Artigo de método

Expressão de proteínas fluorescentes em Branchiostoma lanceolatum Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

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DOI:

10.3791/52042

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12 de janeiro de 2015

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1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

Neste artigo

Resumo

Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.

Resumo

Relatamos aqui um protocolo robusto e eficiente para a expressão de proteínas fluorescentes após injeção de mRNA em oócitos não fertilizados do cefalocordado anfioxo, Branchiostoma lanceolatum. Usamos construções para mCherry e eGFP direcionados a membrana e nuclear que foram modificados para acomodar o uso de códons de anfioxo e sequências de consenso de Kozak. Descrevemos o tipo de agulhas de injeção a serem usadas, o protocolo de imobilização para os oócitos não fertilizados e a configuração geral da injeção. Essa técnica gera embriões marcados com fluorescência, nos quais a dinâmica do comportamento celular durante o desenvolvimento inicial pode ser analisada usando as mais recentes estratégias de imagem in vivo. O desenvolvimento de uma técnica de microinjeção nesta espécie de anfioxo permitirá análises de imagens ao vivo do comportamento celular no embrião, bem como manipulações específicas de genes, incluindo superexpressão e knockdown de genes. Em conjunto, este protocolo consolidará ainda mais o anfioxo cordado basal como um modelo animal para abordar questões relacionadas aos mecanismos do desenvolvimento embrionário e, mais importante, à sua evolução.

Introdução

Durante o desenvolvimento, uma única célula dá origem a um organismo inteiro num processo altamente complexo que envolve ambos os movimentos e divisões celulares. Para melhor compreender os princípios biológicos subjacentes a dinâmica do comportamento celular, os biólogos do desenvolvimento começaram a usar em técnicas de imagem vivo à base de fluorescência. Compartimentos específicos de células, como as membranas celulares, ou podem ser marcados por meio de tratamentos com corantes fluorescentes, uma abordagem dificultada por uma falta de especificidade e de penetração no tecido 1, ou pela introdução específica para o embrião de mRNAs exógenos que codificam proteínas fluorescentes 2. Técnicas diferentes podem ser usadas para a entrega eficiente de substâncias exógenas, tais como ARNm. Estes incluem, mas não se limitam a, microinjecção, electroporação, bombardeamento com micropartículas, lipofecção e transdução de 3,4. Apesar de todas estas abordagens podem ser utilizadas para introduzir compostos exógeno numadesenvolvimento do embrião, só microinjeção permite a aplicação de quantidades pré-definidas e precisas em cada célula 3. Técnicas de microinjeção foram descritas para todos os principais sistemas modelo de desenvolvimento 4 (por exemplo, moscas de frutas, vermes nematóides, peixe-zebra, sapos, ratos), bem como para alguns modelos alternativos 4, incluindo aqueles usados ​​para estudos comparativos que visam a compreensão da evolução dos mecanismos de desenvolvimento (por exemplo, anêmonas do mar, vermes anelídeos, ouriços do mar, tunicados de ascídias, o anfioxo cephalochordate).

Cephalochordates que, juntamente com tunicados e vertebrados estabelecer o filo dos cordados, particularmente modelos bem adequado para estudar a evolução de cordados e da diversificação de vertebrados de um ancestral invertebrado 5-8. A linhagem cephalochordate divergiram muito cedo durante a evolução cordados; e cephalochordates existentes, que são subdivididas em três gêneros (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), se assemelham vertebrados tanto em termos de anatomia geral e arquitetura do genoma 5-8. Dos cerca de 30 espécies de cephalochordates que foram descritas até agora, cinco estão disponíveis para estudos de embriologia e desenvolvimento: 6,9 Asymmetron lucayanum (o lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (o anfioxo Florida), Branchiostoma lanceolatum (o anfioxo Europeia), Branchiostoma belcheri (o anfioxo chinês) e Branchiostoma japonicum (o anfioxo japonês). Adultos maduros de três destas espécies (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) podem ser induzidas a desovar sob demanda durante a época de reprodução 10,11. Além disso, pelo menos para B. lanceolatum, desova eficiente pode também ser induzida em água do mar artificial 12, tornando esta espécie cephalochordate particulares acessível para laborators que não têm acesso à água do mar natural. A combinação, em B. lanceolatum, de um acesso conveniente e confiável para embriões com um método de entrega eficiente, como a microinjeção, até agora a única técnica de entrega desenvolvido em anfioxo (em ambos B. floridae e B. belcheri) 13-15, permitirá o desenvolvimento de um novela conjunto de técnicas de manipulação, incluindo tracing- linhagem e abordagens baseadas em comportamento de células dinâmica.

