Procedimento para safenas humanas Veias Ex Vivo Perfusão e reforço externo

Resumo

Os mecanismos que levam ao desenvolvimento de hiperplasia intimal (HI) e falha do enxerto venoso ainda são pouco compreendidos. Este estudo descreve um sistema ex vivo para perfundir veias humanas sob fluxo e pressão controlados. Além disso, avaliou-se a eficiência do reforço da malha externa para limitar o desenvolvimento de IH.

Resumo

A base das terapias contemporâneas para doença arterial oclusiva extensa é a cirurgia de revascularização venosa. No entanto, sua durabilidade é ameaçada pela hiperplasia intimal (HI) que eventualmente leva à oclusão do vaso e à falha do enxerto. Acredita-se que as forças mecânicas, particularmente a baixa tensão de cisalhamento e a alta tensão da parede, iniciem e sustentem essas mudanças celulares e moleculares, mas sua contribuição exata ainda precisa ser desvendada. Para avaliar seletivamente o papel da pressão e do estresse de cisalhamento na biologia da HI, um sistema de perfusão ex vivo (EVPS) foi criado para perfundir segmentos de veias safenas humanas sob regime arterial (alta tensão de cisalhamento e alta pressão). Outras inovações técnicas permitiram a perfusão simultânea de dois segmentos da mesma veia, um reforçado com uma malha externa. As veias foram colhidas usando uma técnica sem toque e imediatamente transferidas para o laboratório para montagem na EVPS. Um segmento da veia recém-isolada não foi perfundido (controle, dia 0). Os outros dois segmentos foram perfundidos por até 7 dias, sendo um deles completamente abrigado com uma tela externa de 4 mm (diâmetro). A pressão, a velocidade do fluxo e a frequência de pulso foram continuamente monitoradas e ajustadas para mimetizar as condições hemodinâmicas predominantes na artéria femoral. Após o término da perfusão, as veias foram desmontadas e utilizadas para análise histológica e molecular. Em condições ex vivo, a perfusão de alta pressão (arterial, média = 100 mm Hg) é suficiente para gerar HI e remodelação das veias humanas. Essas alterações são reduzidas na presença de uma malha externa de poliéster.

Introdução

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade nos países ocidentais¹. Apesar dos avanços nos tratamentos endovasculares, a cirurgia de bypass continua sendo a base das terapias contemporâneas, portanto, mais de meio milhão de enxertos de veias são realizados anualmente nos Estados Unidos. No entanto, apesar de décadas de pesquisa, 30-60% dos enxertos de veias de membros inferiores falham nos primeiros anos devido à hiperplasia intimal (HI)². Forças mecânicas, particularmente baixa tensão de cisalhamento (SS) e alta tensão na parede, são fundamentais no início e desenvolvimento dessa resposta hiperplásica^3,4. Para resolver essa questão, um sistema de perfusão de veias ex vivo (EVPS) foi gerado para estudar, sob condições hemodinâmicas estritamente controladas (pressão e estresse de cisalhamento), o comportamento de veias safenas humanas. Neste estudo, após a inserção na circulação arterial, a pressão elevada (média = 100 mmHg) foi suficiente para estimular a proliferação e migração de células musculares lisas para a camada íntima (HI)⁵.

Estudos em mamíferos sugeriram o uso de reforço externo como um método eficiente para apoiar a "veia arterializada" e neutralizar as alterações hemodinâmicas agudas que a veia enfrenta uma vez implantada em um meio arterial. A tela evitou a distensão excessiva, aumentou a tensão de cisalhamento e reduziu a tensão da parede e, consequentemente, a HI^6-10. No entanto, os mecanismos subjacentes e sua aplicabilidade às veias humanas na melhoria da permeabilidade do bypass não foram totalmente caracterizados. Nossa EVPS foi usada para comparar, na condição que mimetiza as alterações que uma veia enfrenta uma vez inserida em um regime arterial (alta tensão e pressão de cisalhamento), o comportamento das veias safenas humanas na ausência e presença de uma tela tubular externa de poliéster macroporoso. Ao prevenir o remodelamento patológico e a HI, a tela forneceu evidências de sua potencial eficiência clínica¹¹.

