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Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

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DOI:

10.3791/52036

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30 de agosto de 2014

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1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Universidad de la República, 2Present Affiliation: Trinity Biomedical Science Institute, Trinity College Dublin

Neste artigo

Resumo

O presente trabalho ilustra a conveniência do uso da imunoterapia sublingual para aumentar a resposta imune inata nos pulmões e conferir proteção contra pneumonia pneumocócica aguda em camundongos.

Resumo

A via sublingual tem sido amplamente utilizada para entregar pequenas moléculas na corrente sanguínea e modular a resposta imune em diferentes locais. Demonstrou-se que induz efetivamente respostas humorais e celulares em locais sistêmicos e mucosos, ou seja, pulmões e trato urogenital. A vacinação sublingual pode promover proteção contra infecções no trato respiratório inferior e superior; Também pode promover tolerância a alérgenos e melhorar os sintomas da asma. A modulação da resposta imune pulmonar por imunoterapia sublingual (ITSL) é mais segura do que a administração direta de formulações por via intranasal, pois não requer a entrega de moléculas potencialmente nocivas diretamente nas vias aéreas. Em contraste com a administração intranasal, os efeitos colaterais envolvendo toxicidade cerebral ou paralisia facial não são promovidos pela ITSL. Os mecanismos imunológicos subjacentes à ITSL permanecem indescritíveis e seu uso para o tratamento de infecções pulmonares agudas ainda não foi explorado. Assim, o desenvolvimento de modelos animais apropriados de SLIT é necessário para explorar ainda mais suas vantagens potenciais.

Este trabalho mostra como realizar a administração sublingual de agentes terapêuticos em camundongos para avaliar sua capacidade de proteção contra pneumonia pneumocócica aguda. Aspectos técnicos do manuseio de camundongos durante a inoculação sublingual, identificação precisa da mucosa sublingual, drenagem de linfonodos e isolamento de tecidos, lavagem broncoalveolar e pulmões são ilustrados. Os protocolos para preparação de suspensão de célula única para análise FACS são descritos em detalhes. Outras aplicações a jusante para a análise da resposta imune são discutidas. Aspectos técnicos da preparação do inóculo de Streptococcus pneumoniae e do desafio intranasal de camundongos também são explicados.

SLIT é uma técnica simples que permite a triagem de moléculas candidatas para modular a resposta imune dos pulmões. Os parâmetros que afetam o sucesso do SLIT estão relacionados ao tamanho molecular, suscetibilidade à degradação e estabilidade de formulações altamente concentradas.

Introdução

O objetivo geral deste trabalho é ilustrar os benefícios da imunoterapia sublingual para o tratamento de infeções respiratórias agudas (IRA) e apresentar as vantagens desta via de administração em comparação com outras vias de administração, nomeadamente intranasal.

ARI causam milhões de mortes todos os anos, especialmente em crianças menores de cinco anos. O Streptococcus pneumoniae permanece como um dos principais agentes etiológicos da pneumonia bacteriana em lactentes eidosos1,2. Até o momento, o principal tratamento disponível depende do uso de antibióticos, mas cepas resistentes estão surgindo continuamente3,4.

SLIT induz respostas amplas em nível sistêmico e também mucoso, particularmente no trato respiratório5. Tem eficácia comprovada contra a infecção por influenza, promovendo proteção a longo prazo com produção de respostas humorais e celulares6,7. Além disso, foi demonstrado que o tratamento profilático com lisados bacterianos administrados por via sublingual reduziu as exacerbações da bronquite obstrutiva crônica em idosos8 e preveniu infecções respiratórias recorrentes em crianças9. A SLIT tem sido amplamente utilizada para o tratamento de alergias e asma. Estudos clínicos não apenas demonstraram sua eficácia para modular a resposta imune no trato respiratório, mas também sua segurança10. Apesar do crescente interesse de empresas farmacêuticas e pesquisadores em SLIT, os mecanismos envolvidos na indução de respostas imunes da mucosa após a entrega sublingual de compostos permanecem obscuros. Recentemente, a atenção tem se concentrado nos mecanismos que promovem a tolerância associada à dessensibilização a alérgenos. Tem sido proposto que células residentes e recrutadas na mucosa sublingual, como células dendríticas e macrófagos, podem promover tolerância após SLIT11-13. As células dendríticas da mucosa oral podem promover células T auxiliares produtoras de IFN-gama e IL-1011, bem como recircular para a mucosa genital distal e promover células T CD8+ 14. No entanto, pouco se sabe sobre o impacto da ITSL nas células inatas ou sua capacidade de melhorar a depuração do patógeno durante infecções respiratórias agudas.

O controle natural da infecção pneumocócica nos pulmões depende muito da ativação eficiente e rápida das defesas inatas locais. Mostramos anteriormente que o aumento da imunidade inata dos pulmões por uma única dose intranasal de flagelina (FliC), um agonista TLR5 e NLRC4, protege 75-100% dos camundongos desafiados com uma dose letal de um isolado clínico de Streptococcus pneumoniae sorotipo 1. Essa proteção mostrou-se dependente do recrutamento local de células GR1+ (provavelmente neutrófilos polimorfonucleares, PMNs) e não dependente de anticorpos, células B ou T15.

