Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica

Resumo

Neste trabalho mostramos um método para o preparo de fatias agudas de cérebro em temperatura fisiológica, utilizando uma solução fisiológica convencional sem modificações especiais para o corte (como adição de sacarose) e sem perfusão intracárdica do animal antes do preparo do corte.

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para a preparação de fatias cerebrais agudas. Este procedimento é um elemento crítico para experiências de patch-clamp electrofisiológicas que determina em grande parte a qualidade dos resultados. Demonstrou-se que omitindo o passo de arrefecimento durante o processo de corte é benéfico na obtenção de cortes e células saudáveis, especialmente quando se lida com as estruturas cerebrais altamente mielinizadas de animais maduros. Embora o mecanismo preciso pelo qual temperatura elevada apoia a saúde neural só se pode especular em cima, é lógico que, sempre que possível, a temperatura em que o corte é realizado deve ser perto de condições fisiológicas para evitar artefatos de temperatura relacionados. Outra vantagem importante deste método é a simplicidade do processo e, por conseguinte, o tempo de preparação curto. No método demonstrado ratinhos adultos são usadas, mas o mesmo procedimento pode ser aplicado com ratos mais jovens, bem como os ratos. Além disso, os seguintes cl remendoamp experiência é realizada em fatias horizontais do cerebelo, mas o mesmo procedimento pode também ser utilizado em outros planos, bem como outras áreas do cérebro posterior.

Introdução

O objectivo do método apresentado é obter de alta qualidade fatias cerebrais agudas para experiências in vitro electrofisiológicas, especialmente quando se utiliza adulto ou mesmo animais mais velhos.

O método de fatiamento cerebral aguda, como descrito por Skrede e Westgaard ¹ em duas frases elegantes, tornou-se um dos fundamentos da pesquisa em neurociência moderna e é empregado em inúmeras variações em todo o mundo. A qualidade das fatias é reflectido no número de neurónios por fatia vivo, o período de tempo durante o qual as células de manter as suas propriedades electrofisiológicas e morfológicas, bem como na inte....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Animal Care da Universidade Hebraica e do Comitê Use.

1. Preparar as soluções e ferramentas para corte

1. Prepare 1 litro de solução fisiológica padrão (SPS) que contém os iões descritas na Tabela 1.
   1. Prepara-se uma solução de estoque contendo os sais em 10 vezes a concentração final previamente em uma garrafa de vidro de armazenamento preenchido com 1000 ml de água desionizada (condutividade de 0,055 mS / cm). Adicionar sais (NaCl, KCl, KH ₂ PO _4, e _MgSO4), e agita-se até estar completament....

Resultados

Fatias preparados do modo descrito pode ser usado para várias experiências electrofisiológicas e Optogenetic. Na Figura 3A e 3C, que mostram um exemplo representativo de uma fatia horizontal cerebelar e uma fatia cerebral cortical coronal, respectivamente, vistas sob interferência diferencial (DIC) ópticas. Na fatia cerebelar, vários tipos de neurônios do cerebelo pode ser facilmente reconhecido por sua forma e localização das células do corpo, permitindo alvo registros eletrofisiológic.......

Discussão

Nós demonstramos um método para a preparação de fatias cerebrais agudas a partir de ratos em vez de temperatura fisiológica gelada.

Demonstrou-se ¹¹ que a qualidade das fatias obtidas em condições de calor é superior quando em comparação com as preparadas com condições de frio, desde que a lâmina tem fatiador de vibração vertical mínima. Cortando na temperatura fisiológica pode impedir artefatos fisiológicos causados ​​pela baixa temperatura, como as relacionadas a mudanças nos pr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pentobarbital	CTS	170066	Concentração: 60 mg/ml em soro fisiológico.
Tesoura grande	FST	14001-16	Qualquer tesoura grande ou guilhotina com bordas suficientemente afiadas pode ser usada para decapitação
Tesoura de íris	Prestige medical	48,148	Qualquer tesoura de ponta fina pode ser usada, desde que as lâminas da tesoura não tenham mais de 1,5–
Pinça de ponta fina de 2 cm	FST	11254-20
Bisturi:	FST	91003-12
Lâmina de bisturi #11	FST	10011-00
Espátula pequena	Fisher	2350
Papel			Qualquer marca de laboratório pode ser usada.
Placas de Petri	Duroplan	Z231509-1
Copos de vidro	Pipeta	SCHOT 10022846
Pasteur	Maple Leaf Brand	14672-029
Super cola	LOCTITE	4091361/1
Slicer	Campden	7000-smz
Lâmina de fatiar cerâmica	Campden	7550-1-C
Aquecedor/agitador			Para aquecer o SPS para o procedimento
Chaleira			Para aquecer água para controle de temperatura
Câmara de recuperação de fatias + unidade de aquecimento	Warner instrumentos	BSC-HT +  Modelos BSC-BUW	construídos em casa também podem ser usados.
Termômetro			Para monitorar a temperatura SPS durante a dissecção e fatiamento

de filtro magnético elétrica