Expressão de proteínas fluorescentes em Branchiostoma lanceolatum Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

Resumo

Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.

Resumo

Relatamos aqui um protocolo robusto e eficiente para a expressão de proteínas fluorescentes após injeção de mRNA em oócitos não fertilizados do cefalocordado anfioxo, Branchiostoma lanceolatum. Usamos construções para mCherry e eGFP direcionados a membrana e nuclear que foram modificados para acomodar o uso de códons de anfioxo e sequências de consenso de Kozak. Descrevemos o tipo de agulhas de injeção a serem usadas, o protocolo de imobilização para os oócitos não fertilizados e a configuração geral da injeção. Essa técnica gera embriões marcados com fluorescência, nos quais a dinâmica do comportamento celular durante o desenvolvimento inicial pode ser analisada usando as mais recentes estratégias de imagem in vivo. O desenvolvimento de uma técnica de microinjeção nesta espécie de anfioxo permitirá análises de imagens ao vivo do comportamento celular no embrião, bem como manipulações específicas de genes, incluindo superexpressão e knockdown de genes. Em conjunto, este protocolo consolidará ainda mais o anfioxo cordado basal como um modelo animal para abordar questões relacionadas aos mecanismos do desenvolvimento embrionário e, mais importante, à sua evolução.

Introdução

Durante o desenvolvimento, uma única célula dá origem a um organismo inteiro num processo altamente complexo que envolve ambos os movimentos e divisões celulares. Para melhor compreender os princípios biológicos subjacentes a dinâmica do comportamento celular, os biólogos do desenvolvimento começaram a usar em técnicas de imagem vivo à base de fluorescência. Compartimentos específicos de células, como as membranas celulares, ou podem ser marcados por meio de tratamentos com corantes fluorescentes, uma abordagem dificultada por uma falta de especificidade e de penetração no tecido ^1, ou pela introdução específica para o embrião de mRNAs ex....

Protocolo

1. Preparação de aparelhos e reagentes

1. Transferir pipetas Pasteur
   1. Gerar uma série de pipetas de transferência Pasteur com diferentes diâmetros de ponta, puxando 230 milímetros de comprimento pipetas Pasteur acima de uma chama em velocidades diferentes. Certifique-se de que a vela é o maior tempo possível para um controlo suave e multa de aspiração.
   2. Com um estilete de diamante, arranhar a pipeta ao longo de uma linha perpendicular ao comprimento da pipeta. Com as duas mãos, puxe a pipeta paralelo ao seu comprimento para gerar um corte contuso. Rapidamente chama-polonês a pipeta sem lacrar a ponta.
   3. Vari....

Resultados

O protocolo detalhado acima fornece a base para a microinjecção de B. oócitos lanceolatum e, consequentemente, para a introdução em desenvolvimento B. Lanceolatum embriões de ARNm que codificam as proteínas fluorescentes para imagiologia in vivo. Embora a técnica é robusta e fiável, certamente, a taxa de injecções de sucesso utilizando este protocolo continua a ser variável (Tabela 1). A explicação muito provável para este facto é intrigante a extrema variabilidade da.......

Discussão

Neste artigo, apresenta-se, pela primeira vez, um protocolo detalhado e reprodutível para a injecção de B. oócitos lanceolatum, que, depois de B. floridae ^13,14 e B. belcheri ^15, é, assim, a terceira espécie anfioxo, para que uma tal técnica tem sido descritas. É importante notar que o protocolo aqui descrito também inclui a descrição de sistemas de vectores adequados para a produção de proteínas fluorescentes em B. lanceolatum injectados a partir de ARN.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Consumíveis
35 mm Placas de Petri	Falcon	353001	Unidade de filtragem tratada com cultura
(Stericup 1 L)	Fisher	W21719	0.22 μ m
Tubos Spin-X	Costar	8160	0.22 μ m
Frasco de armazenamento de agulhas para capilares de 1,2 mm de diâmetro	WPI	E212
Pipetas			de 230 mm de comprimento
Tubo de aspiração	Dutscher	75056
Capilares para agulhas de injeção	Sutter	BF 120-94-10	Vidro borossilicato com filamento, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, comprimento 10 mm
Reagents
Sigma	A9414		de
fenol	Sigma	114537
glicerol	Sigma	G2025
bromidrato de poli-L-lisina	Sigma	P9155
H < sub>2< / sub>O, sem DNase / RNase	Gibco	10977-035
mMessage mMachine SP6 Kit	de transcriçãoKit	de síntese de mRNA	AM1340
Fenol pH 8	Sigma	P4557
24:1 clorofórmio:álcool isoamílico	Sigma	C0549
5:1 fenol pH 4.7:clorofórmio	Sigma	P1944
Sais de cristal de recife (200 kg)	Europrix		Sais comerciais
NaHCO3	Sigma	S6014
Equipment
Fluorescente Escopo de dissecação com ampliação de 200X	Leica	MZ16F	25X oculares, filtros DSR e GFP2
Micromanipulador	Marzhauzer	M-33
Injetor	Picospritzer	modelo II ou III
Extrator de agulhas	Sutter	P97	Extrator de agulhas de filamento de aquecimento
Pinça fina	Fine Science Tools GmbH	11252-30	Dumont #5

Pasteur Vermelho Ambion