Artigo de método

Geração de pluripotentes induzidas células-tronco de distrofia muscular pacientes: Reprogramação livre de integração eficiente de urina células derivadas

DOI:

10.3791/52032

⸱

28 de janeiro de 2015

 , 
1Department of Medicine, Medical College of Wisconsin

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo envolve procedimentos detalhados para isolamento de células derivadas de urina de pacientes com distrofia muscular; sua reprogramação eficiente e rápida através da transdução do vírus Sendai.

Resumo

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Cardiomiopatia distrófica é uma consequência pouco compreendido de distrofia muscular. Geração de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) de pacientes com distrofia muscular é uma fonte inestimável para celular in vitro sistemas modelo doença e pode ser usado para estudos de pesquisa de fármacos. Células derivadas de urina de doentes foram utilizadas na reprogramação em células estaminais pluripotentes induzidas, a fim de modelar cardiomiopatia distrófica 1. Responder às preocupações de segurança de integração de sistemas de vectores, apresentamos um protocolo usando um Sendai vetor do vírus não-integração para a transdução de Yamanaka fatores em células de urina coletadas de pacientes com distrofia muscular. Este protocolo gera clones totalmente reprogramado dentro de 2-3 semanas. As células pluripotentes são livres do vetor por passagem-13. Essas iPSCs distróficos podem se diferenciar em cardiomiócitos e usado tanto para estudar mecanismos de doença ou para o rastreio de drogas.

Introdução

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Cardiomiopatia é a segunda principal causa de morte em pacientes com distrofia muscular de Duchenne e Becker (MD). Embora as mutações no gene da distrofina ligada a X ocorrer em 1: 3500 nascimentos do sexo masculino, muito pouco se sabe sobre os eventos moleculares e celulares que levam a lesão do músculo cardíaco progressivo. As células estaminais pluripotentes humanas induzida derivadas de pacientes com distrofia muscular emergiram como uma nova ferramenta para o estudo dos mecanismos patológicos subjacentes e usar-se para o rastreio de drogas 1,2.

O desconforto antecipada de biópsias de pele ou amostras de sangue pode dissuadir jovens pacientes e / ou seus responsáveis ​​para dar o seu consentimento para participação no estudo. As amostras de urina são uma fonte não-invasivo de células somáticas que são alteráveis ​​a métodos de reprogramação. Mostrámos recentemente que células de urina colhidas de pacientes com distrofia muscular podem ser cultivadas eficientemente e reprogramado em iPSCs utilizando transdução retroviral com os factores (YamanakaOCT3 / 4, Sox2, KLF4, e c-Myc; OSKM) 1. A desvantagem de entrega de genes retrovirais é a integração aleatória de genes de reprogramação em cromossomas hospedeiros. Para superar essa limitação, temos usado o vírus não-integração Sendai para a reprogramação celular urina.

Este protocolo detalha a reprogramação vírus Sendai de células isoladas de urina de pacientes com distrofia muscular, que pode então ser diferenciadas em cardiomiócitos e outros tipos de células para um estudo mais aprofundado. Este protocolo pode também ser adaptado para outras doenças específicas de pacientes.

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Protocolo

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NOTA: Os pacientes e / ou seus responsáveis ​​devem dar consentimento informado para participar de um Comitê de Ética aprovou estudo.

1. Os tampões e Preparações Mídia

  1. Tampão de lavagem: Para preparar 100 ml de tampão de lavagem, adicionar 1 ml de caneta 100x / Solução strep (100 U / ml de penicilina + 100 ug / ml de estreptomicina) a 99 ml de solução salina de tampão fosfato (PBS).
  2. Urinária Progenitor Cell (UPC) Medium: Para preparar o meio UPC, misturar volumes iguais de Keratinocyte Serum Livre (KSF) Medium + Progenitor Medium Cell.
    1. KSF Médio: Para preparar o meio de queratinócitos, adicionam-se 5 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF), 50 ng / ml de extracto de pituitária de bovino (BPE), 30 ng / ml de toxina da cólera, e solução de pen / strep (100 L / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina) para 500 ml de meio de KSF.
    2. Medium Progenitor Cell: Adicione três trimestres de DMEM com um quarto de mídia Ham-F12 e suplementar com 10% FBS, 0,4 ug / ml de hidrocortisona, 0,1nM de toxina da cólera, 5 ng / ml de insulina, 1,8 x 10 ~ 4 M de adenina, 5 ug / ml de transferrina, 2 x 10 -9 M tironina triiodo, 10 ng / ml de EGF, e pen / strep solução.
  3. hES Médio: Adiciona-se 20% de substituição KO-soro (K-SR), aminoácidos não essenciais 1x MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 uM β-mercaptoetanol, 20 ng / ml de bFGF e pen / strep a 400 ml de DMEM / F12.

