Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

Resumo

Desenvolvemos um modelo de lesão pulmonar em camundongos por injeção intratraqueal da bactéria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo mimetiza a lesão pulmonar durante a pneumonia e é clinicamente relevante.

Resumo

A fim de estudar a lesão pulmonar aguda humana e pneumonia, é importante para desenvolver modelos animais para imitar várias características patológicas da doença. Aqui nós desenvolvemos um modelo de lesão pulmonar rato pela injeção intra-traqueal de bactérias Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ou PA). Utilizando este modelo, fomos capazes de mostrar a inflamação pulmonar na fase inicial da lesão. Além disso, alveolar leakiness barreira epitelial foi observada por análise de lavagem broncoalveolar (BAL); e morte celular alveolar foi observada por ensaio de Tunel usando tecido preparado a partir de pulmões lesionados. Numa fase posterior, após lesão, observou-se proliferação de células necessário para o processo de reparação. A lesão foi resolvida 7 dias a partir do início do P. injecção aeruginosa. Este modelo imita o curso seqüencial de inflamação pulmonar, lesão e reparação durante pneumonia. Este modelo animal clinicamente relevante é adequado para estudar patologia, mecanismo de reparação, fepois lesão pulmonar aguda, e também pode ser utilizado para testar potenciais agentes terapêuticos para esta doença.

Introdução

Os pulmões são expostos a agentes patogénicos ambientais e são susceptíveis a inflamação e lesão ^1-3. Durante condições patológicas como pneumonia ou Síndrome da Angústia Respiratória Adulto (SARA), patógenos, bem como fatores inflamatórios liberados por leucócitos induzir lesão e morte das células alveolares ^1-3. É importante para o desenvolvimento de modelos animais de lesão pulmonar aguda para facilitar o estudo de lesões da patologia, bem como mecanismo de reparação.

Atualmente, a maioria das pessoas usam hiperóxia e bleomicina rato induzida modelos de lesão pulmonar ^4. No entanto, os mecanismos de hiperoxia causado um prejuízo não são o mesmo que a maioria das lesões pulmonares comuns que ocorrem durante a pneumonia ou ARDS ^5. Bleomicina lesão aguda induzida é raro em um contexto clínico ^4. Aqui nós relatamos um modelo de lesão pulmonar mouse usando a injeção intra-traqueal de P. aeruginosa ^6,7. Este modelo é clinicamente relevante, e imita a processes que acontecem após pneumonia ^8.

Como um patógeno oportunista, nosocomial de indivíduos imunocomprometidos, P. aeruginosa normalmente infecta o trato pulmonar, urinário, queimaduras, feridas, e também causa outras infecções sanguíneas ^6. A bactéria liberta virulência fator exotoxina A, multiplicar e desencadear respostas imunes ^6. Administração intra-trachael de P. aeruginosa reflecte a situação em exposição humana para as bactérias que causam a pneumonia e a patologia é provável que seja diferente do modelo de lesão pulmonar induzida por vírus da gripe H1N1 recentemente relatado ^9. Desde P. aeruginosa é um agente patogénico oportunista, é relativamente seguro de manusear em comparação com alguns dos agentes patogénicos mais virulentas. Aqui utilizou-se a injecção intra-traqueal para administrar as bactérias porque observou-se que este método introduzido mais bactérias na região distal alvéolos do pulmão em comparação comalguns outros procedimentos, tais como a utilização de um cateter através da boca.

Em comparação com outros modelos de lesão pulmonar aguda, o P. aeruginosa modelo descrito é apropriado para o estudo de lesão pulmonar induzida por bactérias e por inflamação excessiva. Ao contrário de outros modelos animais que utilizam P. aeruginosa a indução da sepse ^10,11, aqui vamos usar a injeção intra-traqueal destas bactérias para induzir localizada lesão pulmonar aguda.

Protocolo

As experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal e Comitês de Biossegurança Institucional da Universidade de Illinois, em Chicago.

NOTA: Todos os procedimentos que envolvem pseudomonas deve ser realizada com Nível de Biossegurança 2 práticas (BSL2), que incluem mas não estão limitados a: máscara, protecção para os olhos, vestido ou macacão, luvas e duplas. Trabalhar em certificado de Biossegurança Gabinete. Trate instrumentos em contato com bactérias com desinfetante à base de lixívia ou cloro dióxido de carbono. Use uma caixa selada para amostras de transporte.

1. P. aeruginosa Cultura e Crescimento

1. Loja P. aeruginosa PA103 como um estoque bacteriana em uma tampa de rosca frasco de congelação a -80 ° C.
2. Colocar o frasco em um rack em uma caixa com 70% de etanol molhada toalhas de papel e levar para o laboratório de Nível de Biossegurança 2 (BSL2).
3. Streak as bactérias em placas de agar de sangue de ovelha e crescer a 37 ° C durante ~ 15 horas numa incubadora.
4. Em um capuz BSL2, arranhar as bactérias da placa com bactérias loop e ressuspender em 5 ml de PBS.
5. Armazenar o estoque, a 4 ° C por até 3 meses. No entanto, determinar o título de cada 2 semanas.
6. Serialmente dilua as bactérias em PBS (geralmente de 1:10 a 1:10 ^{4 7)} e para fora da placa de diluição conhecido em placas de agar de sangue de ovelha.
7. Incubar as placas durante ~ 15 h. Contagem das colónias e calcular unidade formadora de colônia (UFC) para determinar a concentração de bactérias.
8. Ressuspender as concentrações apropriadas (~ 5 x 10 ³ CFU / ul) em 0,5 ml de PBS em 1,5 ml estéreis criotubos com tampa de rosca. Vedar as cryovials e colocá-los em um rack cryovial em toalhas de papel carregado desinfetantes em uma caixa de encaixe da tampa.
9. Transportar a caixa para BSL2 biotério. Uma vez lá, abra a caixa no armário BSL2.

