Este protocolo envolve procedimentos detalhados para isolamento de células derivadas de urina de pacientes com distrofia muscular; sua reprogramação eficiente e rápida através da transdução do vírus Sendai.
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Artigo de método
Geração de pluripotentes induzidas células-tronco de distrofia muscular pacientes: Reprogramação livre de integração eficiente de urina células derivadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Cardiomiopatia distrófica é uma consequência pouco compreendido de distrofia muscular. Geração de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) de pacientes com distrofia muscular é uma fonte inestimável para celular in vitro sistemas modelo doença e pode ser usado para estudos de pesquisa de fármacos. Células derivadas de urina de doentes foram utilizadas na reprogramação em células estaminais pluripotentes induzidas, a fim de modelar cardiomiopatia distrófica 1. Responder às preocupações de segurança de integração de sistemas de vectores, apresentamos um protocolo usando um Sendai vetor do vírus não-integração para a transdução de Yamanaka fatores em células de urina coletadas de pacientes com distrofia muscular. Este protocolo gera clones totalmente reprogramado dentro de 2-3 semanas. As células pluripotentes são livres do vetor por passagem-13. Essas iPSCs distróficos podem se diferenciar em cardiomiócitos e usado tanto para estudar mecanismos de doença ou para o rastreio de drogas.
Introdução
Cardiomiopatia é a segunda principal causa de morte em pacientes com distrofia muscular de Duchenne e Becker (MD). Embora as mutações no gene da distrofina ligada a X ocorrer em 1: 3500 nascimentos do sexo masculino, muito pouco se sabe sobre os eventos moleculares e celulares que levam a lesão do músculo cardíaco progressivo. As células estaminais pluripotentes humanas induzida derivadas de pacientes com distrofia muscular emergiram como uma nova ferramenta para o estudo dos mecanismos patológicos subjacentes e usar-se para o rastreio de drogas 1,2.
O desconforto antecipada de biópsias de pele ou amostras de sangue pode dissuadir jovens pacientes e / ou seus responsáveis para dar o seu consentimento para participação no estudo. As amostras de urina são uma fonte não-invasivo de células somáticas que são alteráveis a métodos de reprogramação. Mostrámos recentemente que células de urina colhidas de pacientes com distrofia muscular podem ser cultivadas eficientemente e reprogramado em iPSCs utilizando transdução retroviral com os factores (YamanakaOCT3 / 4, Sox2, KLF4, e c-Myc; OSKM) 1. A desvantagem de entrega de genes retrovirais é a integração aleatória de genes de reprogramação em cromossomas hospedeiros. Para superar essa limitação, temos usado o vírus não-integração Sendai para a reprogramação celular urina.
Este protocolo detalha a reprogramação vírus Sendai de células isoladas de urina de pacientes com distrofia muscular, que pode então ser diferenciadas em cardiomiócitos e outros tipos de células para um estudo mais aprofundado. Este protocolo pode também ser adaptado para outras doenças específicas de pacientes.
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Protocolo
NOTA: Os pacientes e / ou seus responsáveis devem dar consentimento informado para participar de um Comitê de Ética aprovou estudo.
1. Os tampões e Preparações Mídia
- Tampão de lavagem: Para preparar 100 ml de tampão de lavagem, adicionar 1 ml de caneta 100x / Solução strep (100 U / ml de penicilina + 100 ug / ml de estreptomicina) a 99 ml de solução salina de tampão fosfato (PBS).
- Urinária Progenitor Cell (UPC) Medium: Para preparar o meio UPC, misturar volumes iguais de Keratinocyte Serum Livre (KSF) Medium + Progenitor Medium Cell.
- KSF Médio: Para preparar o meio de queratinócitos, adicionam-se 5 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF), 50 ng / ml de extracto de pituitária de bovino (BPE), 30 ng / ml de toxina da cólera, e solução de pen / strep (100 L / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina) para 500 ml de meio de KSF.
