Neste trabalho mostramos um método para o preparo de fatias agudas de cérebro em temperatura fisiológica, utilizando uma solução fisiológica convencional sem modificações especiais para o corte (como adição de sacarose) e sem perfusão intracárdica do animal antes do preparo do corte.
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Artigo de método
Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aqui apresentamos um protocolo para a preparação de fatias cerebrais agudas. Este procedimento é um elemento crítico para experiências de patch-clamp electrofisiológicas que determina em grande parte a qualidade dos resultados. Demonstrou-se que omitindo o passo de arrefecimento durante o processo de corte é benéfico na obtenção de cortes e células saudáveis, especialmente quando se lida com as estruturas cerebrais altamente mielinizadas de animais maduros. Embora o mecanismo preciso pelo qual temperatura elevada apoia a saúde neural só se pode especular em cima, é lógico que, sempre que possível, a temperatura em que o corte é realizado deve ser perto de condições fisiológicas para evitar artefatos de temperatura relacionados. Outra vantagem importante deste método é a simplicidade do processo e, por conseguinte, o tempo de preparação curto. No método demonstrado ratinhos adultos são usadas, mas o mesmo procedimento pode ser aplicado com ratos mais jovens, bem como os ratos. Além disso, os seguintes cl remendoamp experiência é realizada em fatias horizontais do cerebelo, mas o mesmo procedimento pode também ser utilizado em outros planos, bem como outras áreas do cérebro posterior.
Introdução
O objectivo do método apresentado é obter de alta qualidade fatias cerebrais agudas para experiências in vitro electrofisiológicas, especialmente quando se utiliza adulto ou mesmo animais mais velhos.
O método de fatiamento cerebral aguda, como descrito por Skrede e Westgaard 1 em duas frases elegantes, tornou-se um dos fundamentos da pesquisa em neurociência moderna e é empregado em inúmeras variações em todo o mundo. A qualidade das fatias é reflectido no número de neurónios por fatia vivo, o período de tempo durante o qual as células de manter as suas propriedades electrofisiológicas e morfológicas, bem como na integridade do tecido. Além disso, a duração máxima para gravações estáveis depende da qualidade das fatias. Assim, ao longo das décadas, o método de corte original foi desenvolvido por grupos de pesquisa individuais para melhorar a recuperação após o corte fatia 2-10, muitas vezes por meio de modificações complexas de composição de cortar osoluções de recuperação r (como a adição de ácido ascórbico, tioureia ou mesmo de H 2 O 2), bem como intra-cardíaca de pré-perfusão do animal com soluções fisiológicas arrefecidos.
Tal como foi recentemente mostrado 11, temperatura fisiológica durante o corte parece ser mais benéfico do que o arrefecimento para a saúde neuronal; a melhora é mais marcante quando se trabalha com adultos (2-8 meses) roedores. Evitar mudanças dramáticas de temperatura impede artefatos devido a processos dependentes da temperatura nas células, como plasticidade e 13 canais iónicos cinética 13,14. Tais mudanças podem influenciar a tensão de membrana e sinalização intracelular de cálcio, limiar pico e pico de forma.
O método "quente" fatia aguda preparação aqui apresentado é um processo geral para a obtenção de alta qualidade fatias cerebrais agudas a partir de qualquer região do cérebro, incluindo no cerebelo, córtex e no hipocampo, núcleos do tronco cerebral 16 </ Sup>, bem como o bolbo olfactivo, tanto em ratos e ratinhos.
Notavelmente, o procedimento temperatura fatiamento fisiológico requer que a lâmina de corte vibra quase perfeitamente na horizontal e é, sem quaisquer defeitos estruturais. Tal precisão pode não ser possível com modelos de cortador de idosos; em tais casos, é recomendável a realização da preparação fatia em condições de frio como a temperatura baixa parece tornar o tecido mais resistente a danos mecânicos, mesmo que à custa de aberrações metabólicas.
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Animal Care da Universidade Hebraica e do Comitê Use.
1. Preparar as soluções e ferramentas para corte
- Prepare 1 litro de solução fisiológica padrão (SPS) que contém os iões descritas na Tabela 1.
