de 100X Plano Apo (com uma abertura numérica de 1,4) para adquirir as imagens de células positivas para BrdU RPE1 à temperatura ambiente.
   1. Coloque uma lâmina no microscópio (veja equipamentos) ligados com uma câmera capaz de imagem digital. Para cada fluoróforo, determinar o tempo de exposição apropriado (tipicamente entre 300-1,000 mseg) através do exame manualmente todas as amostras de uma experiência. Antes da aquisição de imagens de uma célula, determinar manualmente o topo do apropriado e plano focal inferior ao longo do eixo Z (tipicamente de 0,2 um tamanho de passo). Aquisição de imagens de diferentes amostras que estão em lamelas separadas, usando o tempo de exposição idênticos para diferentes fluoróforos ao longo do eixo Z, usando um pacote de software de imagem digital microscopia.
2. Execute deconvolution (nesses casos, não usando nenhum algoritmo do vizinho) de todas as pilhas de imagens adquiridas ao longo do eixo Z.
   1. Obter a projeção total de intensidade de cada pilha de imagens ao longoo eixo Z.
3. Nas células onde centrosomes estão próximos (distância entre dois centrossomas é inferior a 2 mm), desenhe um pequeno quadrado (tipicamente 20-30 pixels de cada lado) em torno de ambos os centrossomas e marcar a área selecionada.
   1. Desenhe um quadrado maior (tipicamente 24-35 pixels de cada lado) em torno do primeiro quadrado e marcar a área selecionada da grande praça.
   2. Obter a área (A) e a intensidade de fluorescência total (F) de cada fluoróforo em cada caixa (S indica a pequena caixa e L indica a caixa grande).
   3. Analisar o fundo corrigida intensidade de fluorescência de cada fluoróforo utilizando a fórmula descrita por Howell et al. ^29: F = F _S - [(F _L - F _S) x A _S / (A _L - A _S)].
   4. Obter a intensidade de fluorescência normalizada da proteína de interesse (aqui VDAC3 ou SAS6) através do cálculo da razão entre a intensidade de fluorescência corrigida dos seus fl-fundouorophore ao do fluoróforo utilizado para o padrão interno escolhido (aqui γ-tubulina, ou SAS6 Cep135).
4. No caso de análise de células, onde os centrossomas estão bem separadas (distância entre dois centrossomas é superior a 2 mm), analisar cada centrossoma separadamente por desenho dois conjuntos separados de caixas. Desenha um pequeno quadrado (tipicamente 15-25 pixels de cada lado) em torno de cada centrosome e marcar a área selecionada. Desenhe um quadrado maior (20-30 pixels de cada lado) em torno do primeiro quadrado e marcar a área selecionada.
   1. Obter a área (A) e a intensidade de fluorescência total (F) de cada fluoróforo em cada caixa, e calcular as intensidades de fluorescência de fundo corrigido de cada fluoróforo, separadamente para cada centrossoma, conforme descrito no passo 5.3.3.
   2. Combina-se as intensidades de fluorescência de fundo corrigido de cada uma das proteínas a partir das duas centrossomas para obter o nível centrosomal total de proteína em que essa célula.
   3. Obter aintensidade normalizada para a proteína de interesse por cálculo da razão da sua intensidade centrosomal total e intensidade centrosomal total do padrão interno.
5. Analise pelo menos 15-25 células para cada condição experimental e traçar o gráfico em uma planilha.

6. Analisando proteína total Usando Western Blotting

1. Ressuspender as células em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo 50 mM de Tris-HCl a pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% dodecilsulfato de sódio (SDS) e incubar durante 10 min em gelo para lisar as células.
   1. Centrifuga-se a mistura a 10.000 xg durante 10 min, separar o lisado a partir da fracção sedimento e medir a concentração de proteína total de cada lisado usando um ácido bicinconínico (BCA) Kit de ensaio.