- Medium Progenitor Cell: Adicione três trimestres de DMEM com um quarto de mídia Ham-F12 e suplementar com 10% FBS, 0,4 ug / ml de hidrocortisona, 0,1nM de toxina da cólera, 5 ng / ml de insulina, 1,8 x 10 ~ 4 M de adenina, 5 ug / ml de transferrina, 2 x 10 -9 M tironina triiodo, 10 ng / ml de EGF, e pen / strep solução.
- hES Médio: Adiciona-se 20% de substituição KO-soro (K-SR), aminoácidos não essenciais 1x MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 uM β-mercaptoetanol, 20 ng / ml de bFGF e pen / strep a 400 ml de DMEM / F12.
Coleta de Amostras 2. Urina
- Instrua os pacientes a beber líquidos 30 minutos antes da coleta de urina para garantir que uma quantidade adequada (30-40 ml) de urina podem ser coletadas.
- Dê os pacientes e / ou seus responsáveis um kit de coleta de urina contendo os seguintes itens: (1) as instruções escritas sobre como obter estéril ou limpo amostra de urina captura, (2) toilettes anti-bacterianas úmidos, e (3) a 100 ml estéril espécime copo de coleta. Instruir os pacientes para coletar amostra.
- Imediatamente coloque as amostras de urina no gelo e transferir para o laboratory em um refrigerador. Processar a urina para o isolamento de células imediatamente. Se um atraso for inevitável, armazenar as amostras em gelo por até 4 horas com mínima perda de viabilidade celular.
3. Isolamento e expansão de células de urina
NOTA: Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica.
- Utilizando pipetas estéreis, amostras de urina de transferência estéril para tubos de centrifugação de 50 ml. Centrifuga-se a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml no tubo; ter cuidado para não perturbar o pellet celular.
- Ressuspender e combinar os peletes a partir de múltiplos tubos em 7 ml de tampão de lavagem e repetir a centrifugação a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando o sedimento celular e ~ 0,2-0,5 mL de sobrenadante. Ressuspender em 2-3 ml de células progenitoras urinário (UPC) médio e transferir a suspensão em 4-6 poços de uma unrevestido placa de 24 poços.
- Após 72 h, completar a cultura com 0,5 ml de meio fresco UPC por cavidade e alterar meio cada 2-3 dias depois. Os eritrócitos e células escamosas que não ligam para a chapa será removida com o meio de mudanças.
- Monitorar cultura após 4-6 dias.
Nota: Pequenas 2-4 colônias de células vão começar a aparecer. As células serão arredondadas ou alongadas que representam tipo I ou II do epitelial renal (RE) de células, respectivamente 3. - Mudar a forma a cada 2-3 dias desde uma vez que as células aparecem, eles passarão por uma fase de rápida expansão.
- Uma vez que as células atingem 80-90% de confluência, cerca de 9-15 dias após o plaqueamento, dissociam-se e passagem das células (15,000-18,000 células / cm2) em 04/02 poços de placa de 24 poços para uma maior expansão. Marcar como passagem célula 1 (P1).
- Caracterizar as células de urina para obter as especificações de linhagem por meio da análise de citometria de fluxo, immunohistochemcoloração idêntica ou através da reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR).
- Reprogramar células de urina isoladas (seção 4) ou congelá-los para baixo em Congelamento Medium (DMEM suplementado com 10% de soro e 10% DMSO) para cryostorage longo prazo.
4. Urina reprogramação celular Usando Sendai Virus
NOTA: O tratamento adequado eo uso de EPI (equipamento de proteção individual) é recomendada durante a manipulação dos agentes de transfecção. Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica. O descarte adequado de transfecção de células de agente e / ou transfectadas é recomendado para evitar o risco de riscos ambientais e de saúde. Para urina reprogramação celular, use um Sendai Reprogramação Kit com modificações para protocolo dependente de alimentador do fabricante, conforme detalhado abaixo.