A flagelina é o componente estrutural do flagelo bacteriano. Em sua forma monomérica, é reconhecido por dois Receptores de Reconhecimento de Patógenos (PRRs), TLR5 que detecta FliC16 extracelular e inflamassoma NLRC4/NAIP5 que detecta flagelina intracelular17,18. Quando o FliC é detectado pelos PRRs, uma importante resposta inflamatória é desencadeada. Nós e outros demonstramos que a instilação de FliC purificado do sorovar Typhimurium de Salmonella enterica nos pulmões impulsiona a produção rápida de quimiocinas e citocinas, especialmente quando reconhecidas pelo epitélio dos pulmões que, por sua vez, orquestram o recrutamento de células imunes para as vias aéreas, principalmente PMNs15,19-21. Embora transitória, a infiltração substancial de neutrófilos que ocorre nas vias aéreas após a administração nasal de FliC pode ser uma preocupação se avançar para terapias clínicas para uso humano. A inflamação excessiva pode ser prejudicial para a função dos pulmões. Além disso, foi demonstrado que a administração intranasal de moléculas imunoestimuladoras pode causar paralisia facial e/ou toxicidade cerebral22-24.

A imunoterapia sublingual oferece uma alternativa mais segura para modular a resposta imune no trato respiratório em comparação com a via intranasal. É não invasivo, indolor, simples e tem boa adesão do paciente25. Além disso, como mencionado anteriormente, pode induzir respostas protetoras na mucosa respiratória sem os riscos associados à administração direta intranasal ou intrapulmonar de formulações. A via sublingual pode ser usada alternativamente para fornecer moléculas que têm grandes efeitos no sistema imunológico do pulmão, mas que comprovadamente são tóxicas ou provocam grande inflamação quando administradas por via intranasal. Além dessas vantagens, as formulações para imunoterapia sublingual têm menor custo de fabricação, uma vez que produtos não estéreis podem ser entregues por essa via e o choque endotóxico não é uma preocupação para o SLIT. Por outro lado, vale ressaltar que doses mais altas dos compostos imunoestimulantes em comparação com as utilizadas por via intranasal ou parenteral são necessárias para induzir uma resposta imune nos pulmões; também são necessárias soluções altamente concentradas ao usar o modelo de camundongo de SLIT, uma vez que o local anatômico onde as formulações são depositadas é pequeno.

Com base em nossos dados publicados anteriormente, desenvolvemos um modelo de proteção usando imunoterapia sublingual com flagelina como imunoestimulante modelo. Demonstramos que uma única dose de flagelina induziu 60% de sobrevida contra pneumonia pneumocócica invasiva causada pela cepa do sorotipo 1, enquanto todos os camundongos do grupo controle morreram de infecção em 5 dias. A análise por citometria de fluxo mostrou que um maior número de PMN é recrutado para as vias aéreas de animais protegidos após o tratamento sublingual com flagelina, sugerindo que essas células podem estar envolvidas no mecanismo de proteção induzido pela imunoterapia sublingual.

Este vídeo mostra em detalhes como realizar a imunoterapia sublingual e também como recuperar o tecido relevante da mucosa sublingual, drenando os gânglios linfáticos, bem como os pulmões e as vias aéreas para realizar análises adicionais. Além disso, ilustra a técnica geral de preparação celular para análise FACS e mostra brevemente como preparar suspensões de Streptococcus pneumoniae e como realizar infecções intranasais em camundongos para configurar o modelo de infecção aguda.

Protocolo

Procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com os protocolos N ° 071140-000821-12 e 08.052.010 aprovado pela Comissão Honorária de Experimentação Animal e do Conselho Directivo da Faculdade de Medicina da Universidad de la República - Uruguai.

1. sublingual administração do agente terapêutico

  1. Preparar a solução que contém o agente terapêutico a ser testado. Ajustar a concentração para administrar um volume máximo de 10 ul por rato.
    NOTA: Para a flagelina purificada a partir de Salmonella enterica serovar Typhimurium a dose óptima para induzir protecção em ratinhos infectados com a primeira dose letal de S. pneumoniae sorotipo 1 E1586, causando 100% de mortalidade é de 10 mg / mouse. Flagelina solução deve ser aquecida a 65 ° C durante 5 minutos para assegurar a libertação dos monómeros. Para mais informações sobre a purificação flagellin ver referência 26.
    1. Varconcentração eficaz y de diferentes agentes imunomoduladores de acordo com o seu tamanho molecular, a pureza, a susceptibilidade à proteólise e à utilização de agentes mucoadesivos. Ajustar a concentração óptima para cada composto a ser testado para maximizar os seus efeitos. Se os estudos anteriores por via intranasal foram conduzidos para um composto em particular, utilizar uma dose inicial de 5 a 10 vezes maior para testar a sua eficácia por via sublingual.
  2. Anestesiar os camundongos injetando um coquetel contendo 110 mg / kg de cetamina com 5,5 mg / kg Xylacine e deixe os animais descansar por 7-10 min.
  3. Confirme anestesia adequada, pressionando suavemente a pata de uma das patas traseiras; se adequadamente anestesiado o animal não irá mover-se em resposta ao estímulo.
  4. Espalhe uma camada fina de pomada veterinário sobre os olhos de cada rato para evitar a secura sob anestesia.
    NOTA: anestésicos por inalação, como Isofluorano pode também ser utilizado em vez ketamina / Xylacine se um sistema de equiparped com câmara e do nariz cones de indução está disponível. Utilize a câmara de indução para anestesiar os animais e administrar o imunoestimulante por via sublingual. Ligar-se imediatamente o animal a um cone do nariz, pelo menos, 15 minutos para mantê-la sob anestesia, para evitar a deglutição e permitir a absorção do composto terapêutico.
  5. Pipetar a solução contendo a solução imunoestimulante ou controlo de veículo; usando o polegar eo dedo indicador da mão não dominante levar o mouse e mantenha-o na posição vertical.
  6. Usando o lugar da mão dominante de um par de pinças fechadas sob a língua e mantê-lo no lugar usando os dedos médio e anelar, abra a pinça um pouco para levantar a língua.
  7. Leve a pipeta e administrar a solução no chão do lado da boca e dorsal da língua.
  8. Remova a pinça e deixar o resto do rato por 3 a 5 minutos antes de colocá-lo de volta na gaiola. Para garantir que seja mantida a normotermia no microfone anestesiadoe, conectar as gaiolas de um sistema de aquecedor gaiola. Se tal sistema não está disponível, lugar ratinhos pertencente ao mesmo grupo de tratamento de volta para o compartimento correspondente ao lado do outro sobre a roupa de cama e cobri-las parcialmente com folhas de papel tecido limpo para ajudá-los a manter a temperatura do corpo.
  9. Recolha de amostras de tecido em qualquer ponto de tempo após a instilação do agente imunomodulador para analisar as alterações nas populações celulares induzidos pelo tratamento.
    NOTA: Neste administração protocolo específico de flagelina foi realizada 2 h antes do desafio. Determine o tempo óptimo entre o tratamento e desafio para cada agente terapêutico particular e patogénio a ser testado.