Coleta de Amostras 2. Urina

  1. Instrua os pacientes a beber líquidos 30 minutos antes da coleta de urina para garantir que uma quantidade adequada (30-40 ml) de urina podem ser coletadas.
  2. Dê os pacientes e / ou seus responsáveis ​​um kit de coleta de urina contendo os seguintes itens: (1) as instruções escritas sobre como obter estéril ou limpo amostra de urina captura, (2) toilettes anti-bacterianas úmidos, e (3) a 100 ml estéril espécime copo de coleta. Instruir os pacientes para coletar amostra.
  3. Imediatamente coloque as amostras de urina no gelo e transferir para o laboratory em um refrigerador. Processar a urina para o isolamento de células imediatamente. Se um atraso for inevitável, armazenar as amostras em gelo por até 4 horas com mínima perda de viabilidade celular.

3. Isolamento e expansão de células de urina

NOTA: Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica.

  1. Utilizando pipetas estéreis, amostras de urina de transferência estéril para tubos de centrifugação de 50 ml. Centrifuga-se a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
  2. Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml no tubo; ter cuidado para não perturbar o pellet celular.
  3. Ressuspender e combinar os peletes a partir de múltiplos tubos em 7 ml de tampão de lavagem e repetir a centrifugação a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
  4. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando o sedimento celular e ~ 0,2-0,5 mL de sobrenadante. Ressuspender em 2-3 ml de células progenitoras urinário (UPC) médio e transferir a suspensão em 4-6 poços de uma unrevestido placa de 24 poços.
  5. Após 72 h, completar a cultura com 0,5 ml de meio fresco UPC por cavidade e alterar meio cada 2-3 dias depois. Os eritrócitos e células escamosas que não ligam para a chapa será removida com o meio de mudanças.
  6. Monitorar cultura após 4-6 dias.
    Nota: Pequenas 2-4 colônias de células vão começar a aparecer. As células serão arredondadas ou alongadas que representam tipo I ou II do epitelial renal (RE) de células, respectivamente 3.
  7. Mudar a forma a cada 2-3 dias desde uma vez que as células aparecem, eles passarão por uma fase de rápida expansão.
  8. Uma vez que as células atingem 80-90% de confluência, cerca de 9-15 dias após o plaqueamento, dissociam-se e passagem das células (15,000-18,000 células / cm2) em 04/02 poços de placa de 24 poços para uma maior expansão. Marcar como passagem célula 1 (P1).
  9. Caracterizar as células de urina para obter as especificações de linhagem por meio da análise de citometria de fluxo, immunohistochemcoloração idêntica ou através da reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR).
  10. Reprogramar células de urina isoladas (seção 4) ou congelá-los para baixo em Congelamento Medium (DMEM suplementado com 10% de soro e 10% DMSO) para cryostorage longo prazo.

4. Urina reprogramação celular Usando Sendai Virus

NOTA: O tratamento adequado eo uso de EPI (equipamento de proteção individual) é recomendada durante a manipulação dos agentes de transfecção. Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica. O descarte adequado de transfecção de células de agente e / ou transfectadas é recomendado para evitar o risco de riscos ambientais e de saúde. Para urina reprogramação celular, use um Sendai Reprogramação Kit com modificações para protocolo dependente de alimentador do fabricante, conforme detalhado abaixo.

