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Summary

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Abstract

Aqui apresentamos um protocolo para a preparação de fatias cerebrais agudas. Este procedimento é um elemento crítico para experiências de patch-clamp electrofisiológicas que determina em grande parte a qualidade dos resultados. Demonstrou-se que omitindo o passo de arrefecimento durante o processo de corte é benéfico na obtenção de cortes e células saudáveis, especialmente quando se lida com as estruturas cerebrais altamente mielinizadas de animais maduros. Embora o mecanismo preciso pelo qual temperatura elevada apoia a saúde neural só se pode especular em cima, é lógico que, sempre que possível, a temperatura em que o corte é realizado deve ser perto de condições fisiológicas para evitar artefatos de temperatura relacionados. Outra vantagem importante deste método é a simplicidade do processo e, por conseguinte, o tempo de preparação curto. No método demonstrado ratinhos adultos são usadas, mas o mesmo procedimento pode ser aplicado com ratos mais jovens, bem como os ratos. Além disso, os seguintes cl remendoamp experiência é realizada em fatias horizontais do cerebelo, mas o mesmo procedimento pode também ser utilizado em outros planos, bem como outras áreas do cérebro posterior.

Introduction

O objectivo do método apresentado é obter de alta qualidade fatias cerebrais agudas para experiências in vitro electrofisiológicas, especialmente quando se utiliza adulto ou mesmo animais mais velhos.

O método de fatiamento cerebral aguda, como descrito por Skrede e Westgaard ¹ em duas frases elegantes, tornou-se um dos fundamentos da pesquisa em neurociência moderna e é empregado em inúmeras variações em todo o mundo. A qualidade das fatias é reflectido no número de neurónios por fatia vivo, o período de tempo durante o qual as células de manter as suas propriedades electrofisiológicas e morfológicas, bem como na integridade do tecido. Além disso, a duração máxima para gravações estáveis ​​depende da qualidade das fatias. Assim, ao longo das décadas, o método de corte original foi desenvolvido por grupos de pesquisa individuais para melhorar a recuperação após o corte fatia ^2-10, muitas vezes por meio de modificações complexas de composição de cortar osoluções de recuperação r (como a adição de ácido ascórbico, tioureia ou mesmo _de H ₂ O _2), bem como intra-cardíaca de pré-perfusão do animal com soluções fisiológicas arrefecidos.

Tal como foi recentemente mostrado ^11, temperatura fisiológica durante o corte parece ser mais benéfico do que o arrefecimento para a saúde neuronal; a melhora é mais marcante quando se trabalha com adultos (2-8 meses) roedores. Evitar mudanças dramáticas de temperatura impede artefatos devido a processos dependentes da temperatura nas células, como plasticidade e ¹³ canais iónicos cinética ^13,14. Tais mudanças podem influenciar a tensão de membrana e sinalização intracelular de cálcio, limiar pico e pico de forma.

O método "quente" fatia aguda preparação aqui apresentado é um processo geral para a obtenção de alta qualidade fatias cerebrais agudas a partir de qualquer região do cérebro, incluindo no cerebelo, córtex e no hipocampo, núcleos do tronco cerebral ^{16 <}/ Sup>, bem como o bolbo olfactivo, tanto em ratos e ratinhos.

Notavelmente, o procedimento temperatura fatiamento fisiológico requer que a lâmina de corte vibra quase perfeitamente na horizontal e é, sem quaisquer defeitos estruturais. Tal precisão pode não ser possível com modelos de cortador de idosos; em tais casos, é recomendável a realização da preparação fatia em condições de frio como a temperatura baixa parece tornar o tecido mais resistente a danos mecânicos, mesmo que à custa de aberrações metabólicas.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Animal Care da Universidade Hebraica e do Comitê Use.