2: Preparação da suspensão bacteriana e intranasal desafio com Streptococcus pneumoniae

NOTA: S. pneumoniae é um agente patogénico humano natural que pode causar doenças que ameaçam a vida, como pneumonia invasiva, sepsee meningite. A transmissão pode ocorrer quando inalado ou em contato com a mucosa. Portanto, todas as amostras que possam ter estado em contacto com S. pneumoniae devem ser tratados em uma unidade de Biossegurança Nível II apropriado usando uma cabine de segurança biológica classe II. Confira os Procedimentos Operacionais Padrão da sua instituição em matéria de manipulação de patógenos Tipo II para roupas de proteção, eliminação de resíduos e medidas de segurança adicionais que podem ser aplicados. Os animais infectados devem ser mantidos em gaiolas ventiladas individualmente em isoladores equipados com filtros HEPA. Vacinas anti-pneumocócicas e antibioticoterapia estão disponíveis. Para mais informações consulte as referências 27 e 1.

  1. Descongelar uma alíquota de uma suspensão de estoque de trabalho de Streptococcus pneumoniae do número de UFC de bactérias conhecido preparado conforme descrito em 15.
  2. Centrifugar durante 5 minutos a 2500 xg e RT.
  3. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento bacteriano através da sua suspensão em 1 ml de rsolução salina erile. Utilize pontas com filtro durante a preparação da suspensão bacteriana, diluições ou para o desafio animal.
  4. Centrifugar novamente como descrito na etapa 2.2.
  5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de soro fisiológico estéril para se obter uma suspensão de 4x10 5 CFU / 50 ul. Esta dose corresponde a uma dose mínima de bactérias S. pneumoniae serotipo 1 E1586 que causa 100% de mortalidade em ratinhos BALB / c de acordo com estudos anteriores 15.
    NOTA: Ao estabelecer um modelo de pneumonia pneumocócica em ratos, a dose mínima de bactérias, causando 100% de mortalidade deve ser determinado para cada combinação específica de estirpe bacteriana, sorotipo e mouse tensão.
  6. Homogeneizar a suspensão bacteriana em vortex ou pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
  7. Carga de 50 ul da suspensão bacteriana utilizando uma ponta de filtro estéril e instilar o volume total nas narinas de um rato anestesiado. Segure o UPRI ratolutar por 2 min e deixe descansar na posição dorsal para mais 2 min. Aplicar vet pomada para os olhos e voltar os animais para a jaula; certifique-se de manter a normotermia sob anestesia.
    Nota: Neste estudo de desafio bacteriano foi realizada num volume de 50 ul para garantir a entrega de pelo menos 90% do total de CFU nos pulmões, tal como determinado anteriormente em 15,28. Para minimizar o perigo de volumes mais pequenos do animal (por exemplo, 20 l) podem ser utilizados. No entanto, a entrega eficiente de bactérias para dentro dos pulmões deve ser verificado; isto pode ser feito através da colheita dos pulmões 5 minutos após a provocação e contagem de UFC em homogeneizados dos pulmões através do plaqueamento de diluições em série em placas de ágar-sangue.
  8. Confirmar os números de CFU na suspensão bacteriana utilizada para a infecção por plaqueamento de diluições em série de 10 vezes em placas de agar de sangue. Incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2 e de contagem do número de colónias mucóides apresentando uma característica de halo verde de albactérias pha hemolíticas.