Um protocolo para a microinjecção eficiente de ARNm para expressar as proteínas fluorescentes na B. lanceolatum embrião foi, portanto desenvolvido. Além disso, para fornecer um conjunto de ferramentas de base para geração de imagens ao vivo de B. embriões lanceolatum, foram desenvolvidos sistemas de vectores que permitem a associada à membrana e expressão nuclear de proteínas fluorescentes. Para segmentação membrana, maior proteína verde fluorescente (eGFP) foi fundido com a caixa CAAX humano HRAS e localização nuclear de mCherry e eGFP foiobtido por fusão para o peixe-zebra exão histona 2B (H2B) (Figura 1, complementar do ficheiro 1). Além disso, com o objectivo de optimizar a tradução da proteína, as sequências Kozak e codões das construções tenham sido modificados e adaptados para uso em B. lanceolatum. Tomados em conjunto, o método de injecção e vectores de expressão aqui apresentados servem como uma base para a geração de novas abordagens experimentais para cephalochordates, nomeadamente as análises usando o mais recente de fluorescência com base em técnicas de imagiologia in vivo.

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Protocolo

1. Preparação de aparelhos e reagentes

  1. Transferir pipetas Pasteur
    1. Gerar uma série de pipetas de transferência Pasteur com diferentes diâmetros de ponta, puxando 230 milímetros de comprimento pipetas Pasteur acima de uma chama em velocidades diferentes. Certifique-se de que a vela é o maior tempo possível para um controlo suave e multa de aspiração.
    2. Com um estilete de diamante, arranhar a pipeta ao longo de uma linha perpendicular ao comprimento da pipeta. Com as duas mãos, puxe a pipeta paralelo ao seu comprimento para gerar um corte contuso. Rapidamente chama-polonês a pipeta sem lacrar a ponta.
    3. Variar o diâmetro da ponta com a fase dos oócitos / embriões de ser pipetado: 300-400 mm para oócitos não fertilizados (cerca de 150 um de diâmetro), 600 um, para os ovos fertilizados (cerca de 500 um de diâmetro), de 200-400 pm para neurulae chocado. Usar pipetas com um tubo de aspiração monitorado-boca para transferir oócitos / embriões a partir de um pratopara outro.
  2. As agulhas de injecção
    1. Manipular os capilares com luvas de assegurar condições livre de RNase. Use o vidro de borosilicato com capilares de filamentos com dimensões de OD 1,20 milímetros, 0,94 milímetros ID, comprimento 10 mm.
    2. Se capilares são puxados sobre o tipo de aquecimento-filamento agulha extrator descritas na Lista de Materiais, use as seguintes configurações: Calor 600, Pull 50, Velocity 80, Tempo 60, 200 ou 300. Pressão Caso contrário, certifique-se de que a forma, o que é crucial para injecções bem sucedidas, como é mostrado na Figura 2, com as seguintes propriedades: 4-8 um de diâmetro de ponta exterior de 2 cm de comprimento do afunilamento.
      NOTA: As agulhas podem ser puxado antes da época de desova e utilizado durante toda a temporada.
  3. Vermelho de Fenol solução estoque de 5% (4x)
    1. Prepare fresco antes de cada época de desova.
    2. Em um tubo de micrometros de filtração de 0,22, pesar 25 mg de Fenol em pó vermelho.
    3. Adicionar 0,5 ml de DNase e RNase água parao tubo contendo o pó.
    4. Girar durante 3-5 min a 18,000 xg à temperatura ambiente para filtrar-esterilizar a solução e remover os cristais que poderiam obstruir a agulha da injecção.
    5. Armazenar a 4 ° C ou armazenar 250 mL alíquotas a -20 ° C.
  4. 0,25 mg de solução de poli-lisina / ml
    1. Prepare fresco antes de cada época de desova.
    2. Dissolve-se 5 mg de poli-L-lisina em 20 ml de água destilada. Loja 5 ml de partes alíquotas a -20 ° C.
    3. Usar uma alíquota descongelada imediatamente e apenas uma vez para assegurar a aderência reprodutível e robusto dos oócitos para o prato de poli-lisina-revestidas.
  5. síntese de ARNm
    1. Prepare fresco antes de cada época de desova.
    2. Linearizar 5 ug de ADN de interesse com a enzima adequada (normalmente durante 2 horas, a 37 ° C). Para verificar a integridade da digestão, execute 2% em volume da mistura de digestão em um 1% agarose-TBE gel em tampão TBE a 150 W por 20 min.
    3. Extraia o lineaADN zado com 25: 24: 1 de fenol (pH 8,0): clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase (superior) aquoso.
    4. Extrai-se a fase aquosa novamente com 24: 1 de clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa.