1. Preparar as soluções e ferramentas para corte

1. Prepare 1 litro de solução fisiológica padrão (SPS) que contém os iões descritas na Tabela 1.
   1. Prepara-se uma solução de estoque contendo os sais em 10 vezes a concentração final previamente em uma garrafa de vidro de armazenamento preenchido com 1000 ml de água desionizada (condutividade de 0,055 mS / cm). Adicionar sais (NaCl, KCl, KH ₂ PO _4, e _MgSO4), e agita-se até estar completamente dissolvido. Guardar a solução estoque em 4 ° C.
   2. Adicione a solução final SPS no dia do experimento. Acrescentam-se 100 ml da solução de estoque de 700 ml de água purificada, dissolver a glicose (3,6 g) e _NaHCO3 (2,18 g) usando uma barra magnética e, em seguida, adicionar água purificada até 1 L.
   3. Equilibrar as solutisobre ele por gaseamento com 95% _O2 / 5% de CO ₂ durante ~ 20 min. Após isto, adicionar 2 ml de uma solução M de _CaCl2.
2. Reúna as seguintes ferramentas (Figura 1).
   1. Prepare grandes tesoura ou outro instrumento de decapitação, pequenas tesouras cirúrgicas para a abertura do crânio, uma pinça de ponta fina para elevação do crânio para expor o cérebro, bisturi com lâmina para dissecar a parte desejada do cérebro para ser cortada e uma pequena espátula para manipular o partes cerebrais dissecados.
   2. Além disso, prepare-se pequenos pedaços de papel de filtro para remover o excesso de líquido do cérebro, dois pequenos pratos de Petri para o cérebro para ser dissecado em dois copos de vidro de 500 ml para conter água aquecida purificada e SPS, e cola de cianoacrilato para colar do cérebro para o fase de corte.
   3. Prepare uma escova pequena para lidar com as fatias durante o corte e uma pipeta de Pasteur de vidro de boca larga para mover as fatias do banho de corte para o cha de recuperaçãomber. Desinfetar as ferramentas para impedir o crescimento de bactérias nos banhos quentes fatia. Além disso, usar luvas de laboratório limpas.
3. Prepare uma fatia de recuperação câmara submersa tal como descrito por Gibb e Edwards ^15. Continuamente gás do SPS nele com 95% _O2 / 5% de _CO2 e manter a 36 ° C. Certifique-se de que o gaseamento não resulta em pequenas bolhas de ar no banho que pode danificar fatias.
4. Quente ~ 300 ml da SPS a 36 ° C sobre uma placa de aquecimento com agitador magnético ou em um banho de água. Se uma placa de aquecimento é usado, tome cuidado para evitar que a solução do superaquecimento, o que pode resultar na precipitação de íons. No caso de isso acontecer, SPS frescos quentes em vez de arrefecimento do antigo.
5. Traga ~ 500 ml de água purificada para ferver com uma chaleira eléctrica e, num copo, misture 300 ml de com água fria para obter água um pouco mais quente do que a temperatura de corte. Utilize este aqueceu água purificada durante a decapitação e usar o remaining da água fervida mais tarde para a manutenção da temperatura fisiológica do banho de corte.
6. Anestesiar o rato por injecção de 0,1 ml de pentobarbital (60 mg / ml) por via intraperitoneal. Depois de alguns minutos, verificar se o animal não responder à forte do dedo do pé ou da cauda pitadas de verificar a falta de sensação.