3 Coleção de Tecidos e Preparação de Amostras para Citometria de Fluxo (FACS) Análise

3.1) coleta de tecido

  1. Eutanásia o animal por deslocamento cervical ou usando uma câmara de CO 2; abrir a cavidade torácica todo o caminho até ao pescoço e fazer uma incisão ao longo das pernas da frente para expor o lado ventral do pescoço e região submandibular.
  2. Com a ponta de uma pinça fina curvada puxe as glândulas salivares e tecido mole adjacente para expor o lado dorsal do soalho da boca. Usando curvas pinça de ponta fina, leve o mandibular e linfonodos mandibulares acessórios puxando delicadamente e coloque em um tubo contendo RPMI completo (cRPMI, por 500 ml-10% de soro bovino fetal, 5 ml de uma solução contendo 10.000 U / ml solução de penicilina e 10 mg / ml de estreptomicina e 5 mL de L-Glutamina 200 mM) ou solução de conservação de ácido nucleico de acordo com o processo a jusante que vaiser realizada mais tarde.
  3. Para abrir a cavidade torácica fazer uma incisão na membrana; usando um par de pinças de ratos com dentes prender a cartilagem xifóide do esterno e corte cuidadosamente as costelas em ambos os lados dorsais a partir das costelas falsas por todo o caminho até chegar ao ponto em que os verdadeiros costelas encontram o manúbrio do esterno.
  4. Ao manter a cartilagem xifóide do esterno com a pinça, puxe delicadamente para expor os órgãos da cavidade torácica.
  5. Retire as costelas completamente cortando as primeiras costelas e clavícula. O timo aparece como uma estrutura em branco de dois lóbulos localizada na parte ântero do tórax perto da base do coração.
  6. Tomar um dos lóbulos por aperto com um par de pinças e usar um par de tesouras para remover os ligamentos entre a sua face inferior e o pericárdio. Prossiga para remover o segundo lobo.
  7. Identificar a cavidade abdominal e abri-lo por corte ao longo do eixo médio do muscular parede para expor os órgãos. Com um par de pinças de cortar a veia cava posterior e na aorta torácica; remover o excesso de sangue com um tecido absorvente.
  8. Para analisar as populações de células que se infiltram e residentes dos alvéolos realizar lavagem broncoalveolar (BAL). Corte os músculos na parte ventral do pescoço para expor a traqueia eo esófago; para separá-los fazer incisões no lado lateral e dorsal das estruturas.
  9. Levanta a traqueia com os fórceps e fazer uma pequena incisão com um bisturi para introduzir uma pipeta de ponta fina-cheia com 1 ml de PBS, sem Ca 2 + / Mg 2 + 1 mM mais EDTA. Incutir e aspirar o volume total de pelo menos três vezes; aspirado e transferir a suspensão de células para um tubo esterilizado de 1,5 mL e colocá-lo em gelo.
  10. Para analisar as populações de células presentes no parênquima pulmonar, primeiro perfundir os pulmões através da injecção de 5 ml de PBS, sem Ca 2 + / Mg 2 + mais EDTA 1 mM para o ventrículo direitodo coração.
    NOTA: Isto irá eliminar a maioria das células vermelhas do sangue e células imunológicas presentes nos vasos sanguíneos dos pulmões. Se a perfusão foi realizada corretamente, pulmões cor mudará de cor de rosa para branco.
  11. Isolar o coração dos pulmões por fixação a partir da base do ventrículo esquerdo e delicadamente o corte dos vasos sanguíneos, com uma tesoura para removê-lo completamente. Toma os pulmões perfundidos e colocá-los em cRPMI ou solução conservante de ácido nucleico de acordo com a análise a ser executada a jusante.
  12. Para a análise de populações de células na mucosa sublingual, isolar a cabeça do animal, e remoção das glândulas salivares e do tecido mole adjacente, se não tiver sido feito no passo 3.2.1.
  13. Faça uma incisão em cada lado da boca até atingir a articulação da mandíbula e do maxilar inferior separar junto com a língua e assoalho da boca, usando pinos corrigi-lo no quadro de dissecção. Puxe a língua; usando um bisturi fazer uma incisão que o basi da lingueta se encontra com o chão da boca até atingir os terceiros molares para expor a mucosa sublingual.
  14. Remover completamente a língua; tomar uma biópsia de 0,5 mm e colocá-lo ao lado dos incisivos inferiores. Corte a partir da inserção gengival do tecido sublingual e pressione suavemente até que o assoalho da boca foi cortado completamente.
  15. Repita mais uma vez agora colocando o soco biópsia perto dos terceiros molares para completar a remoção do tecido sublingual. Colocar em um tubo limpo contendo cRPMI ou conservante ácido nucleico.

3.2) A preparação das amostras para análise FACS.

