Lesão Balloon Vascular e Administração Intraluminal em Rat Carótida

Resumo

Este protocolo utiliza um cateter balão para causar uma lesão intraluminal na artéria carótida de rato e, doravante, provocar hiperplasia neointimal. Este é um modelo bem estabelecido para o estudo dos mecanismos de remodelação vascular em resposta a lesão. É também amplamente utilizada para determinar a validade de potenciais abordagens terapêuticas.

Resumo

O modelo de lesão por balão da artéria carótida em ratos tem sido bem estabelecida há mais de duas décadas. Mantém-se um método importante para estudar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na desdiferenciação do músculo liso vascular, a formação da neoíntima e remodelação vascular. Ratos machos Sprague-Dawley são os animais mais utilizados para este modelo. Ratas não são preferidos como hormônios femininos protegem contra doenças vasculares e, assim, apresentar uma variação para este procedimento. A carótida esquerda é tipicamente feridos com o carótida direita que serve como um controlo negativo. Lesão carótida esquerda é causada pelo balão insuflado que desnuda o endotélio e distender s parede do vaso. Após lesão, potenciais estratégias terapêuticas tais como a utilização de compostos farmacológicos e qualquer gene ou shRNA transferência pode ser avaliada. Tipicamente para gene ou transferência shRNA, a seção de feridos do lúmen do vaso é transduced localmente por 30 min com vIRAL partículas que codificam uma proteína ou shRNA ou para a entrega e expressão na parede do vaso lesionado. Espessamento neointimal que representa as células musculares lisas vasculares proliferativas normalmente picos a 2 semanas após a lesão. Os vasos são principalmente colhidas neste ponto de tempo para análise celular e molecular de vias de sinalização celular, bem como a expressão do gene e proteína. As embarcações também podem ser colhidas a pontos de tempo anteriores para determinar o início da expressão e / ou activação de uma proteína ou via específica, de acordo com os objectivos pretendidos experimentais. Os navios podem ser caracterizadas e avaliadas por meio da coloração histológica, imunohistoquímica, ensaios de proteína / mRNA, e ensaios de atividade. A artéria carótida direita intacto do mesmo animal é um controle interno ideal. Mudanças induzidas pelo prejuízo, em parâmetros moleculares e celulares pode ser avaliada comparando a artéria ferido à artéria controle direito interno. Da mesma forma, as modalidades terapêuticas pode ser avaliada comparando a firad e tratado artéria para o controle lesionado só artéria.

Introdução

Os cateteres de balão são dispositivos médicos utilizados no procedimento da angioplastia, com a finalidade de alargamento local obstruído (s) de ateroma ou trombo num vaso sanguíneo. Os lúmen do vaso estreitadas é forçado a abrir pelo balão inflado e fornecimento de sangue seria restaurada sequencialmente para aliviar os sintomas de isquemia a jusante, tais como angina, infarto do miocárdio e dor na perna. No entanto, o grande sucesso da angioplastia foi diminuída por complicações pós-operatórias, tais como resultados de força causando barotrauma vascular (lesão por balão), nomeadamente a remodelação da parede do vaso e, em muitos casos re-estreitamento da luz do vaso (reestenose) ^1.

Uma série de modelos animais têm sido desenvolvidas imitando o procedimento de angioplastia para ajudar os investigadores a compreender os mecanismos subjacentes a embarcação remodelação parede relacionados com o balão-lesão ^2. Entre todas as espécies de animais utilizados para a modelagem, o rato é o mais utilizado. Compared a coelhos, cães e porcos, as vantagens de os ratos são seu baixo custo, sua relativa facilidade de uso e o conhecimento atual da fisiologia rato. Embora os ratos têm uma vantagem adicional em uma ampla gama de estirpes geneticamente manipuladas, o navio ratinhos é muito pequeno para inserir um cateter balão. Ao longo das últimas três décadas, os ratos experimentais têm permitido aos pesquisadores obter uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e celulares que sustentam a formação da neoíntima e remodelação vascular ^3-6. Além da lesão do balão, o remodelamento vascular também estão envolvidos na maioria das doenças vasculares importantes, como a aterosclerose ^7,8, hipertensão ⁹ e ^{10 de} aneurisma. Assim, o conhecimento adquirido através do modelo de lesão balão é, em geral, benéfica para estudos globais da doença parede vascular.