2. Dissecando o cérebro

1. Decapitar o mouse rapidamente cortando o pescoço com as tesouras grandes, perto da parte de trás do crânio, e deixar a cabeça cair no copo com água purificada aquecida para lavar o excesso de sangue.
2. Exponha o forame magno no crânio sob os músculos do pescoço e da pele, possivelmente removendo mais do pescoço com as pequenas tesouras.
3. Puxar a pele na parte superior do crânio de ser capaz de ver claramente as suturas cranianas, a fim de orientar a abertura do crânio.
4. Corte o crânio aberto, inserindo a ponta inferior das pequenas tesouras através do forame magno e imediatamente transformá-los em direção ao lado lateral. Com cuidado, cortar ao longo do bordo lateral do osso parietal até uma localização atrás dos olhos e da sutura fronto-parietal; em seguida, virar-se para o centro do crânio e cortar através da linha média para o outro lado do crânio (ver linha tracejada verde na Figura 2A).
5. Utilizando uma pinça de ponta fina, levante o crânio do canto fronto-parietal e puxe-o na diagonal para cima e para os lados para expor o cérebro (ver amarelo seta tracejada na Figura 2A). Certifique-se de que o crânio não está ligado a qualquer osso ou pele da cabeça, de modo que o cérebro vai ficar no lugar quando o crânio é levantado. No caso em que o cérebro está em movimento, com o crânio, utilizar as pequenas tesouras para remover qualquer tecido conjuntivo entre o crânio e o cérebro.
6. Quando o cérebro é exposta, não permitem que o cérebro a ser seco. Assim, execute os passos seguintes, mantendo o crânio eo cérebro em uma placa de Petri cheia com aquecido, gaseados SPS.
7. Retire a parte do cérebro usada para o eXperiment a partir do resto do cérebro utilizando um bisturi e uma espátula. No caso de utilizar o cerebelo, separar da parte frontal do cérebro por um único corte através do mesencéfalo e ponte (ao longo das linhas vermelhas nas Figuras 2B-D) e movê-lo para uma pequena placa de Petri que contém frescos, gaseados SPS.
8. Remover o tronco cerebral para formar uma base recta e ampla para a colagem do cérebro a fase de corte ao cortar o cerebelo no plano horizontal. Resumidamente colocar o cerebelo em um pedaço húmido de papel de filtro de modo que o lado que foi cortado a partir do prosencéfalo está voltada para baixo.
   1. Cortar o tronco cerebral com um bisturi para formar a base (tal como indicado com a linha azul na Figura 2B), e devolver o cerebelo para o SPS. Quando são necessários outros planos de corte, cortar o bloco cerebelo em conformidade (linhas azuis nas Figuras 2C e D).

3. Cortando o Cérebro

1. Prepare o estágio de corte, verificando que é dry, antes da aplicação de uma pequena gota de supercola no meio do palco.
2. Levante o bloco cérebro do SPS com uma espátula com a correta voltada para cima, e retire todo o excesso de líquido do cérebro usando pequenos pedaços de papel de filtro. Então, com um único movimento, deslize o cérebro da espátula sobre a gota de cola no palco.
3. Para evitar que o cérebro de secagem e a cola de correr para cima sobre os lados do tecido, aplicar algumas gotas de SPS com uma pipeta de Pasteur e colocar a fase de corte na câmara de corte. Alinhar o bloco de cérebro de modo a que as regiões de interesse (por exemplo, do córtex cerebelar) estão virados para a lâmina e, portanto, vai ser submetido a menor quantidade de pressão mecânica antes de ser cortado.
4. Corte cada fatia de acordo com as instruções do fabricante, enquanto constantemente gaseificação do RPU na câmara de corte, bem como mantendo a temperatura a 34-37 ° C. Manter a temperatura da câmara de corte, neste intervalo, preenchendo o external câmara do cortador com água purificada aquecida e substituindo a água sempre que a temperatura cai muito baixa.
   Nota: Os parâmetros de corte devem ser experimentalmente encontrado para cada tipo de tecido e dos neurônios que estão sendo examinados. No caso de o Campden SMZ 700 fatiador com lâminas de cerâmica e células cerebelares de Golgi, usar 0,75 milímetros amplitude de vibração a 65 Hz e velocidade de 0,05 mm / seg avançando; para os neurónios cerebelares nucleares maior amplitude e frequência (1 mm e 90 Hz, respectivamente) e menor velocidade de avanço (0,01-0,02 mm / seg) são recomendados. Para tanto Golgi e os neurônios nucleares do cerebelo, espessura do corte deve ser de 300 mm.
5. Durante o corte, não permita que as fatias de dobrar sobre si mesmos. Para evitar que isto delicadamente apoiando-os com uma escova macia, de preferência tocando a fatia apenas em regiões que não são de interesse para o experimento. Tome cuidado para evitar que a escova de tocar a lâmina vibratome; especialmente no caso das lâminas de cerâmica, até mesmo um ligeiro contactopode danificar a lâmina.
6. Mova cada fatia da câmara de corte para a recuperação / exploração câmara usando um de boca larga, fogo-polido Pasteur de vidro pipeta.
7. Deixe as fatias descansar na câmara durante pelo menos 1 hora antes do início da experiência. Isto permite a degradação de tecidos e células danificadas ou a morrer e, portanto, resulta numa superfície de corte mais limpo. Durante a primeira hora, manter a temperatura da RPU na câmara no intervalo de 34-36 ° C; garantir que as fatias não são tocados por bolhas de ar que podem danificar as fatias ou torná-los flutuar.