  1. Transferir o tecido isolado a partir de cada rato dos pulmões numa placa de 24 poços e mediu-los com um par de tesouras limpas até se obter pequenos pedaços de tecido de cerca de 2 mm. Adicionar 1 ml por poço de meio de digestão que continha 30 mg de colagenase tipo II, 50 mg de ADNase-I em 1 ml de meio RPMI sem FBS. Pipeta cima e para baixo cinco vezes e incubar a37 ° C e 5% de CO 2 durante 40 min.
    1. Para a análise de populações de células no tecido sublingual, substituir o meio de digestão em 3.2.1 com um contendo 2 unidades de Dispase, 30 mg de colagenase tipo II, 50 mg de ADNase-I em 1 ml de meio RPMI. Incubar o tecido recolhida a partir de um ratinho em 500 mL de meio de digestão de 20 minutos a 37 ° C num agitador orbital a 50 rpm.
  2. Após a incubação, pipeta-se para baixo e até 10 vezes ou até mais de 30 segundos do tecido foi interrompido. Filtra-se a suspensão de células através de uma célula de 40 um filtro estéril e lava-se com 5 ml de PBS suplementado com EDTA 5 mM.
    NOTA: a digestão completa da matriz extracelular e tecido fibroso não será conseguido. No entanto, os tempos de incubação mais longos na presença de colagenase e / ou dispase ou trituração agressivo não são recomendadas, uma vez que irá resultar em aumento da morte celular ea destruição de proteínas extracelulares que afetam o resultado global do FACS.
  3. Centrifuga-se a 400 x g, 5 min, 4 ° C.
    1. Para a análise de populações de células em BAL, centrifugar as células a 400 xg, 5 min, a 4 ° C e continuar para o passo 3.2.4.
    2. Para a análise de populações de células dos nodos linfáticos, colocar um filtro de 70 um da célula numa placa de Petri estéril e colocar os gânglios linfáticos em conjunto com 1 ml de cRPMI no passador. Retire a queda de um 2 ml seringa estéril e usá-lo como um pilão para esmagar os gânglios linfáticos contra malha do coador. Lavar o filtro de células com 1 ml de cRPMI fresco e transferir as células a partir da placa de Petri para um tubo estéril.
  4. Tomar uma aliquota de cada amostra representativa e corar com azul de tripano para determinar o número de células viáveis.
  5. Ressuspender as células em EDTA por FACS: PBS-EDTA 5 mM, 1% de albumina de soro de bovino para fazer-se uma suspensão de 2x10 7 células / ml e adicionar 50 ul num tubo de citómetro.
  6. Prepara-se uma mistura contendo o anticorpo 2X aproxopriate combinações de anticorpos contra marcadores de superfície e de acordo com fluorocromos para o instrumento FACS disponível. Adicionam-se 50 ul da mistura de anticorpo 2X dentro de cada tubo contendo a suspensão de células.
    NOTA: Titular cada anticorpo marcado com fluorocromo para determinar a quantidade ideal a ser utilizada, para um protocolo detalhado ver referência 29.
  7. Incubar 30 minutos em gelo no escuro.
  8. Lavar uma vez com 3 ml de FACS-EDTA e girar as células por centrifugação a 400 xg durante 5 min a 4 ° C, ressuspender as células em 200 ul do mesmo tampão e analisar num citómetro de fluxo.
    NOTA: Se uma manipulação de grande número de amostras, o protocolo de coloração para análise FACS descrito acima pode ser realizado em placas de 96 poços de fundo em U em vez de tubos de citómetro. No entanto, se utilizar de 96 poços passos placas de lavagem deve ser realizada adicionando-se a 200 ul de FACS-EDTA e repetindo-lo 4 vezes centrifugando as células a 400 xg por 5 min a 4 ° C entre cada washipasso ng.
  9. Neste ponto, fixar as amostras para análise no citómetro de fluxo posterior (até 72h após a fixação).
    1. Para fixar as células, após marcação com os anticorpos de FACS-lavar as células em PBS sem Ca 2 + / Mg 2 +, EDTA a 1 mM sem FBS. Suspender as células em 50 mL do mesmo tampão e adicionar 50 ul de uma solução de paraformaldeído a 4% recentemente preparada em hipertónico (2X) PBS sem Ca 2 + / Mg 2 +.
    2. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente e lava-se 3 vezes em FACS-EDTA.
    3. Ressuspender as células em 200 ul de FACS-EDTA e armazenar a 4 ° C e protegida da luz durante até 72 h.
      NOTA: FSC-SSC pode ser afetada pela fixação. Se fixa as amostras verificar a compatibilidade de anticorpos marcados com fluorescência do fabricante desde corantes em tandem pode ser degradada em presença de agentes fixadores. Se as amostras provenientes de animais infectados fixação é altamente recomendável para assegurar que não há agentes patogénicos viáveis ​​irão estar presentes quando analycanta as amostras na máquina de FACS desde microaerosols podem ser gerados durante a aquisição da amostra.

4. Total Extração de RNA, cDNA Synthesis e PCR em Tempo Real.

4.1) A extração de RNA e síntese de cDNA.

  1. Homogeneizar o tecido em solução conservante de ácido nucleico escolhida por ruptura mecânica (por exemplo, utilizando um homogeneizador rotor-estator de alta velocidade de agitação do tecido-ruptor e grânulos, etc). Centrifuga-se a 12600 xg durante 15 minutos e 4 ° C para remover os fragmentos de tecido. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo.
  2. Extrai-se a ARN com o método de escolha, seguindo as instruções do fabricante.
    NOTA: RNA é altamente suscetível à degradação, se não vai ser usado imediatamente após o isolamento, faça alíquotas e armazená-los em tubos RNAse gratuitos a -80 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido. Os tubos devem ser manuseados com luvas em todos os momentos. Depois de descongelar as amostras de umlways mantê-los no gelo.
  3. Medir a absorvância de ácidos nucleicos, a 260 nm, e calcular a concentração em mg / mL.
  4. Prepare-DNAse I misturar pela adição de (para um exemplo): 7,6 l de água ultrapura, 1 l de 10X DNAse I-tampão, 0,4 ul de DNAse-I (grau de amplificação) da 1 U / mL, e adicionar 8,4 mL de da ADNase I misturar-se a cada amostra contendo 1 mg de RNA total.
    1. Use RNA a uma concentração de 1 mg / mL e realizar a reacção de retrotranscrição (RT-PCR), através da adição de 1 ul do RNA total como molde. Se as amostras são muito diluído e a concentração é menor do que o esperado, adicionar maiores volumes de ARN total, em vez de água. Não deve exceder 20% do volume final da reacção durante a adição do ARN, especialmente se o protocolo de extracção de ARN de escolha envolvido mistura fenol-clorofórmio desde vestígios de fenol pode afectar o rendimento da RT-PCR.
  5. Incubar 15 minutos à temperatura ambiente seguido por 10 min a 4 ° C ou ice. (Não exceda o tempo de incubação !!)
  6. Adicionar 1 mL de EDTA a 25 mM (de grau de biologia molecular) a cada tubo e incubar a 65 ° C durante 10 minutos para inactivar a DNase-I.
  7. Prepare retrotranscrição (RT) da mistura como se segue (para uma reacção de): 1 ul banco de iniciadores de hexâmero aleatório de 0,2 mg / ml, 1 ul de dNTPs 10 mM, 4 ul de tampão 5X M-MLV-RT, 2 ul de DTT 0,1 M, 1 ml estoque RNAse OUT 40 U / mL, e 1 ul M-MLV retrotranscriptase estoque de 200 U / mL.
  8. Adicionar 10 uL de mistura de RT-PCR para a ADNase I-tubo de reacção de 10 ul.
  9. Levar a cabo a reacção de PCR, num termociclador de acordo com o seguinte programa:
    1X ciclo: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C
  10. Dilui-se o cDNA de 1: 5 por adição de 80 ul de água ultrapura. Armazenar a -20 ° C.