2. Misturar 40 ug de lisado 4x com tampão de carga de SDS-PAGE (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, 0,1% Bromophenol azul).
   1. Ferver as amostras durante 10 min e executar as amostras sobre um 12,5% de desnaturação de SDS-PAGE a uma voltagem constante de 200 V.
3. Transferem-se as proteínas separadas em SDS-PAGE para uma membrana de nitrocelulose usando a técnica de transferência de western (a uma voltagem constante de 90 V durante 1 hora em frio).
   1. Bloquear a membrana com 3% de leite desnatado em PBS 1x, e então incubar a membrana com soluções de anticorpos primários diluídos (neste caso de coelho anti-VDAC3, de coelho anti-γ-tubulina e de ratinho anti-α-tubulina) durante 1 h à TA.
   2. Depois de lavar a membrana três vezes (5 min cada incubação sob agitação), utilizando tampão PBS-T (PBS 1x e 0,2% de Tween-20), incubar a membrana numa mistura de infravermelho próximo, (IV) corante fluorescente conjugada com anti-coelho e corante fluorescente de IV anticorpos secundários anti-murganho conjugados (diluídos em PBS-T) durante 1 hora.
   3. Lava-se a membrana três vezes e, em seguida, analisar a membrana para analisar as bandas utilizando um f infravermelhosistema de imagem luorescence adequado para a detecção de immunoblot.

Os nossos estudos recentes identificaram novos centrosomal localização e função de VDAC3, uma das porinas mitocondriais 16,28. A imunocoloração de várias células de mamíferos, incluindo células RPE1 utilizando um anticorpo específico VDAC3-centrosomal apresentaram coloração proeminente e coloração mitocondrial comparativamente fraca. Nós também mostrou que VDAC3 centrosomal é preferencialmente associado ao centríolo mãe, ea piscina centrosomal tanto da endógeno e ectopically expressa VDAC3 é regulada pela degradação 16. A fim de validar o ensaio quantitativo IIF analisamos as variações na piscina associado VDAC3-centrossoma em células que estão na fase S.

Aqui, de forma assíncrona em crescimento RPE1 células foram tratadas com o inibidor de proteassoma MG115 ou o controle de solvente DMSO durante 4 h. Para restringir nossa análise de células que que estão em fase S e passando por montagem centrosome, temos células que incorporaram BrdU du só examinoutocar o mesmo 4 horas e tinha dois centrossomas estreitamente espaçadas (espaçados dentro de 2 m uns dos outros). Foram examinados vários campos aleatórios de células coradas para BrdU e núcleos de controlo e no tratamento MG115 (Figura 1A) para se concluir que o tratamento breve de MG115 não afectam a incorporação de BrdU (aproximadamente 58%) em comparação com o tratamento controlo (aproximadamente 56%) em células RPE1. À medida que foram comparando apenas as células que estavam em fase S (tal como avaliado pela presença de dois focos γ-tubulina espaçados dentro de 2 m uns dos outros), considerou-se γ-tubulina como um potencial padrão interno para normalização. Assim, começou por examinar se centrosomal níveis de γ-tubulina em células positivas para BrdU variar de acordo com a inibição do proteassoma. Não surpreendentemente, houve variação considerável de célula para célula em γ-tubulina intensidade de fluorescência de uma célula para outra, e nós achamos que essa variação foi melhor apresentado em diagramas de caixa e suiça que apresentam o conjunto de dados como um todo disponível. EUQuadro N e suiça diagramas, caixas representam o quartil inferior e superior, o marcador na caixa indica a mediana de cada série, e os bigodes representam os valores mínimos e máximos, que são muitas vezes (mas nem sempre) discrepantes. Como se pode ver na Figura 1D, o nível γ-tubulina centrosomal não foi significativamente diferente entre as células positivas para BrdU tratados com MG115 ou DMSO, validando assim γ-tubulina como um padrão interno para esta experiência. Em contraste com γ-tubulina, a intensidade de fluorescência corrigida-fundo correspondente ao VDAC3 centrosomal foi cerca de 2,5 vezes mais elevada em células tratadas com MG115 do que em células de controlo (Figura 1C). Quando normalizada fluorescência total VDAC3 contra que de γ-tubulina, o aumento de vezes caiu ligeiramente para cerca de duas vezes (Figura 1E). Embora a mudança vezes foi maior sem normalização, temos mais confiança na precisão dos dados normalizados, o que nós sentimos Bettcontroles er para qualquer efeito geral de tratamento MG115, assim como a variação devido ao processamento da amostra. Coloração VDAC3 em locais não-centrosomal (Figura 1B) ou a nível celular total de VDAC3 (Figura 1F) não foi afetado pela inibição do proteassoma. Assim, quantitativamente verificar nossa observação anterior de que a piscina centrosomal de VDAC3 é regulada pela degradação mediada-proteassoma.