  1. Para garantir alta eficiência reprogramação utilizando o vírus Sendai, uso de passagens 1-5 de células de urina que são rápidosly dividindo. Se as células não se replicam bem ou se tornam senescentes, descartá-los, pois não vai reprogramar eficiente.
  2. Semente de 60.000 células por poço em dois poços de uma placa de 6 poços. Marcar como Dia -2. Ajustar densidade de sementeira de células (5 x 04-09 outubro 4 x 10 células por cavidade), conforme necessário para atingir 80-90% de confluência por Dia 0.
  3. No Dia 0 (48 h após o plaqueamento das células), preparar os vectores de reprogramação Sendai (SEV), contendo cada um dos quatro factores OSKM. Adicionar a cada um dos vectores de 1 ml de meio pré-aquecido a UPC. Utilize uma MOI de 1-1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), que é suficiente para as células de urina reprogramação. Aspirar o meio e adiciona-se lentamente a 1 ml UPC + SeV para um poço de células de urina. Utilize a segunda bem como o controlo negativo transdução.
  4. No dia 1, substituir o meio UPC + SeV com meio UPC fresco. Alguns morte celular é observada após 24 h devido a citotoxicidade virai.
  5. Dependendo da eficiência do clon reprogramadoe formações e a morfologia compacta, ficar mudando o meio dia até dia 6 ou 7.
  6. Um dia antes da dissociação de células transduzidas (5 ou 6 dias), para preparar as placas alimentadoras MEF por plaqueamento de mitomicina-C (10 ug / ml durante 3 horas) MEFs-tratados com uma densidade de 5 x 10 4 células / cm 2, em 0,1 % de gelatina revestidas placas de 100 mm 2 de cultura.
  7. No dia seguinte (dia 6 ou 7), dissociar as células com tripsina a 0,25%, ressuspender as células em meio de UPC e placa 5 x outubro 4-2 x 10 5 células / 100 mm 2 MEF alimentador de placas.
  8. No dia seguinte, mudar para o meio-tronco embrionárias humanas e mudar o meio de todos os dias. Observe as células em um microscópio para monitorar as células transformadas.
    NOTA: As células formam agregados clonais com morfologia característica de paralelepípedos e ter maior núcleo à relação citoplasmática (12-18 dias após a transdução).
  9. Dentro de duas a três semanas após a transdução, escolher colônias e transferir para novas placas para clonexpansão ai.
  10. Realização da coloração de células vivas para a selecção de clones de IPSC por incubação das células com anticorpo TRA-1-81 durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de CO2, seguido de coloração com corante fluorescente contador específica do anticorpo secundário conjugado durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de CO 2.
  11. Use a 26 G 1½ polegada agulha para cross-chocar os maiores TRA-1-81 clones IPSC positivos em pequenos pedaços de tamanhos iguais (4-6 peças por clone).
  12. Use uma pipeta estéril-ponta para pegar e transferência 10-20 peças cross-eclodidos de vários clones em cada poço de Matrigel (10 g / cm 2) -Revestido placa de 24 poços com meio-tronco embrionárias humanas.
    NOTA: As partes de um único clone banhado individualmente em um único bem não expandir ou manter pluripotência.
  13. Mudar a forma de hES iPSC 24-48 h, depois os clones reprogramadas estão ligados à superfície de Matrigel.
  14. Durante a manutenção em placas Matrigel-revestidos, manualmente SCRAPE-off quaisquer células diferenciadas ou contaminantes células alimentadoras MEF utilizando uma pipeta-ponta para enriquecer iPSC (MD-IPSC) clones distróficos totalmente reprogramadas e pluripotentes.
  15. Depois de clones individuais alcançaram ~ 100 mm de tamanho, expandir os clones dissociando com EDTA 0,48 mM (ácido etilenodiaminotetracético) solução para 3 min e plaqueamento agregados de células pequenas de MD-iPSCs suspensas em meio iPSC (suplementado com 5? M Y27632, Rho Kinase inibidor ) em matrigel fresco (10? g / cm 2) revestido placa de 12 poços. Alterar médio iPSC diária.
  16. Reprogramação completa de cada clone pode ser determinado tanto por análise de genes OSKM e coloração imuno-histoquímica de marcadores de pluripotência (OCT3 / 4 e TRA-1-81) a expressão do gene. Uma avaliação rigorosa do potencial de pluripotência deve ser empregada para confirmar linhas de IPSC totalmente reprogramadas podem se diferenciar em três camadas germinativas. Isto pode ser realizado tanto por corpo embrióides (EB), ensaio de formação e diferenciação ou um terensaio de formação de atoma.

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Resultados

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A maioria das células progenitoras isoladas a partir de urina humana são positivos para progenitoras e pericitos uroepiteliais marcadores tais como CD44, CD73, CD146 e (97,37%, 97,09% e 97,3%, respectivamente; Figura 1A e 1B). Estas células também expressaram outros marcadores mesenquimais, tais como alfa-actina do músculo liso e vimentina (Figura 1B). A análise por RT-PCR proporciona a evidência de uma população mista de células nas culturas em que há expressão fraca d...