    5. Precipitar o DNA linearizado com 100: 10: 300 DNA linearizado: 3 M de acetato de sódio (pH 5,2): 100% de etanol durante a noite a -20 ° C.
    6. Centrifugar 20 min a 18000 xg, a 4 ° C. Enxágüe em etanol 70%.
    7. Centrifugar 10 min a 18000 xg, a 4 ° C. Deixar secar e ressuspender em água isenta de ARNase para uma concentração final de 0,5 ug / uL.
    8. Transcrever 1 ug de ADN linearizado utilizando um kit de síntese de ARNm com a polimerase apropriada, de acordo com as instruções do fabricante.
    9. Extrai-se o ARNm com 5: 1 de fenol (pH 4,7): solução de paragem clorofórmio e acetato de amónio fornecido com o kit.
    10. Vortex durante 20 segundos, centrifuge 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa.
    11. Extrai-se a fase aquosa novamente com 24: 1 de clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa.
    12. Precipitar o ARNm com isopropanol a 100% durante a noite a -20 ° C.
    13. Centrifugar 20 min a 18000 xg, a 4 ° C. Enxágüe em etanol 80%.
    14. Centrifugar 10 min a 18000 xg, a 4 ° C. Deixar secar o sedimento à temperatura ambiente durante não mais do que 5-10 minutos, uma vez que será então difícil de re-suspender. Ressuspender em água DNase e RNase para uma concentração final de pelo menos 2 ug / uL de assegurar uma concentração final de ARNm decente na mistura de injecção.
    15. Para verificar a qualidade e tamanho do produto de transcrição, 0,5 ul de executar o ARNm sobre um 1% de agarose-TBE-gel de RNase livre em tampão TBE a 150 W durante 20 minutos. Loja 2 mL alíquotas a -80 ° C.
  6. Pratos revestidos com poli-lisina-
    NOTA: Poli-lisina coated pratos são usadas para imobilizar os oócitos durante a injecção.
    1. Para cada 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri (5 no total), cobrir o fundo da placa de Petri com 1 ml da solução de poli-lisina descongeladas 0,25 mg / ml. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Para cada 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri (5 no total), transferir a solução de poli-lisina a 0,25 mg / ml em mais 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    3. Descartar a solução de poli-lisina a 0,25 mg / ml.
    4. Deixe as placas de Petri seco, de cabeça para baixo, à temperatura ambiente durante 2 h.
    5. Armazenar as placas revestidas de poli-lisina-embrulhados num invólucro de plástico a 4 ° C para evitar a contaminação de uma semana no máximo.
  7. Pratos revestidos-Agarose
    NOTA: Eles são usados ​​para cultura de embriões injetado. A agarose proporciona uma almofada para os embriões injectados e evita que fiquem coladas ao fundo do prato.
    1. Faça a água do mar artificial (ASW) usando 37-38 g / L commsais ercial + 0,25 mM NaHCO3 em água de osmose reversa.
    2. Dissolve-se uma concentração de agarose a 1% em 0,22 mm ASW-filtrada por aquecimento da solução em um forno de microondas.
    3. Verter rapidamente a solução de agarose quente a partir de uma placa de Petri de 35 milímetros para um outro, a fim de assegurar um revestimento de agarose muito fina do prato.
    4. Armazenar as placas revestidas com agarose embrulhados em Saran a 4 ° C para evitar a contaminação de uma semana no máximo.
  8. Mistura injecção e carregamento das agulhas de injecção
    1. Cerca de 2 horas antes de iniciar as injecções, faça uma mistura de 2 ul de injecção em RNase e DNase-livre de água com concentrações finais de 1-1,8 mg / mL de ARNm, 15% de glicerol, 1,25% de vermelho de fenol.
      NOTA: As cores de vermelho de fenol, a solução, que permite a monitorização do rendimento de injecção e a identificação dos embriões injectados com sucesso. Glicerol favorece a difusão de ARNm dentro do oócito.
    2. Centrifugar 4 min a 18000 xg paracristais de pelotização. Manter em gelo até o uso.
    3. Com uma pipeta de 10 uL, recolher 0,5 ul da mistura de injecção, evitando a parte inferior do tubo, onde os cristais foram sedimentadas.
    4. Backfill, pelo menos, duas agulhas de injecção (no caso de uma pausas durante a injeção) pipetando a queda de 0,5 ul de mix injecção na grande abertura da agulha.
    5. Instalar as agulhas em um frasco de armazenamento com o líquido na parte inferior a 4 ° C para evitar a evaporação da mistura de injecção. Deixe a mistura lentamente injecção viajar para a ponta da agulha de injecção durante pelo menos 1 hora a minimizar a criação de bolhas.
    6. Loja mistura injecção adicional a -80 ° C para um máximo de três utilizações adicionais, após o que deteriora a qualidade do mRNA (dados não mostrados).