O objectivo geral do modelo de lesão por balão de rato não é apenas de compreender ainda as doenças vasculares, mas também para testar a potência de novos agentes parao controle da doença ^11,12. Tratamento medicamentoso clínico atual para reestenose é aplicado por stents farmacológicos efectuadas através do lúmen do vaso logo após a angioplastia. Em modelos animais, uma forma eficiente ainda mais econômica para novos testes agente é um método de perfusão intraluminal locais bem desenvolvida. Os agentes candidatos que foram testados através deste método incluem drogas de moléculas pequenas ^13,14, citocinas ou factores de crescimento ^15,16, agentes de manipulação de genes (clones de cDNA, siRNA, etc.), ^17-20, e novas formulações farmacêuticas ^21,22.

Até agora, o modelo de lesão balão rato continua sendo um dos modelos mais úteis para o estudo de doenças / distúrbios vasculares. É o passo fundamental da bancada de cabeceira, geralmente como o primeiro passo, no sentido de in vitro para in vivo, mas não deve ser o último. O resultado de experiências com ratos precisa ser deliberado e ainda caracterizado antes tradução humanautilização clínica, devido à diferença de leitos vasculares e a anatomia do vaso, bem como as diferenças intrínsecas entre as espécies humana e de rato ^23-26. No entanto, ainda é uma ferramenta essencial na investigação médica translacional. Embora essa pesquisa utilizou a ser limitada pela falta de ratos geneticamente modificados, que deixou de ser um problema desde abordagens genômicas inéditas, como zinc-finger nucleases ^{27, 28} e TALENS CRISPR-Cas ²⁹ fizeram ratos knockout facilmente acessível.

Protocolo

NOTA: O uso de animais para os seguintes experimentos tem sido revisado e aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC).

1. Procedimentos pré-operatórios

1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos antes de usar.
   1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos 24 horas ou menos antes da cirurgia. Se várias cirurgias são realizadas no mesmo dia, esterilizar os instrumentos por um esterilizador talão seca entre cirurgias.
2. Filtro-esterilizar a solução salina antes da utilização.
3. Pesa-se o rato e o cálculo da dose de anestésicos (cetamina 80 mg / kg de xilazina e 7 mg / kg).
4. Administrar as drogas anestésicas intra-peritoneal (ip).
   1. Verificar a adequação da sedação por toe pitada de 5-10 min. Administrar uma pequena dose adicional de drogas (cetamina 7 mg / kg e xilazina 0,6 mg / kg), se a sedação não está completa.
   2. Certifique-se de que a agulha é profundo o suficiente para entrega de drogas intra-peritoneally porque falha na entrega de toda a solução de um fármaco para a cavidade peritoneal irá causar sedação inadequada.
      NOTA: As úlceras e perda de cabelo na pele no local da injecção será visíveis vários dias após a cirurgia, devido a inadvertida por via subcutânea (sc) de injecção de solução de fármaco.
5. Injectar 3 ml de solução salina estéril solução por via subcutânea (sc). Usando uma mecha de algodão estéril, aplicar uma pequena quantidade de pomada oftálmica para ambos os olhos para evitar as córneas de secar.
6. Prepare o equipamento de aquecimento. Almofadas de calor Pré-quentes por microondas ou banho-maria.
7. Coloque o animal indolentemente na plataforma cirúrgica.
   1. Retire o cabelo na região do pescoço ventral. Aplique o removedor de pêlos com um cotonete, espere 30 segundos e limpe completamente com gaze.
   2. Esfregue o pescoço com esfoliação iodopovidona e 70% de etanol.
8. Utilizar equipamento de proteção pessoal, incluindo vestido, capa de cabelo, máscara cirúrgica e óculos. Coloque em sterile luvas cirúrgicas no final antes de manusear os instrumentos cirúrgicos estéreis e suprimentos.
9. Armar o rato com um lençol cirúrgico estéril com apenas a região do pescoço exposto.