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Discussão

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Modelando doenças cardiovasculares usando iPSCs está se tornando uma abordagem comum para compreender a contribuição genética 4-6. Algumas dificuldades imprevistas de obtenção de amostras de células de pacientes, especialmente crianças pequenas, pode ser evitada, oferecendo a opção de uma abordagem não-invasiva, como uma coleta de urina. Nessa população jovem paciente, muitas vezes é difícil coletar um volume de urina suficiente para produzir células de urina suficiente para a reprogramação. Treinando os paci...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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O desenvolvimento deste protocolo foi apoiado pelo Advancing a Healthier Wisconsin e pelo National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, por meio do número de concessão 8UL1TR000055. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materials
4 Oz. Copo de Amostra com TampaSTL Medical SupplyM9AMSAS340Para Coleta de Amostras de Urina
Tubos BD-Falcon de 15 ml Tubos BD-FalconFisher Scientific352097
50 mlFisher Scientific352098
Lamínulas de Vidro RedondasFisher Scientific12-545-81
Kit de Reprogramação CytoTune-iPS SendaiLife TechnologiesA1378-001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023
Pen-Strep sem Glutamina Life Technologies15140-122Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
RPMI Médio 1640Life Technologies11875-093Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso
Suplemento B-27 com Insulina (50x)Life Technologies17504-044Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Suplemento B-27 sem Insulina (50x)Life Technologies0050129SAQuente em 37 ° C banho-maria antes do uso
DMEM/F12 (1:1)Life Technologies11330-032Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso
Versene, 1:5,000Life Technologies15040066Warm in 37 ° C banho-maria antes do uso
bFGF (10 µ g)Life Technologies13256-029Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Cartuchos de Contador de CélulasLife TechnologiesC10228
Knockout Serum (500  ml Garrafa)Life Technologies10828-028Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Congelamento de Cultura de Células de Recuperação MédioLife Technologies12648-010
Keratinocyte-SFM (1x), LiquidLife Technologies17005-042Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar
DMEM, Alta Glicose, GlutamaxLife Technologies10566-016Quente em 37 ° C banho-maria antes
de usar Mistura de Nutrientes F-12 da Ham Life Technologies11765-054Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
EGF Proteína Humana Recombinante, Forma LíquidaLife TechnologiesPHG0311LQuente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Insulina, Recombinante Humana, Zinco SolnLife Technologies12585-014Quente em 37 ° C banho-maria antes
do uso TeSR-E8Stem Cell Technologies5940Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar
Inibidor de ROCK (Y-27632)SelleckS1049Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso
MatrigelBD Biosciences354277hESC Qualified Matrix, LVED Free
RNeasy Mini Kit Qiagen74104
Kit de Síntese de cDNA iScriptBio-Rad170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Thermo-ScientificK1081
FBS-QualifiedSigma AldrichF6178Warm in 37 ° C banho-maria antes do uso
Biorreagente de AdeninaSigma AldrichA2786-5GQuente em 37 ° C banho-maria antes
de usar Toxina da cólera de Vibrio choleraeSigma AldrichC8052-.5MGQuente em 37 ° C banho-maria antes do uso
HidrocortisonaSigma AldrichH0888-1GQuente em 37 ° C banho-maria antes
do uso Holo-transferrina de humanoSigma AldrichT0665-50MGQuente em 37 ° C banho-maria antes do uso
3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium saltSigma AldrichT6397-100MGQuente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso
DAPI Santa Cruz BiotechnologySC-3598
Fluoromount Aquous meio de montagem SigmaAldrichF4680
16% ParaformaldeídoAlfa-Aesar43368
Anticorpos
Mouse anti CD44 - marcado com FITC BD Biosciences560977
Mouse anti CD146 - marcado com PEBD Biosciences561013
Mouse anti CD73 - marcado com PEBD Biosciences561014
Mouse anti-&alfa;-liso músculo actinaSigma AldrichA2547
Mouse anti-VimentinaAbcamab8978-100
Mouse Anti - TRA-1-81Life Technologies411100
Coelho anti Out 3/4Santa Cruz BiotechnologySC-9081
Mouse Anti DistrofinaLeica BiosystemsNCL-DYSB

Referências

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