2. coleta de material biológico, Microinjection e cultura de embriões

  1. Ovócito e espermatozóide coleção
    NOTA: Ver Theodosiouet al. 12 para um protocolo detalhado para induzir a desova e para a coleta de gametas.
    1. Machos e fêmeas de choque em ASW a 23 ° C durante 24 horas.
    2. Uma a duas horas antes do pôr do sol, transferir os adultos em copos individuais em ASW a 19 ° C, porque a maioria dos adultos vai gerar 1-2 horas após o por do sol.
    3. Enxágüe 35 milímetros placas de Petri em ASW filtrada e deixe-os secar de cabeça para baixo para evitar que os oócitos de degola para o fundo do prato.
    4. Após a desova, recolher imediatamente espermatozóides e ovócitos com uma pipeta de 1000 mL.
      1. Manter espermatozóides e oócitos separar amphioxus adulto porque o contacto é prejudicial para a saúde de gâmetas (dados não mostrados).
      2. Além disso, evitar surpreendente os adultos, que leva a movimentos que dissipam, e, portanto, diluir, tanto de esperma e de oócitos. Para manter o esperma ativo o maior tempo possível e para otimizar a taxa de fertilização, coletar o esperma tão concentrado quanto possível.
    5. Manteresperma em gelo em um tubo de 1,5 ml.
    6. Oócitos Transfer in filtrada ASW para as pré-lavadas 35 milímetros placas de Petri.
    7. Transferência 100-500 ovócitos com uma previamente puxado 300-400 mm transferência Pasteur pipeta para outra 35 milímetros placa de Petri para realizar as injeções.
    8. Fertilizar o restante da embraiagem como um controlo para a qualidade dos oócitos e esperma ou para outras experiências.
  2. Injeção de ovócitos
    1. Instalar a agulha de injecção no micromanipulador a uma 50 ° ângulo em relação ao plano horizontal.
      NOTA: Angles de menos de 50 ° vai empurrar os oócitos em torno do prato, enquanto ângulos de mais de 50 ° não permitirá um adequado acompanhamento da posição da agulha em relação ao oócito.
    2. De acordo com um escopo de dissecação fluorescente com 25X oculares, transferir 30 oócitos com a transferência de uma pipeta de Pasteur de 300-400 mm numa placa revestida com poli-lisina-ASW contendo filtrada.
    3. Deposite os ovócitos ao longo de uma linha de transportarinjecções de fora de uma maneira ordenada e para distinguir injetados a partir de oócitos não injetados. Injectar pequenas quantidades (30 oócitos) para minimizar o tempo de exposição dos oócitos para a poli-lisina, a qual tende a deformar-se os embriões em desenvolvimento (dados não apresentados).
    4. Use a iluminação de campo escuro para tornar os ovócitos como translúcido possível.
    5. Com o botão de movimento grosseiro do micromanipulator, trazer a agulha de injeção perto de um ovócito.
    6. Com uma pinça fina, corte abrir a agulha no nível onde a ponta começa a ser curvada. Pulsando com o injector, verifique se mistura injeção vermelho é, na verdade, que flui para fora da agulha.
    7. Com uma ampliação de 200X e com o botão de movimento fino do micromanipulador, mover-se suavemente a agulha de injecção no interior do núcleo do oócito.
      NOTA: Se inserido muito superficialmente, a solução injetada não permanecerá no interior do oócito. Se inserido muito longe, o oócito será destruído.
    8. Injectar com 1-3 pulsos de 120 mseg Duracião e 1-10 psi de pressão. Se a agulha é suficientemente fina, injectar com fluxo contínuo a pressão constante. Certifique-se de que o volume de injecção corresponde a 1/5 a 1/3 do volume de um único oócito.
    9. Após a injecção, retire a agulha rapidamente para evitar a fuga do oócito.
    10. Verificar que a solução injectada permaneça no oócito e que, após alguns segundos, a solução injectada se espalha em todo o oócito.
    11. Mover para a próxima oócito na linha.
    12. Mantenha alguns embriões uninjected de cada série como controle negativo para estimar a fluorescência de fundo durante uma verificação de embriões injetados.
  3. Fertilização, a seleção de embriões injetados e cultura de embriões
    1. Fertilizar os oócitos assim que uma série ter sido injectado. Como a qualidade do ovócito diminui com o tempo, injetar e fertilizar óvulos dentro de 1 hora após a desova 12.
    2. Dependendo da concentração espermática, adicione 1-5 gotas de esperma para os oócitos eagite o prato.
      NOTA: O envelope fertilização deve tornar-se evidente nos embriões após cerca de 1 min.
    3. Permitir que os embriões para separar a partir do prato de poli-revestido-lisina, durante a injecção outra série de oócitos.
    4. Transferir os embriões com a 600um transferência pipeta de Pasteur a uma placa de Petri revestidas com agarose. Remover os embriões a partir do prato revestido com poli-lisina-o mais rapidamente possível, se possível, antes da fase de 2 células.
      NOTA: Em caso de exposição prolongada a poli-lisina, os embriões tendem a tornar-se blástulas densamente agrupadas, achatado no lado tocar no fundo do prato.
    5. Na fase 2-célula para 4 células, selecione com um escopo de dissecação fluorescente com filtro DSR os embriões com sucesso-injetados, ou seja, aqueles com uma morfologia normal que exibem um sinal fluorescente vermelha Vermelho de Fenol-derivadas.
    6. Manter os embriões em cultura em filtrada ASW em placas de Petri revestidas com agarose a 19 ° C até à fase desejada deimagem in vivo.