- Prepara-se uma solução de estoque contendo os sais em 10 vezes a concentração final previamente em uma garrafa de vidro de armazenamento preenchido com 1000 ml de água desionizada (condutividade de 0,055 mS / cm). Adicionar sais (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, e MgSO4), e agita-se até estar completamente dissolvido. Guardar a solução estoque em 4 ° C.
- Adicione a solução final SPS no dia do experimento. Acrescentam-se 100 ml da solução de estoque de 700 ml de água purificada, dissolver a glicose (3,6 g) e NaHCO3 (2,18 g) usando uma barra magnética e, em seguida, adicionar água purificada até 1 L.
- Equilibrar as solutisobre ele por gaseamento com 95% O2 / 5% de CO 2 durante ~ 20 min. Após isto, adicionar 2 ml de uma solução M de CaCl2.
- Reúna as seguintes ferramentas (Figura 1).
- Prepare grandes tesoura ou outro instrumento de decapitação, pequenas tesouras cirúrgicas para a abertura do crânio, uma pinça de ponta fina para elevação do crânio para expor o cérebro, bisturi com lâmina para dissecar a parte desejada do cérebro para ser cortada e uma pequena espátula para manipular o partes cerebrais dissecados.
- Além disso, prepare-se pequenos pedaços de papel de filtro para remover o excesso de líquido do cérebro, dois pequenos pratos de Petri para o cérebro para ser dissecado em dois copos de vidro de 500 ml para conter água aquecida purificada e SPS, e cola de cianoacrilato para colar do cérebro para o fase de corte.
- Prepare uma escova pequena para lidar com as fatias durante o corte e uma pipeta de Pasteur de vidro de boca larga para mover as fatias do banho de corte para o cha de recuperaçãomber. Desinfetar as ferramentas para impedir o crescimento de bactérias nos banhos quentes fatia. Além disso, usar luvas de laboratório limpas.
- Prepare uma fatia de recuperação câmara submersa tal como descrito por Gibb e Edwards 15. Continuamente gás do SPS nele com 95% O2 / 5% de CO2 e manter a 36 ° C. Certifique-se de que o gaseamento não resulta em pequenas bolhas de ar no banho que pode danificar fatias.
- Quente ~ 300 ml da SPS a 36 ° C sobre uma placa de aquecimento com agitador magnético ou em um banho de água. Se uma placa de aquecimento é usado, tome cuidado para evitar que a solução do superaquecimento, o que pode resultar na precipitação de íons. No caso de isso acontecer, SPS frescos quentes em vez de arrefecimento do antigo.
- Traga ~ 500 ml de água purificada para ferver com uma chaleira eléctrica e, num copo, misture 300 ml de com água fria para obter água um pouco mais quente do que a temperatura de corte. Utilize este aqueceu água purificada durante a decapitação e usar o remaining da água fervida mais tarde para a manutenção da temperatura fisiológica do banho de corte.
- Anestesiar o rato por injecção de 0,1 ml de pentobarbital (60 mg / ml) por via intraperitoneal. Depois de alguns minutos, verificar se o animal não responder à forte do dedo do pé ou da cauda pitadas de verificar a falta de sensação.
2. Dissecando o cérebro
- Decapitar o mouse rapidamente cortando o pescoço com as tesouras grandes, perto da parte de trás do crânio, e deixar a cabeça cair no copo com água purificada aquecida para lavar o excesso de sangue.
- Exponha o forame magno no crânio sob os músculos do pescoço e da pele, possivelmente removendo mais do pescoço com as pequenas tesouras.
- Puxar a pele na parte superior do crânio de ser capaz de ver claramente as suturas cranianas, a fim de orientar a abertura do crânio.
- Corte o crânio aberto, inserindo a ponta inferior das pequenas tesouras através do forame magno e imediatamente transformá-los em direção ao lado lateral. Com cuidado, cortar ao longo do bordo lateral do osso parietal até uma localização atrás dos olhos e da sutura fronto-parietal; em seguida, virar-se para o centro do crânio e cortar através da linha média para o outro lado do crânio (ver linha tracejada verde na Figura 2A).