2. P. aeruginosa instilação

1. Realize assepticamente cirurgia sobrevivência (luvas estéreis, instrumentos esterilizadose as técnicas assépticas). Use um campo estéril para fornecer uma superfície de trabalho para (autoclavados) instrumentos cirúrgicos estéreis. Esterilizar instrumentos usando um esterilizador quente talão entre cada procedimento instilação traqueal.
2. Pesar ratinhos antes da anestesia. Anestesiar ratos com cetamina (100 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), em 0,1-0,2 ml de PBS por via intraperitoneal (ip). Determinar a eficácia do anestésico por não responsividade ao dedo do pé pitada. Use uma pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
3. Contenha camundongos em uma placa cirúrgica no gabinete BSL2.
4. Identificar a área para o corte para baixo. Raspar nesta área e preparar a pele usando alternando álcool e iodo povidona compressas 3 vezes.
5. Trate a área da incisão, com anestesia local (lidocaína), pois esta anestesia é suficiente para uma pequena cirurgia, como uma incisão na pele para acessar a traqueia.
6. Adicione uma pequena incisão (aproximadamente 5 mm) na linha média do pescoço, e usar romba forceps para mover suavemente o músculo para o acesso à traquéia. Expor a traquéia por dissecção cirúrgica.
7. Desenhe solução bactérias dentro de uma seringa descartável 1 ml com agulha 27 G. Para cada rato, administrar 20-30 ul de bactérias na concentração apropriada (até 10 ⁵ CFU cada ratinho).
8. Insira a agulha na traquéia. Injectar solução lentamente na traqueia.
9. Assegure-se que os animais suspiros, que normalmente indica que a solução tenha atingido no pulmão.
10. Fechar a ferida com suturas de monofilamento estéreis (6-0), sob condições assépticas.
11. Use 0,1 mg / kg de buprenorfina por injecção subcutânea como analgesia no pós-operatório para controle da dor pós-cirúrgica.
12. Assegure-se que o tempo necessário desde a indução da anestesia inicial à incisão de fecho é inferior a 15 min.
13. Após a injeção, descarte de seringas e agulhas em um recipiente de risco biológico farelos apropriado.
14. Trate os instrumentos cirúrgicos com DISI base de dióxido de cloronfectant durante 15 minutos, enxaguar e voltar para o laboratório para esterilização e reutilização quando necessário.
15. Casa dos ratos individualmente em gaiolas limpas em ambiente quente.
16. Confira no animal a cada 30 minutos até que ele recobra a consciência e começa a se mover; e, posteriormente, em intervalos de 12 h para os primeiros 3 dias pós-cirurgia.
17. Manter os ratinhos na instalação de BSL2 animais ao longo da experiência. Certifique-se de que somente o tecido contido na caixa selada deixarem a instalação BSL2 animal. Se os ratinhos expressam qualquer um dos comportamentos moribundos (definida como dificuldade respiratória, letargia, insuficiência de deambulação em resposta à estimulação suave) em qualquer momento do estudo, os ratinhos eutanásia por inalação de CO ₂ a partir de uma fonte mineral seguido por deslocamento cervical.
18. Euthanize o assunto experimental por sangria sob anestesia.
    1. Recolhe tecido pulmonar de ratos submetidos a eutanásia. Realizar esses procedimentos em uma capa BSL2. Se necessário, transferir a amostra usando tubos vedados colocados em um rack em toalhas de papel carregado desinfetantes em uma caixa de tampa snap para posterior processo.

Resultados

A partir 24-72 h pós P. injecção aeruginosa, celularidade aumentada foi observada em secções de pulmão (Figura 1A-D). O pulmão começou a se recuperar a partir de 96 horas pós lesão (Figura 1E). Aos 7 dias pós-P. aeruginosa, alvéolos morfologia normal foi restaurado pela maior parte (Figura 1F). Seções usando pulmonares coloração Tunnel preparado em 24 horas pós P. aeruginosa mostrou a morte celular em células em alvéolos (Figu...

Discussão

O modelo de lesão pulmonar rato Pseudomonas que descrevemos aqui imita todo o processo de inflamação, lesão pulmonar, reparo e resolução que ocorrem após a lesão pulmonar aguda ou pneumonia. Ele tem vantagens únicas comparando com vários outros modelos de lesão em que é clinicamente relevante e relativamente seguro e fácil de manusear.

O passo crítico no processo é que a solução de injecção de bactérias tem de ser muito lento. Se a injecção for demasiado rápido, os ratinhos são propensas a m...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anestésico: Cetamina, xilazina, lidocaína, buprenorfina			grau farmacêutico
27 G		Fisher 1482648
seringa	Fisher	14823434	1 ml
Pinças	de ferramentas
Sutura	ferramentas
	Fisher	19-037-526
Medidor de olhos, luva, bata
Biossegurança Armário
desinfetante			Clidox
placas de ágar sangue de ovelha	Fornecimento Medex	HL-1160

seringa tesoura de Fine Science de Fine Science à base de dióxido de cloro