4.2) PCR em tempo real (qPCR).

  1. Preparar a mistura de reacção qPCR como se segue (para uma reacção): mistura mestre contendo 5 uL de Taq ADN Polymerase, SYBR corante verde, PCR Buffer, mix de dNTP e MgCl2 (ver 4.2.2); 0,9 ul de uma solução de estoque de 10 mM do iniciador em sentido directo, 0,9 ul de uma solução de estoque de 10 mM do iniciador inverso, 1,2 ul de água ultrapura e 2 ul de molde de ADNc previamente diluído, tal como indicado no passo 4.1.10.
    NOTA: concentração de reagentes e ciclismo protocolos utilizados nesta seção foram otimizados para serem realizados especificamente com os reagentes e instrumentos descritos na "Tabela de Materiais e reagentes", outras marcas podem ser usados, mas volumes de reação, concentração de reagentes e ciclismo protocolo pode variar. Verifique as instruções do fabricante antes de realizar RT-qPCR.
  2. Instale o instrumento qPCR da seguinte forma:
    1X ciclo: 15 min, 95 ° C
    40X ciclos: 15 seg, 95 ° C seguido por 1 min, 60 ° C (neste ponto, adquirem fluorescência).
    NOTA: Para a quantificação relativa de ARNm de acordo com o método de 30 Ct um reference gene deve ser selecionado para a normalização dos valores de Ct. Gene de referência de escolha deve ser testado, em condições de ensaio específicas como a sua expressão pode variar; ACTB, GAPDH ou 18S são alguns dos genes normalmente seleccionado como referências.
  3. Configure o valor limiar e analisar os dados.

Resultados

Imunoterapia sublingual pode ser utilizado com êxito para modular a resposta imune pulmões. Mostramos que uma única dose de flagelina, o agonista TLR5 e NLRC4, pode induzir a regulação positiva significativa do mRNA que codifica a CXCL1 quimiocinas, CCL20 e a citocina IL-6, comparada com os controlos tratados com solução salina. Dobrar a indução de níveis de ARNm de um pico a 8 h após a ITSL e voltar aos níveis basais após 20 horas (Figura 1). No entanto, quando foi realizada a ITSL infecção intranasal antes de 2 horas com S. Pneumoniae, os níveis de mRNA de IL6 CXCL1 e permaneceu significativamente regulada até 24 horas após a ITSL em comparação com animais não tratados (Figura 2).

Análise das populações de células no LBA e no tecido pulmonar por FACS revelou que os animais tratados com FliC por via sublingual havia aumento do número de neutrófilos nas vias respiratórias, mas não no tecido dos pulmões (Figura 3).

Figura 4, com ITSL flagelina promoveu aumento da sobrevivência e protecção contra a pneumonia pneumocócica aguda.

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Figura 1: Cinética do perfil da transcrição dos pulmões após imunoterapia sublingual com flagelina. Oito a 10 semanas de idade BALB / c (n = 4) foram tratados com 10 ug de flagelina ou soro fisiológico por via sublingual, sob anestesia. Pulmões foram coletadas em momentos diferentes e colocados em conservante ácido nucleico. Extracção de RNA total foi realizada e o cDNA foi sintetizado. níveis de mRNA foram avaliadas por PCR em tempo real utilizando primers específicos constantes do Table 1 A quantificação relativa foi realizada de acordo com método ΔCt usando níveis ACTB mRNA para a normalização. Os resultados são apresentados como aumento de vezes em comparação com o grupo tratado com solução salina em mediana ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05), calculado de acordo com o teste de Mann-Whitney. Os resultados são representativos de duas experiências independentes.

figure-results-2
A Figura 2 o perfil de transcrição 'Pulmões durante pneumonia pneumocócica após imunoterapia sublingual com flagelina. Oito a 10 semanas de idade BALB / c (n = 4 por grupo de controlo e n = 7 por grupo tratado) foi tratado com 10 ug de flagelina ou salina por via sublingual, sob anestesia. 2 horas mais tarde, os ratinhos foram infectados por via intranasal com a dose letal mínima (MLD), provocando 10Mortalidade de 0% de um isolado clínico de S. pneumoniae serotipo 1 E1585, correspondente a 4x10 5 CFU / 50 ul. Os pulmões foram recolhidos 24 horas após o desafio e armazenado em conservante ácido nucleico até a extracção de ARN e a síntese de ADNc foram efectuadas. PCR em tempo real foi realizado (ver a lista de iniciadores na Tabela 1) e quantificação relativa foi realizada de acordo com método ΔCt utilizando os níveis de mRNA para ACTB normalização. Os resultados são apresentados como aumento de vezes em comparação com o grupo tratado com solução salina em mediana ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05), calculado de acordo com o teste de Mann-Whitney.

figure-results-3
Figura 3 Análise de polimorfonucleares neutrófilos (PMN) de recrutamento em tecido e vias aéreas nos pulmões após SLIT. Oito a10 semanas de idade BALB / c (n = 4) foram tratados com 10 ug de flagelina ou soro fisiológico por via sublingual, sob anestesia. 2 horas mais tarde, os ratinhos foram desafiados por via intranasal com o MLD de S. pneumoniae sorotipo 1 E1585. 24 horas após o desafio, a BAL foi realizada e os pulmões foram processados ​​por análise de FACS. PMN foram identificadas como células CD11b Ly6G alto / alto / CD11c negativos e com base no perfil FCS-SSC. Os resultados são expressos como percentagem de PMN em relação dos números de células totais na LBA ou pulmões. As barras representam a média ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05), calculados de acordo com one-way teste de Mann-Whitney.

figure-results-4
Figura 4. SLIT com flagelina protege ratinhos contra a pneumonia pneumocócica aguda. S. pneumoniae sorotipo 1 E1585. A sobrevida foi avaliada em uma base diária. Curvas de Kaplan-Meier foram comparadas segundo teste log-rank (Mantel-Cox). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05) .Results são representativos de dois experimentos independentes.