4. Experiência

1. Após 1 hora, deixar a temperatura da câmara de recuperação de arrefecer até à temperatura ambiente (17-25 ° C).
   NOTA: Este pode prolongar o período de tempo durante o qual as fatias pode ser utilizado por abrandar o crescimento de bactérias, bem como o metabolismo celular. Este período depende da região do cérebro e do tipo de célula. Por exemplo, certos tipos de células de Golgi pode ser encontrado para ser saudável em fatias8 h após o corte ao passo que outros tipos durar apenas 6 horas.
2. Depois de 1 hora se passou desde o corte, use as fatias para vários experimentos eletrofisiológicos.

Representative Results

Discussion

Nós demonstramos um método para a preparação de fatias cerebrais agudas a partir de ratos em vez de temperatura fisiológica gelada.

Demonstrou-se ¹¹ que a qualidade das fatias obtidas em condições de calor é superior quando em comparação com as preparadas com condições de frio, desde que a lâmina tem fatiador de vibração vertical mínima. Cortando na temperatura fisiológica pode impedir artefatos fisiológicos causados ​​pela baixa temperatura, como as relacionadas a mudanças nos processos metabólicos ^17-19 que podem se manifestar em aberrações de uma única célula, bem como o comportamento da rede. Além disso, mesmo que o procedimento de corte deve, obviamente, ser concluído sem atrasos desnecessários, não há necessidade de pressa com o corte (como é quando o corte em condições de gelo-frio, a fim de terminar o corte antes de soluções tornam-se demasiado quente, e para evitar que o danos causados ​​por congelamento de longa duração do tecido). Assim, velocidades de corte mais lento pode ser-nosed. Isto pode ser benéfico em caso de corte de estruturas muito delicadas. Por último, omitindo a etapa de arrefecimento de ambas as soluções do cérebro e reduz significativamente a quantidade de tempo necessário para o procedimento, bem como a sua complexidade. O arrefecimento da solução até à temperatura gelada requer cerca de 40 minutos mais do que o aquecimento da solução até à temperatura fisiológica, deixando mais tempo para a própria experiência.

Demonstrou-se ²⁰ que a intensidade da fluorescência nos neurónios corticais em ratinhos GAD67-GFP é mais forte quando se examina fatias cortadas em 20 ° C, em comparação com aqueles cortado em 0 ° C. Isto apoia ainda mais a noção de que o corte na temperatura gelada exerce uma influência nociva sobre a viabilidade dos neurônios. Por outro lado, no mesmo papel, foi demonstrado que a densidade de neurônios fluorescentes foi reduzida em cortado obtido a 37 ° C em comparação com aqueles corte a 20 ° C. A polêmica com os resultados pode arise a partir do facto de a deflexão-z não foi feita sob considerações. Como mencionado acima, o z-deflexão tem uma forte influência sobre a qualidade dos tecidos, quando o corte da temperatura fisiológica, para além da qualidade da lâmina e a velocidade e outras configurações do moinho de facas.

Uma das partes cruciais do processo envolve o ajuste fino da lâmina cortador antes de cortar. Ao contrário de quando se utiliza soluções geladas, onde o corte susceptível de corte envolve tanto horizontal como também vertical "cracking" das membranas lipídicas rígidas, sob condições fisiológicas, qualquer movimento da lâmina cortador na direcção-z irá causar danos no tecido. Para minimizar isso, a lâmina deve ser tão duro e reto possível; em nossa experiência, lâminas de barbear convencionais têm muitas imperfeições para ser utilizável. Lâminas de aço inoxidável de alta qualidade projetados especificamente para uso vibratome são melhores, mas para melhores resultados, sugerimos ceram single-chanfradolâminas CI. Além disso, é altamente recomendável passar um tempo significativo para o alinhamento horizontal perfeito das lâminas, pois isso influencia diretamente na qualidade fatia. Usamos o fatiador de Campden 700SMZ que permite o ajuste do alinhamento da lâmina de modo que a vibração no plano z é menor do que 0,5 um. Com efeito, a limitação mais importante do método de corte a quente é a sua dependência na qualidade do fatiador de lâmina e estabilidade. Se esses requisitos não podem ser satisfeitas, é aconselhável a utilização do método de corte tradicional gelada em vez disso, apesar das desvantagens em cortar em solução gelada como variando osmolaridade de ser parcialmente congelada.