- Utilizando uma pinça de ponta fina, levante o crânio do canto fronto-parietal e puxe-o na diagonal para cima e para os lados para expor o cérebro (ver amarelo seta tracejada na Figura 2A). Certifique-se de que o crânio não está ligado a qualquer osso ou pele da cabeça, de modo que o cérebro vai ficar no lugar quando o crânio é levantado. No caso em que o cérebro está em movimento, com o crânio, utilizar as pequenas tesouras para remover qualquer tecido conjuntivo entre o crânio e o cérebro.
- Quando o cérebro é exposta, não permitem que o cérebro a ser seco. Assim, execute os passos seguintes, mantendo o crânio eo cérebro em uma placa de Petri cheia com aquecido, gaseados SPS.
- Retire a parte do cérebro usada para o eXperiment a partir do resto do cérebro utilizando um bisturi e uma espátula. No caso de utilizar o cerebelo, separar da parte frontal do cérebro por um único corte através do mesencéfalo e ponte (ao longo das linhas vermelhas nas Figuras 2B-D) e movê-lo para uma pequena placa de Petri que contém frescos, gaseados SPS.
- Remover o tronco cerebral para formar uma base recta e ampla para a colagem do cérebro a fase de corte ao cortar o cerebelo no plano horizontal. Resumidamente colocar o cerebelo em um pedaço húmido de papel de filtro de modo que o lado que foi cortado a partir do prosencéfalo está voltada para baixo.
- Cortar o tronco cerebral com um bisturi para formar a base (tal como indicado com a linha azul na Figura 2B), e devolver o cerebelo para o SPS. Quando são necessários outros planos de corte, cortar o bloco cerebelo em conformidade (linhas azuis nas Figuras 2C e D).
3. Cortando o Cérebro
- Prepare o estágio de corte, verificando que é dry, antes da aplicação de uma pequena gota de supercola no meio do palco.
- Levante o bloco cérebro do SPS com uma espátula com a correta voltada para cima, e retire todo o excesso de líquido do cérebro usando pequenos pedaços de papel de filtro. Então, com um único movimento, deslize o cérebro da espátula sobre a gota de cola no palco.
- Para evitar que o cérebro de secagem e a cola de correr para cima sobre os lados do tecido, aplicar algumas gotas de SPS com uma pipeta de Pasteur e colocar a fase de corte na câmara de corte. Alinhar o bloco de cérebro de modo a que as regiões de interesse (por exemplo, do córtex cerebelar) estão virados para a lâmina e, portanto, vai ser submetido a menor quantidade de pressão mecânica antes de ser cortado.
- Corte cada fatia de acordo com as instruções do fabricante, enquanto constantemente gaseificação do RPU na câmara de corte, bem como mantendo a temperatura a 34-37 ° C. Manter a temperatura da câmara de corte, neste intervalo, preenchendo o external câmara do cortador com água purificada aquecida e substituindo a água sempre que a temperatura cai muito baixa.
Nota: Os parâmetros de corte devem ser experimentalmente encontrado para cada tipo de tecido e dos neurônios que estão sendo examinados. No caso de o Campden SMZ 700 fatiador com lâminas de cerâmica e células cerebelares de Golgi, usar 0,75 milímetros amplitude de vibração a 65 Hz e velocidade de 0,05 mm / seg avançando; para os neurónios cerebelares nucleares maior amplitude e frequência (1 mm e 90 Hz, respectivamente) e menor velocidade de avanço (0,01-0,02 mm / seg) são recomendados. Para tanto Golgi e os neurônios nucleares do cerebelo, espessura do corte deve ser de 300 mm. - Durante o corte, não permita que as fatias de dobrar sobre si mesmos. Para evitar que isto delicadamente apoiando-os com uma escova macia, de preferência tocando a fatia apenas em regiões que não são de interesse para o experimento. Tome cuidado para evitar que a escova de tocar a lâmina vibratome; especialmente no caso das lâminas de cerâmica, até mesmo um ligeiro contactopode danificar a lâmina.