A fim de medir a variação na VDAC3 centrosomal durante o ciclo celular já marcaram as células com um pulso de BrdU 4 horas seguido por uma perseguição de 4 h das células marcadas. Uma vez que apenas as células em fase S, irá incorporar BrdU durante o impulso (distância média entre dois centrossomas é 1,35 ± 0,16 micron), a maioria das células positivas para BrdU RPE1 após 4 h perseguição será no final ou fase S ou fase G2 precoce ( distância média entre dois centrossomas é de 1,55 ± 0,22 mM), com uma população menor na fase G2 tardia, onde o centroalguns par separou significativamente (distância média entre dois centrossomas> 2 m) 30. γ-tubulina, sendo um componente principal de PCM muito acumula no centrossomas durante a maturação do centrossoma que tem lugar a fase G2 31,32, e este aumento torna um padrão interno pobre para verificar as variações no ciclo celular de outras proteínas centrosomal. Por outro lado, é recrutado para SAS6 procentrioles durante a fase S precoce para estimular a montagem dos cartwheels 4,5,7, e permanece na base dos centrioles recém-formados células entram em mitose até quando se começa a degradar-se (Figura 2 e de referência 5). No entanto, em células HeLa ou U2OS, o nível de centriolar SAS6 gradualmente aumenta à medida que as células progridem da S-fase para fase G2 5. Portanto, medimos o primeiro nível SAS6 centrosomal com respeito à de Cep135, uma outra proteína do núcleo centriolar que localiza com as extremidades proximais dos centrioles todao ciclo celular 33. Não foi observada nenhuma diferença significativa nas intensidades de fluorescência total corrigido-fundo de Cep135 ou SAS6 em células RPE1 positivas para BrdU de pulso ou perseguição, quando centrossomas são espaçados (Figura 3A-D; 'close' células distância onde média entre dois centrossomas é inferior a 2 um). Por conseguinte, o nível normalizado SAS6 permaneceu semelhante nestas células (Figura 3E). No entanto, observou-se um aumento modesto nos valores globais de intensidade de fluorescência de SAS6 e um ligeiro aumento do mesmo para Cep135 em células onde centrossomas são bem separados (distância entre dois centrossomas> 2 m; células "distante"). Por conseguinte, o nível total de centrosomal normalizada SAS6 em células com dois centrossomas bem separados foi ligeiramente, mas significativamente maior do que em células com os centrossomas espaçados. Isto é provavelmente devido à regulação inerente SAS6 nível with progressão do ciclo celular 5. No entanto, é também possível que os aumentos ligeiros (que ou menor de significância estatística) é devido à adição de intensidades de fluorescência das duas centrossomas que foram analisados ​​separadamente, em comparação com a análise de duas centrossomas, ao mesmo tempo em células com os centrossomas espaçados. No entanto, quando a intensidade de fluorescência de VDAC3 foi normalizada para a da SAS6 sozinho, o nível VDAC3 em dois centrossomas espaçados foi aumentada aproximadamente 1,5 vezes em células que estão na fase tardia S-G2 precoce /, em comparação com a fase S precoce células (Figura 4A-C, F, CÉLULAS "fechar"). Quando estas células progridem para fase tardia G2, o nível VDAC3 normalizada em dois centrossomas foi reduzida em 2,4 vezes em relação ao que no final da fase S (Figura 4C, F).