O método demonstrado é usado para obter fatias horizontais do cerebelo; com modificações simples o mesmo método pode ser usado para obter fatias quer na coronal ou o plano sagital, a partir de muitas outras regiões de primeiro plano – ou mesencéfalo, bem como o tronco cerebral. Para fatias de as partes mais anterior do cérebro anterior e do olfactory sistema, o crânio deve ser cortado mais anterior para evitar danos a estas partes. Nós propositadamente manter o método mais simples e mais curto possível e não empregam pré-perfusão do animal, nem nós substitua nenhum dos componentes da solução fisiológica para o corte. Isso permite que o método a ser modificado de acordo com o subtipo neuronal específica de interesse. É provável que as modificações das soluções de corte (tal como descrito nas referências na Introdução) pode melhorar ainda mais a viabilidade das fatias e a solidez dos resultados. Em geral, o método deve ser compatível com a maioria das outras soluções fisiológicas comuns vulgarmente utilizados para a gravação electrofisiológico.

No método mostrado aqui, são cortadas fatias de 300 um de espessura. A espessura da fatia óptima depende da região cerebral cortado e as células de interesse. Para considerações de integridade da rede, as fatias não deve ser mais fino do que 250 um, e por causa de limitações de difusão para cimapor limite da espessura de corte é de aproximadamente 400-450 mm.

Um passo essencial neste método que diz respeito a colagem do cérebro para a fase de corte, mesmo de pequena dimensão como a instabilidade no tecido pode resultar em fatias desiguais ou inutilizáveis. Assim, o cuidado deve ser tomado para certificar-se de que a superfície do cérebro não tem excesso SPS quando ele é baixado sobre a queda de cola; Também, muita cola vai resultar no cérebro encontra-se de forma desigual sobre o palco e, possivelmente, separando-se a fase durante o corte. Além disso, o excesso de cola pode arrastar-se sobre os lados do tecido e, para além de introduzir a falta de homogeneidade nas fatias, pode danificar a lâmina.

Existem algumas dificuldades que pode subir ao alterar o protocolo de corte a partir do método de gelado com o método demonstrado quente. Uma das dificuldades é o aparecimento de bactérias nas fatias. Por esta razão, é importante para desinfectar as ferramentas, a câmara, e o banho de corte com etanol antes do procedimento. Além disso, transformandofora do sistema de aquecimento no banho de recuperação após 1 hr retarda o crescimento de bactérias.

Finalmente, deve-se ressaltar que a melhoria da saúde dos neurônios em fatias cortadas em temperatura fisiológica pode também resultar em mudanças em suas propriedades intrínsecas. Portanto, é aconselhável efectuar uma primeira comparação dos resultados obtidos a partir de fatias com ambos os métodos frias e quentes, especialmente se as experiências são parte de um projecto mais tempo com trabalhos anteriores feitas usando o método a frio.

Materials

Pentobarbital	CTS	170066	Concentration: 60 mg/ml in physiological saline.
Big scissors 	FST	14001-16	Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation 
Iris scissors 	Prestige medical	48,148	Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm
Fine tip forceps 	FST	11254-20
Scalpel 	FST	91003-12
Scalpel blade #11	FST	10011-00
Small spatula 	Fisher 	2350
Filter paper			Any laboratory brand can be used.
Petri dishes	Duroplan	Z231509-1
Glass beakers 	SCHOT	10022846
Pasteur pipette 	Maple Leaf Brand	14672-029
Super glue 	LOCTITE	4091361/1
Slicer	Campden	7000-smz
Ceramic slicing blade	Campden	7550-1-C
Magnetic heater/stirrer			For heating up the SPS for the procedure
Electric kettle			For heating up water for temperature control
Slice recovery chamber + heating unit	Warner instruments	 BSC-HT +  BSC-BUW	Home-built models may also be used.
Thermometer			For monitoring SPS temperature during dissection and slicing