- Para garantir alta eficiência reprogramação utilizando o vírus Sendai, uso de passagens 1-5 de células de urina que são rápidosly dividindo. Se as células não se replicam bem ou se tornam senescentes, descartá-los, pois não vai reprogramar eficiente.
- Semente de 60.000 células por poço em dois poços de uma placa de 6 poços. Marcar como Dia -2. Ajustar densidade de sementeira de células (5 x 04-09 outubro 4 x 10 células por cavidade), conforme necessário para atingir 80-90% de confluência por Dia 0.
- No Dia 0 (48 h após o plaqueamento das células), preparar os vectores de reprogramação Sendai (SEV), contendo cada um dos quatro factores OSKM. Adicionar a cada um dos vectores de 1 ml de meio pré-aquecido a UPC. Utilize uma MOI de 1-1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), que é suficiente para as células de urina reprogramação. Aspirar o meio e adiciona-se lentamente a 1 ml UPC + SeV para um poço de células de urina. Utilize a segunda bem como o controlo negativo transdução.
- No dia 1, substituir o meio UPC + SeV com meio UPC fresco. Alguns morte celular é observada após 24 h devido a citotoxicidade virai.
- Dependendo da eficiência do clon reprogramadoe formações e a morfologia compacta, ficar mudando o meio dia até dia 6 ou 7.
- Um dia antes da dissociação de células transduzidas (5 ou 6 dias), para preparar as placas alimentadoras MEF por plaqueamento de mitomicina-C (10 ug / ml durante 3 horas) MEFs-tratados com uma densidade de 5 x 10 4 células / cm 2, em 0,1 % de gelatina revestidas placas de 100 mm 2 de cultura.
- No dia seguinte (dia 6 ou 7), dissociar as células com tripsina a 0,25%, ressuspender as células em meio de UPC e placa 5 x outubro 4-2 x 10 5 células / 100 mm 2 MEF alimentador de placas.
- No dia seguinte, mudar para o meio-tronco embrionárias humanas e mudar o meio de todos os dias. Observe as células em um microscópio para monitorar as células transformadas.
NOTA: As células formam agregados clonais com morfologia característica de paralelepípedos e ter maior núcleo à relação citoplasmática (12-18 dias após a transdução). - Dentro de duas a três semanas após a transdução, escolher colônias e transferir para novas placas para clonexpansão ai.
- Realização da coloração de células vivas para a selecção de clones de IPSC por incubação das células com anticorpo TRA-1-81 durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de CO2, seguido de coloração com corante fluorescente contador específica do anticorpo secundário conjugado durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de CO 2.
- Use a 26 G 1½ polegada agulha para cross-chocar os maiores TRA-1-81 clones IPSC positivos em pequenos pedaços de tamanhos iguais (4-6 peças por clone).
- Use uma pipeta estéril-ponta para pegar e transferência 10-20 peças cross-eclodidos de vários clones em cada poço de Matrigel (10 g / cm 2) -Revestido placa de 24 poços com meio-tronco embrionárias humanas.
NOTA: As partes de um único clone banhado individualmente em um único bem não expandir ou manter pluripotência. - Mudar a forma de hES iPSC 24-48 h, depois os clones reprogramadas estão ligados à superfície de Matrigel.
- Durante a manutenção em placas Matrigel-revestidos, manualmente SCRAPE-off quaisquer células diferenciadas ou contaminantes células alimentadoras MEF utilizando uma pipeta-ponta para enriquecer iPSC (MD-IPSC) clones distróficos totalmente reprogramadas e pluripotentes.
- Depois de clones individuais alcançaram ~ 100 mm de tamanho, expandir os clones dissociando com EDTA 0,48 mM (ácido etilenodiaminotetracético) solução para 3 min e plaqueamento agregados de células pequenas de MD-iPSCs suspensas em meio iPSC (suplementado com 5? M Y27632, Rho Kinase inibidor ) em matrigel fresco (10? g / cm 2) revestido placa de 12 poços. Alterar médio iPSC diária.