Porque os níveis SAS6 aumentar ligeiramente a partir do final da fase S para G2, utilizando SAS6 como um padrão interno leva a uma ligeira sobreavaliação do decrease em níveis VDAC3 em células em fase G2 tardia (centrossomas são separados por mais do que 2 mm). Enquanto os nossos dados sugerem que Cep135 é uma escolha melhor como padrão interno para avaliar as variações do ciclo celular, não podemos usá-lo para VDAC3 porque os anticorpos VDAC3 e Cep135 disponíveis para nós são ambos de coelho. No entanto, multiplicando-se o valor médio para VDAC3 SAS6 normalizada (F VDAC3 / F SAS6) pelo valor médio de Cep135-normalizado SAS6 nos dá um valor aproximado para VDAC3 Cep135 normalizada [(F VDAC3 / F SAS6) x (F SAS6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Quando realizamos esta análise, a alteração dos níveis VDAC3 entre o final S / G2 precoce e tardia G2 cai um pouco a 2 vezes. Células positivas para BrdU que estão em qualquer fase da mitose como julgado por cromossomos condensados ​​e fraca coloração SAS6 são excluídos da nossa análise, devido à queda dramática nos níveis SAS6. No entanto, observamos que o VDAC3 centrosomal nível reneceu baixo durante a mitose (dados não mostrados). Porque os níveis Cep135 não cair durante a mitose (dados não mostrados), que pode, em princípio, repetir o procedimento de re-normalização para estimar os níveis VDAC3 Cep135-normalizados em mitose. No entanto, na realidade, os níveis SAS6 centrosomal na mitose eram muito variável para permitir uma determinação precisa dos níveis VDAC3 SAS6 normalizados em primeiro lugar. Independentemente disso, em geral, os nossos dados verificou-se que a associação de centrosomal VDAC3 é regulada a centrossomas durante o ciclo celular.

Figura 1. De forma assíncrona crescentes RPE1 células foram incubadas com BrdU e MG115 (MG) ​​ou DMSO (DM) durante 4 horas. (A) São mostrados campos aleatórios de DMSO ou MG115 tratados células coradas com anticorpo anti-BrdU (vermelho) e Hoechst ( DNA; azul). Aqui e em todas as outras imagens da barra representam 5 m.(SER) ou DMSO MG115 tratado as células foram coradas com anticorpos contra VDAC3, γ-tubulina e BrdU. Células positivas para BrdU foram fotografadas em condições idênticas de imagem (exposição vezes- 400 ms para azul fluorophore / BrdU; 500 ms para verde fluorophore / VDAC3; 300 ms para fluorophore vermelho / γ-tubulina), eo fundo corrigidos intensidades de fluorescência de VDAC3 e γ-tubulina foram determinados. Imagens representativas mostrando VDAC3 (VD3; verde), γ-tubulina (γ Banheira; vermelho) e BrdU (azul) são mostrados em (B). Aqui e em todas as outras imagens, inserir digitalmente mostram ampliada centrosomes como indicado pelas praças. As intensidades de fluorescência de fundo corrigido (F; em unidades arbitrárias) correspondentes a VDAC3 e γ-tubulina de vinte cinco células são representados graficamente na caixa e suiça diagrama em (C) e (D), respectivamente. Aqui e em todos os outros casos, caixas representam inferior e quartil superior, o marker na caixa (-) indica a mediana de cada série, e os bigodes representam os valores mínimos e máximos. Os valores da intensidade de fluorescência de VDAC3 normalizados provenientes dos vinte e cinco células estão representados em (E). Para (CE), o valor de p é derivado desemparelhado t-teste. *** Indica p <10 -5, e ns indica p> 0,05. (F) Immunoblots mostrando os níveis de células inteiras de VDAC3 (ambos VDAC3a e VDAC3b 16) e γ-tubulina (γ-banheira), onde α-tubulina (α-banheira) está carregando controle. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Assincronamente crescentes células RPE1 que foram marcadas com um 4 hr BrdU pulso e perseguido por mais 4 h na ausência de BrdU foram marcadas com anticorpos contra SAS6 (verde) e γ-tubulina (γ Banheira; vermelho). Imagens representativas mostrar coloração SAS6 durante (A) S-fase (com dois perto SAS6 focos), (B) metaphase (dois fraco focos SAS6 nos pólos) e (C) telophase (focos SAS6 são perdidos a partir dos pólos). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Células positivas para BrdU Figura 3. Assincronamente crescentes células RPE1 foram marcadas com um pulso de BrdU 4 horas e perseguido por mais 4 h na ausência de BrdU. Coradas para Cep135 e SAS6 foram fotografadas em condições idênticas de imagem (exposição vezes- 400 mspara o azul fluorophore / BrdU; 400 ms para fluorophore verde / Cep135; Foram determinados a 500 ms para fluorophore vermelho / SAS6), eo fundo corrigido fluorescência intensidades de SAS6 e Cep135. A distância entre dois centrossomas também foi medido em todas as células. A cela onde a distância entre dois centrossomas é inferior a 2 mm foi considerado como "fechar" e onde o valor é mais do que 2 mm foi categorizado como "distante". (AB) Imagens representativas mostrando Cep135 (C135; verde), SAS6 (vermelho) e BrdU (azul) são mostrados. Em (B), C1 e C2 são as duas centrossomas da célula representativa "distante". (CD) As intensidades de fluorescência de fundo corrigido (F; em unidades arbitrárias) correspondente a SAS6 (C) e Cep135 (D) a partir de quinze células de cada categoria estão representados em diagrama e caixa de bigodes. (E) intensidades normalizadas de SAS6 from essas células são plotadas em caixa e diagrama suiça. Para (CE), o valor de p é derivado desemparelhado t-teste. * Indica 0,001 <p <0,05, e ns indica p> 0,05. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. células BrdU-positivos do ensaio de pulso-chase BrdU acima (Figura 3) corada para VDAC3 e SAS6 foram fotografadas em condições idênticas de imagem (exposição vezes- 400 ms para azul fluorophore / BrdU; 500 ms para fluorophore verde / SAS6; foram determinados 1.000 ms para vermelho fluorophore / VDAC3), eo fundo corrigido fluorescência intensidades de SAS6 e VDAC3. A distância entre dois centrossomas foi medida em todas as células, e as células foram classificados como "cperder "(a distância entre dois centrossomas <2 mm) e" distante "(a distância entre dois centrossomas> 2 m), como na Figura 3. (AC) Imagens representativas de 'close' célula em BrdU de pulso (A), em chase BrdU (B), e células "distante" em BrdU perseguição (C) corada para VDAC3 (VD3; verde), SAS6 (vermelho) e BrdU (azul) são mostrados. Em (C), C1 e C2 são as duas centrossomas. [DE] As intensidades de fluorescência de fundo corrigido (F; em unidades arbitrárias) correspondentes a VDAC3 (D) e SAS6 (E) a partir de quinze células de cada categoria estão representados em diagrama e caixa de bigodes. (F) intensidades normalizadas de VDAC3 partir dessas células são plotadas em caixa e diagrama suiça. Para (DF), o valor de p é derivado desemparelhado t-teste. *** Indica p <-5 10, **indica 10 -5 <p <0,001, e ns indica p> 0,05. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.