2. Procedimentos Cirúrgicos

1. Durante o procedimento cirúrgico, verifique a profundidade da sedação de subprodutos animais pitada toe em cada 15 min. Se um animal responde a toe pitada, adicionar pequena dose adicional (10% da dose inicial) da cetamina e xilazina.
2. Dissecar artéria carótida comum esquerda (CCA)
   1. Usar um bisturi para fazer uma incisão longitudinal recta no meio do pescoço. O comprimento aproximado de incisão é de 1,5-2 cm, com a finalidade de isolar uma porção de 1,5-2 cm da artéria. O comprimento pode variar depende da finalidade do estudo.
   2. Bluntly dissecar o tecido conjuntivo da pele. Mantenha as dicas fórceps-se e certifique-se para não perfurar a pele ou o tecido subjacente.
   3. Dissecar camadas musculares longitudinalmente Along do lado esquerdo da traquéia.
   4. Ao abrir-se a camada muscular, visualize a CCA esquerda com o nervo vago intimamente ligados. Sem rodeios dissecar ao lado da artéria carótida esquerda com extrema cautela para separar o nervo vago com o mínimo de alongamento.
   5. Dissecar CCA distal até a bifurcação. Dissecar cuidadosamente a bifurcação e dois ramos - artéria carótida interna (ACI) e artéria carótida externa (ECA).
   6. Manter dissecando em torno do CCA, até aproximadamente uma porção de 1,5-2 cm da artéria é isolado a partir dos tecidos circundantes.
3. Lesão por balão
   1. Permanentemente fazer uma ligadura sobre o ECA em aproximadamente 5 mm de distância da bifurcação. Permanentemente ligadura do ramo occipital da ECA, que é próximo à bifurcação da ECA e ICA. Também ligar permanentemente outros ramos, se houver, localizando entre a bifurcação e ECA ligadura - por exemplo, o ramo da tireóide superior. Sutura que é utilizado para todas as ligaduras é 4-0 pretoseda. Grampo na extremidade proximal do CCA e a extremidade distal da ICA.
      NOTA: Agora, o fluxo sanguíneo foi interrompido permanentemente através da ligadura (on ECA) ou temporariamente por meio de recorte (no CCA e ICA). Conteúdo luminal na área de bifurcação ter sido isolado a partir da circulação sistémica.
   2. Faça uma incisão arteriotomy no ECA por pequenos produtores, micro tesoura. Certifique-se de que a incisão fica perto do nó de sutura distal. Sangue limpo com soro fisiológico e cotonetes.
   3. Insira o cateter balão insuflado 2F para o lúmen do TCE. Avançar o cateter balão proximal ao lúmen CCA. Mantenha o avanço do cateter proximal até sua ponta chega onde o clipe fica.
   4. Conectar o dispositivo de insuflação do balão para um luer lock fêmea num torneira de 3 vias e ligar o bloqueio Luer macho da torneira de 3 vias para o cateter de balão.
   5. Lentamente inflar o balão com aproximadamente 1,5 atm de pressão, de modo a distender a artéria carótida para 1,5 vezes o diâmetro.
   6. Puxe cuidadosamente o balão rotativo de volta para a bifurcação.
   7. Desinflar o balão e avançá-lo de volta para a extremidade proximal. Encha-o novamente e repita o procedimento puxando-back mais duas vezes.
   8. Retirar o cateter balão do lúmen da artéria.
4. Administração Intraluminal de reagentes (por exemplo, siRNA, drogas)
   NOTA: Aqui, o reagente utilizado foi uma solução contendo partículas lentivirais que codificam quer estromais da molécula alvo shRNA Interacção 1 (STIM1) ou não-alvo de controlo de shRNA. STIM1 é um retículo endoplasmático (ER) única proteína transmembranar que é um sensor de ER Ca ²⁺ controlando a activação da membrana plasmática canais de Ca2 ⁺ e é regulado para cima durante a desdiferenciação do músculo liso vascular em um fenótipo proliferativo migratório ^12,30-33.
   1. Anexar um cateter intravascular sobre-a-agulha de uma seringa (24 L, 1,6 cm). Aspirar solução de 30 ul do ensaio reagentos. Inserir o cateter na mesma incisão no ECA.
   2. Avance a ponta do cateter no CCA e amarrar um pedaço de fio de sutura com um único nó no ECA para fixar o cateter e fechar a incisão temporariamente.
   3. Injectar a solução reagente de teste para o lúmen do CCA. Conservar a solução do lúmen do vaso para 30 min. Mantenha o tecido exposto úmido com solução salina e cobri-lo com um pedaço de gaze molhada.
   4. Após a incubação, aspirar a solução restante. Solte que nó simples e retirar o cateter.
   5. Amarre o ECA com um pedaço de fio de sutura proximal à incisão arteriotomy. Adicione o nó tão próximo quanto possível da bifurcação.
5. Feche acima da ferida.
   1. Uma vez que a lesão por balão e introdução do cateter pode causar um vazamento ou punção do vaso sanguíneo, remover o clipe na ICA e verifique se há algum vazamento. Se o sangramento for observado, aplicar um pedaço de gaze e aplique uma leve pressão para parar o sangramento.
   2. Removero outro clipe no CCA.
   3. Certifique-se de que não há sinais de hemorragia, e depois remover todas as braçadeiras e outros instrumentos cirúrgicos. Corte o excesso de suturas.
   4. Fechar ferida com suturas de pele (4-0 seda preta). Cotonete em todos os lados da ferida fechada com o Povidon-iodo ou outros agentes anti-séptico / agente bactericida / virucida. Injectar 3 ml de solução salina estéril sc