Nome Sequência de 5'-3 ' PCR comprimento do produto (pb)
MB-actin_F GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT 68
MB-actin_R CGTCATCCATGGCGAACTG
mCCL20_F TTTTGGGATGGAATTGGACAC 69
mCCL20_R TGCAGGTGAAGCCTTCAACC
mCXCL1_F CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA 84
mCXCL1_R ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT
mIL-6_F GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA 78
mIL-6_R AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
mTNFalpha_F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 63
mTNFalpha_R CCTCCACTTGGTGGTTTGCT
mCxcl2_F CCCTCAACGGAAGAACCAAA 72
mCxcl2_R CACATCAGGTACGATCCAGGC

Tabela 1 lista Primer usado para tempo real, análise de PCR. Seqüências de primers específicos utilizados para a análise de qPCR. Adiante e iniciadores para rato ACTB reversa, Cccl20, CXCL1, IL6, TNF e CXCL1 são apresentados como as sequências 5'-3 'e o comprimento do produto esperado é indicado em pares de bases (pb).

Discussão

A administração sublingual de agentes terapêuticos tem sido provado como um meio útil para modular a resposta imunitária no tracto respiratório. A principal vantagem de ITSL para o tratamento de doenças respiratórias é de que não envolve a entrega directa de compostos para os pulmões ou nariz, sendo mais seguro do que os tratamentos baseados em administração intranasal 31.

Imunoterapia sublingual pode ser utilizado para modular a resposta imunitária de diferentes maneiras, quer para a indução de respostas de regulação que pode melhorar os sintomas da inflamação alérgica e asma 32 ou para induzir a activação transiente de mecanismos da imunidade inata para o tratamento de infecções pulmonares agudas, como mostrado aqui.

O modelo de rato apresentadas nesta vídeo é um método conveniente para o rastreio de compostos, como agentes terapêuticos para a ITSL.

Este modelo animal oferece um meio útil para determinar o impactode corte na resposta imune dos pulmões, bem como noutros órgãos (por exemplo,. nódulos linfáticos drenantes ou mucosas distais) que não podem ser imitados pela utilização de modelos in vitro. Apesar de existirem vários trabalhos que descrevem os resultados obtidos com a imunoterapia sublingual, métodos de aplicação dos procedimentos de administração sublingual não foram disponibilizados ainda. Além disso, o modelo pode ser utilizado para a avaliação de vacinas sublinguais destinadas a conferir protecção sistémica, bem como local no trato respiratório.

Como mostrado no vídeo acompanhante, administração sublingual de compostos é um processo simples que pode ser facilmente realizada sem a necessidade de formação extensiva. Tipicamente, uma pessoa competente na manipulação dos animais requer 1 hora para efectuar a ITSL num grupo de 10 ratinhos usando anestésicos injectáveis, tal como descrito no presente protocolo. Se desafio pneumocócica é realizada, bem como, 90 minutos adicionais serão necessários para preparara suspensão bacteriana e executar intranasal desafio dos animais.

Os protocolos FACS aqui apresentados permitem a caracterização conveniente de impacto da SLIT no site local de administração, os linfonodos de drenagem, bem como seus efeitos sobre a dinâmica das células dos pulmões.

A análise separada do parênquima pulmonar e conteúdo broncoalveolar é importante para discriminar residente imune as vias aéreas e se infiltrar tipos de células a partir de aqueles que permanecem dentro do tecido. A análise do conteúdo BAL permite o estudo da rotatividade dos macrófagos alveolares bem como a dinâmica do recrutamento de células para os espaços alveolares induzidas por diferentes tratamentos, por exemplo,. PMN, eosinófilos, monócitos. BAL também pode ser usado para avaliar a presença de citocinas e quimiocinas secretadas por Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ou de detecção de anticorpos IgA segregados induzidos após a vacinação sublingual. Estudo de tecido dos pulmõesvai permitir a caracterização de outros tipos de células, as células dendríticas, classicamente, células T e células B.

Preparação de amostras de BAL e nódulos linfáticos para análise FACS é simples. Após a coleta da amostra, normalmente 60 minutos são necessários para completar o protocolo de coloração por 10-20 amostras. Em contraste, o isolamento de células a partir de tecido dos pulmões ou sublingual estarão requerem mais tempo que é necessária a digestão da matriz extracelular. Absorção do agente terapêutico entregues por via sublingual pode ser abordada por rastreamento de moléculas fluorescente ou marcadas radioactivamente usando em sistemas de imagem vivo.

Imunoterapia sublingual é um método atraente para induzir eficazmente respostas imunes no tracto respiratório, bem como sistemicamente que pode ser usado para tratar ou prevenir doenças respiratórias. A elucidação dos mecanismos que determinam a activação vs tolerância da resposta imunitária no tracto respiratório após a ITSL ié essencial para permitir que o desenho racional de novas estratégias terapêuticas que podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com tratamentos disponíveis contra diferentes condições respiratórias.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Jean-Claude Sirard, do Centro de Infecção e Imunidade de Lille, Instituto Pasteur de Lille-França, por gentilmente fornecer a flagelina purificada e à Dra. Teresa Camou, Diretora do Laboratório Nacional de Referência, Ministério da Saúde do Uruguai, por gentilmente fornecer a cepa pneumocócica.