- Mova cada fatia da câmara de corte para a recuperação / exploração câmara usando um de boca larga, fogo-polido Pasteur de vidro pipeta.
- Deixe as fatias descansar na câmara durante pelo menos 1 hora antes do início da experiência. Isto permite a degradação de tecidos e células danificadas ou a morrer e, portanto, resulta numa superfície de corte mais limpo. Durante a primeira hora, manter a temperatura da RPU na câmara no intervalo de 34-36 ° C; garantir que as fatias não são tocados por bolhas de ar que podem danificar as fatias ou torná-los flutuar.
4. Experiência
- Após 1 hora, deixar a temperatura da câmara de recuperação de arrefecer até à temperatura ambiente (17-25 ° C).
NOTA: Este pode prolongar o período de tempo durante o qual as fatias pode ser utilizado por abrandar o crescimento de bactérias, bem como o metabolismo celular. Este período depende da região do cérebro e do tipo de célula. Por exemplo, certos tipos de células de Golgi pode ser encontrado para ser saudável em fatias8 h após o corte ao passo que outros tipos durar apenas 6 horas. - Depois de 1 hora se passou desde o corte, use as fatias para vários experimentos eletrofisiológicos.
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Resultados
Fatias preparados do modo descrito pode ser usado para várias experiências electrofisiológicas e Optogenetic. Na Figura 3A e 3C, que mostram um exemplo representativo de uma fatia horizontal cerebelar e uma fatia cerebral cortical coronal, respectivamente, vistas sob interferência diferencial (DIC) ópticas. Na fatia cerebelar, vários tipos de neurônios do cerebelo pode ser facilmente reconhecido por sua forma e localização das células do corpo, permitindo alvo registros eletrofisiológic...
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Discussão
Nós demonstramos um método para a preparação de fatias cerebrais agudas a partir de ratos em vez de temperatura fisiológica gelada.
Demonstrou-se 11 que a qualidade das fatias obtidas em condições de calor é superior quando em comparação com as preparadas com condições de frio, desde que a lâmina tem fatiador de vibração vertical mínima. Cortando na temperatura fisiológica pode impedir artefatos fisiológicos causados pela baixa temperatura, como as relacionadas a mudanças nos pr...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de reconhecer a contribuição significativa do Dr. Shiwei Huang (Australian National University) na validação do método. Além disso, gostaríamos de agradecer à Sra. Kasia Pietrajtis pelos comentários úteis sobre as células de Golgi e ao Sr. Vitaly Lerner pelos dados experimentais do córtex. Este trabalho foi apoiado por PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC e ISF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentração: 60 mg/ml em soro fisiológico. |
| Tesoura grande | FST | 14001-16 | Qualquer tesoura grande ou guilhotina com bordas suficientemente afiadas pode ser usada para decapitação |
| Tesoura de íris | Prestige medical | 48,148 | Qualquer tesoura de ponta fina pode ser usada, desde que as lâminas da tesoura não tenham mais de 1,5– |
| Pinça de ponta fina de 2 cm | FST | 11254-20 | |
| Bisturi: | FST | 91003-12 | |
| Lâmina de bisturi #11 | FST | 10011-00 | |
| Espátula pequena | Fisher | 2350 | |
| Papel | Qualquer marca de laboratório pode ser usada. | ||
| Placas de Petri | Duroplan | Z231509-1 | |
| Copos de vidro | Pipeta | SCHOT 10022846 | |
| Pasteur | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super cola | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Lâmina de fatiar cerâmica | Campden | 7550-1-C | |
| Aquecedor/agitador | Para aquecer o SPS para o procedimento | ||
| Chaleira | Para aquecer água para controle de temperatura | ||
| Câmara de recuperação de fatias + unidade de aquecimento | Warner instrumentos | BSC-HT + Modelos BSC-BUW | construídos em casa também podem ser usados. |
| Termômetro | Para monitorar a temperatura SPS durante a dissecção e fatiamento |
Referências
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Reimpressões e permissões