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Resultados

O protocolo detalhado acima fornece a base para a microinjecção de B. oócitos lanceolatum e, consequentemente, para a introdução em desenvolvimento B. Lanceolatum embriões de ARNm que codificam as proteínas fluorescentes para imagiologia in vivo. Embora a técnica é robusta e fiável, certamente, a taxa de injecções de sucesso utilizando este protocolo continua a ser variável (Tabela 1). A explicação muito provável para este facto é intrigante a extrema variabilidade da...

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Discussão

Neste artigo, apresenta-se, pela primeira vez, um protocolo detalhado e reprodutível para a injecção de B. oócitos lanceolatum, que, depois de B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, é, assim, a terceira espécie anfioxo, para que uma tal técnica tem sido descritas. É importante notar que o protocolo aqui descrito também inclui a descrição de sistemas de vectores adequados para a produção de proteínas fluorescentes em B. lanceolatum injectados a partir de ARN...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer o apoio da "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" para criação de animais. Este trabalho foi financiado por fundos da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) para Michael Schubert, pela concessão União Europeia FP6 "Embryomics" e pela concessão ANR "ANR- 10 BLAN-121801 Dev-Process "para Jean-François Nicolas e Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho é financiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

Os pedidos de vectores descritos aqui podem ser enviadas diretamente para os autores.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Consumíveis
35 mm Placas de PetriFalcon353001Unidade de filtragem tratada com cultura
(Stericup 1 L)FisherW217190.22 μ m
Tubos Spin-XCostar81600.22 μ m
Frasco de armazenamento de agulhas para capilares de 1,2 mm de diâmetroWPIE212
Pipetasde 230 mm de comprimento
Tubo de aspiraçãoDutscher75056
Capilares para agulhas de injeçãoSutterBF 120-94-10Vidro borossilicato com filamento, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, comprimento 10 mm
Reagents
SigmaA9414de
fenolSigma114537
glicerolSigmaG2025
bromidrato de poli-L-lisinaSigmaP9155
H < sub>2< / sub>O, sem DNase / RNaseGibco10977-035
mMessage mMachine SP6 Kitde transcriçãoKitde síntese de mRNAAM1340
Fenol pH 8SigmaP4557
24:1 clorofórmio:álcool isoamílicoSigmaC0549
5:1 fenol pH 4.7:clorofórmioSigmaP1944
Sais de cristal de recife (200 kg)Europrix Sais comerciais
NaHCO3SigmaS6014
Equipment
Fluorescente Escopo de dissecação com ampliação de 200XLeicaMZ16F25X oculares, filtros DSR e GFP2
MicromanipuladorMarzhauzerM-33
InjetorPicospritzermodelo II ou III
Extrator de agulhasSutterP97Extrator de agulhas de filamento de aquecimento
Pinça finaFine Science Tools GmbH11252-30Dumont #5
Pasteur Vermelho Ambion

Referências

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