3. Os procedimentos pós-operatórios

1. Mantenha rato na almofada de calor após a cirurgia. Administrar uma dose de 0,05 mg / kg de buprenorfina por via de injecção intramuscular (im) para o rato. Durante o processo de recuperação, mantenha os olhos ea boca dos animais úmido. Monitorar o animal até que ele está acordado e ambulante.
2. Colocar o animal em uma gaiola limpa, sem qualquer roupa de cama até que esteja totalmente recuperado. Após a recuperação, o animal será devolvido para a sala de animais e alojados individualmente.

Resultados

Duas semanas após a lesão, artérias carótidas são colhidas, seccionados e sujeitos a análise morfológica. As artérias são cross-seccionados e corados com H & E (Figuras 1, 2B, C e 3). Da parede da artéria carótida de rato contém quatro camadas de lâmina elástica, que aparecem como linhas de rosa. A área entre a lâmina externa, lâmina elástica externa (EEL) e a lâmina mais interior, da lâmina elástica interna (IEL) é a camada de músculo liso meios (Figura 1). A área dentro do IEL é a...

Discussão

O rato da lesão do balão carótida foi bem descrito por Tulis em 2007 ^34. Tem sido exaustivamente discutido todos os detalhes deste procedimento pelo Dr. Tulis. Os leitores que estão interessados ​​em realizar este procedimento são altamente recomendados para ler protocolo Tulis '. No entanto, há uma coisa que não está concordando com o Dr. Tulis: Em vez de inflar o balão com soro fisiológico ou qualquer tipo de líquido, sugerimos para inflá-lo com o ar. De acordo com nossa experiência pessoal, inflando com líquido dificilment...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cateteres de embolectomia com balão Fogarty, 2 Cateteres de embolectomia com balão francês;	Edwards Lifesciences, Alemanha	Placa Operacional Deltaphase 120602F
- Inclui 2 Almofadas e 2 Isoladores	Braintree Scientific, Inc.	39OP
	Fisher Scientific	12-563-501
Pinça de Mosquito Hartmann 4" curvada	Apiary Medical, Inc. San Diego, CA	gS 22.1670
Retrator Crile 4" dupla extremidade	Apiary Medical, Inc.	gS 34.1934
Outros instrumentos cirúrgicos	Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD
Periférico Intravenoso (I.V.) Cânula, 24 G	BD	381312
Cetamina HCl, 100 mg/ml, 10 ml	Ketaset- Patterson Vet	07-803-6637
Xilazina (AnaSed), 20 mg/ml, 20 ml	Ketaset- Patterson Vet	07-808-1947
Buprenex, 0.3 mg/1 ml (5 ampolas/caixa)	Ketaset- Patterson Vet	07-850-2280
Loção de Depilação com Óleo de Bebê Nair - 9 oz	Amazon/Walmart/CVS	N/A
Dispositivo de Inflação	Demax Medical	DID30
D300 Torneira de 3 vias	B.Braun Medical Inc.
Pomada para Lágrimas Artificiais	Laboratórios de Rugby, Duluth, GA	N / A

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