- Reprogramação completa de cada clone pode ser determinado tanto por análise de genes OSKM e coloração imuno-histoquímica de marcadores de pluripotência (OCT3 / 4 e TRA-1-81) a expressão do gene. Uma avaliação rigorosa do potencial de pluripotência deve ser empregada para confirmar linhas de IPSC totalmente reprogramadas podem se diferenciar em três camadas germinativas. Isto pode ser realizado tanto por corpo embrióides (EB), ensaio de formação e diferenciação ou um terensaio de formação de atoma.
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Resultados
A maioria das células progenitoras isoladas a partir de urina humana são positivos para progenitoras e pericitos uroepiteliais marcadores tais como CD44, CD73, CD146 e (97,37%, 97,09% e 97,3%, respectivamente; Figura 1A e 1B). Estas células também expressaram outros marcadores mesenquimais, tais como alfa-actina do músculo liso e vimentina (Figura 1B). A análise por RT-PCR proporciona a evidência de uma população mista de células nas culturas em que há expressão fraca d...
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Discussão
Modelando doenças cardiovasculares usando iPSCs está se tornando uma abordagem comum para compreender a contribuição genética 4-6. Algumas dificuldades imprevistas de obtenção de amostras de células de pacientes, especialmente crianças pequenas, pode ser evitada, oferecendo a opção de uma abordagem não-invasiva, como uma coleta de urina. Nessa população jovem paciente, muitas vezes é difícil coletar um volume de urina suficiente para produzir células de urina suficiente para a reprogramação. Treinando os paci...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O desenvolvimento deste protocolo foi apoiado pelo Advancing a Healthier Wisconsin e pelo National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, por meio do número de concessão 8UL1TR000055. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4 Oz. Copo de Amostra com Tampa | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | Para Coleta de Amostras de Urina |
| Tubos BD-Falcon de 15 ml Tubos BD-Falcon | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml | Fisher Scientific | 352098 | |
| Lamínulas de Vidro Redondas | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Kit de Reprogramação CytoTune-iPS Sendai | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep sem Glutamina | Life Technologies | 15140-122 | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| RPMI Médio 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso |
| Suplemento B-27 com Insulina (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| Suplemento B-27 sem Insulina (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 ° C banho-maria antes do uso |
| bFGF (10 µ g) | Life Technologies | 13256-029 | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| Cartuchos de Contador de Células | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Garrafa) | Life Technologies | 10828-028 | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| Congelamento de Cultura de Células de Recuperação Médio | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar |
| DMEM, Alta Glicose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Quente em 37 ° C banho-maria antes |
| de usar Mistura de Nutrientes F-12 da Ham | Life Technologies | 11765-054 | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| EGF Proteína Humana Recombinante, Forma Líquida | Life Technologies | PHG0311L | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| Insulina, Recombinante Humana, Zinco Soln | Life Technologies | 12585-014 | Quente em 37 ° C banho-maria antes |
| do uso TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar |
| Inibidor de ROCK (Y-27632) | Selleck | S1049 | Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Kit de Síntese de cDNA iScript | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 ° C banho-maria antes do uso |
| Biorreagente de Adenina | Sigma Aldrich | A2786-5G | Quente em 37 ° C banho-maria antes |
| de usar Toxina da cólera de Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| Hidrocortisona | Sigma Aldrich | H0888-1G | Quente em 37 ° C banho-maria antes |
| do uso Holo-transferrina de humano | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous meio de montagem Sigma | Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldeído | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Anticorpos | |||
| Mouse anti CD44 - marcado com FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - marcado com PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - marcado com PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-&alfa;-liso músculo actina | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentina | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Coelho anti Out 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Distrofina | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
Referências
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- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
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- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504(2011).
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Reimpressões e permissões