Os autores agradecem ao Sr. Diego Acosta e ao Sr. Ignacio Turel da BichoFeo Producciones-Uruguay por seu compromisso e trabalho árduo durante toda a produção e edição do vídeo.

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas PR_FCE_2009_1_2783 e BE_POS_2010_1_2544 da Agência Nacional de Pesquisa e Inovação, ANII do Uruguai, do Programa de Desenvolvimento das Ciências Básicas, PEDECIBA do Uruguai e Comissão Setorial de Pesquisa Científica, CSIC-Universidad de la República, Uruguai.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de cetamina (50 mg/ml)Pharma Service, Uruguai
Solução de xilacina (2%)Portinco S.A., Uruguai
Seringa estéril de 1 mlModern, Uruguai
Estéril agulha de 27 GModern, Uruguai
RPMI 1640General Electric Health CareE15885
Soro fetal bovinoATCC302020
Solução de Penicilina/EstreptomicinaSIGMAP4333
PBS Estéril sem Ca2+/Mg2+PAAH21002
Tipo-I CollagenaseLife Technologies/Gibco17100017
Desoxirribonuclease I (DNAse-I)SIGMAD4513
DispaseLife Technologies/Gibco17105041
PerCP-Cy5.5 rato conjugado anti camundongo IgG2b anti CD11bBD550993Clone M1/70
APC hamster conjugado anti camundongo IgG1 anti CD11cBD550261Clone HL3 
APC-Cy7 rato conjugado anti camundongo IgG2a anti Ly6GBD560600Clone 1A8
Solução salina estérilLaboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguai
Ágar de soja trípticaBD Difco, França236950
Biokey de sangue de ovelha desfibrinado, Uruguai
Placas de Petri estéreisGreiner633180
p10 PipetaGilsonF144802
p20 PipetaEppendorf3120000097
p200 PipetaGilsonF123601
p200 PipetaCappC200
p200 PipetaEppendorf3120000054
p1000 PipetaEppendorf3120000062
Pontas de filtro estéreis p10Pontasde Filtro Estéril Greiner 771288
p200Pontasde Filtro Estéril Greiner 739288
p1000Greiner750288
VortexBIOSANV1-plus
Pinça de ponta fina de aço inoxidável SIGMAZ168785/Z168777Curvado e reto
Pinça de tecido de curativoSIGMAF4392Comprimento 8 polegadas
Pinça micro-dissecanteSIGMAF4017Reto 
Pinça de microdissecaçãoSIGMAF4142 curvo
Tesoura MayoSIGMAZ265993 
BisturiSAKIRA MEDICAL
Punção de biópsia estéril e oslash; 3mmStiefel Laboratories Ltd.2079D5 mm de diâmetro também pode ser usado
Tubos estéreis de 1,5 ml Deltalab200400P
Tubos estéreis de 15 mlGreiner188271
Estéril Tubos de 50 mlGreiner227261
Pipetas sorológicas estéreis 5 mlGreiner606160
Pipetas sorológicas estéreis 10 mlGreiner607160
Pipetas sorológicas estéreis 25 mlGreiner760180
Cabine de segurança biológica, classe IIThermo Scientificsérie 1300, tipo A2
Micro-Isolador  RackRAIR  IsoSystem 76144WSuper  Rato  1800 AllerZone 
Microcentrífuga RefrigeradaEppendorfLegend Micro 21R
MicrocentrífugaHeraeusBiofuge-pico
CentrífugaThermo ScientificSorval ST40R
CO2 Incubadora Pipetasmodelo 3111
Thermo Scientific Pipetaspasteurestéreis D210022
Deltalab200007
Placa estéril de 24 poçosGreiner662160
Solução azul de tripano Life TechnologiesT10282
- CountessLife TechnologiesC10227 
Lâminas de Câmara de Contagem de Células CountessLifeC10312
Tubos de Citometria de FluxoBD343675
Citômetro de Fluxo - FACS Canto-IIBD
Instrumento de PCR em Tempo Real - Rotor Gene Q ou ABI 7900Qiagen / Applied Biosystems
Trizol ReagentLife Technologies15596-026Molecular Grau
de Biologia DNAse-ILife Technologies18068-015Grau de Biologia Molecular
DNAse-I Buffer 10XLife Technologies18068015Grau de Biologia Molecular
EDTA 25 mMLife Technologies18068015Grau de Biologia Molecular
Água Ultra-PuraLife Technologies10977Grau de Biologia Molecular
RNAse OutLife Technologies100000840Primers
Hexâmero AleatórioLife TechnologiesN8080127Grau de Biologia Molecular
M-MLV-RT bufferLife Technologies18057-018Grau de Biologia Molecular
M-MLV-RT enzimeLife Technologies28025-021
de PCR Verde Syber de Grau deQiagen204143Primers específicos para biologia molecular
 Grau de Biologia Molecularda Life
pasteur estéreis de ponta fina da Contador de Células Automático Technologies de de Grau de Biologia Molecular Kit Biologia Molecular Technologies

Referências

  1. Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
  2. Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
  3. Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
  4. Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. Changing needs of community-acquired pneumonia. J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).
  5. Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
  6. Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
  7. Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
  8. Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
  9. Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
  10. Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
  11. Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
  12. Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
  13. Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
  14. Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
  15. Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
  16. Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
  17. Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
  18. Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
  19. Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
  20. Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
  21. Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
  22. Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
  23. Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999(2009).
  24. Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
  25. Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
  26. Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
  27. Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
  28. Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
  29. Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1(2001).
  30. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
  31. Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
  32. Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).

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