Este estudo 1) apresenta um modelo de perfusão de veias safenas humanas ex vivo sob pressão controlada e estresse de cisalhamento 2) demonstra que a malha externa de poliéster macroporoso reduz a HI e fornece informações cruciais para sua potencial aplicação clínica.

Protocolo

O Comitê de Ética da Universidade de Lausanne aprovou os experimentos, que estão de acordo com os princípios delineados na Declaração de Helsinque de 1975, revisada em 1983 para o uso de tecidos humanos.

1. Colheita da Veia Safena Grande Humana

1. Obter segmentos excedentes de veias safenas humanas não varicosas de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio para isquemia. Na sala de cirurgia, desinfete toda a perna com uma solução de iodo e cubra o paciente para expor a perna da virilha ao pé.
2. Faça uma incisão mediana da virilha até o joelho (deixando a parte da pele interrompida).
3. Colha a veia safena magna com um pedículo de tecido circundante (técnica sem toque). Prenda os ramos laterais das veias com laços de seda 4-0. Armazene imediatamente um segmento excedente mínimo de 9 cm de comprimento da veia safena magna, com um diâmetro externo de 2,5-4 mm a 4 ° C em um meio RPMI-1640 Glutamax, suplementado com 12,5% de soro fetal de bezerro e leve-o ao laboratório.

2. Design EVPS

1. Monte o equipamento geral mostrado na Figura 1. Autoclave todos os equipamentos e mantenha todos os componentes em condições estéreis. Além disso, certifique-se de que o sistema seja à prova d'água e não vaze produtos químicos no meio. Use polimetacrilato de metila (PMMA-GS) para a capa. Aço (X5 Cr Ni 18 10) e plástico de polioximetileno (POM) como suporte de veio.
2. Projete a câmara de perfusão para a geometria desejada para permitir a colocação da veia e sua conexão. Certifique-se de que a profundidade (ou raio se estiver usando construção cilíndrica) seja de pelo menos 2,5 cm para permitir flexão e dilatação mínimas do vaso, juntamente com cobertura constante pelos meios de cultura (Figura 1). A vedação é um problema importante e é a razão pela qual a construção retangular PMMA-GS é usada.
3. Projete o suporte do veio para a geometria desejada. Para evitar dobras ou distensão excessiva, permita o ajuste do comprimento empurrando ou puxando (o parafuso não pode ser usado para esse fim, pois a veia seria torcida junto com o parafuso).
   NOTA: Uma haste de aço completa conectada por 2 peças deslizantes em forma de L que suportam os 2 cilindros de veia (5 mm de diâmetro para encaixar no vaso) e a veia (Figura 1B e Figura 2) é usada aqui.
4. Projete a coluna de pressão, de modo que a "pressão de repouso" aplicada ao sistema seja: p = 0-10 = h x ρ x g, onde p = pressão (N / m², Pa) h = altura da coluna de fluido (m) ρ = densidade do líquido (kg / m³) e g = a constante gravitacional (9,81 m / seg²). Projete quatro dutos de conexão, de cima para baixo: para aplicar pressão, para a vazão (da veia), a entrada (para a veia) e para permitir a troca do meio.
5. Prepare o meio. Com base em estudos anteriores^5,11-14, escolha RPMI-1640, suplementado com Glutamax, soro fetal de bezerro a 12,5% e solução antibiótico-antimicótica a 1% (10.000 U/ml de penicilina G, mais 10 mg/ml de sulfato de estreptomicina, mais 25 mg/ml de anfotericina B, mais 0,5 μg/ml: gentamicina). A tensão de cisalhamento (SS) é dada por SS= 4 μQ/π*r³Q é a taxa de fluxo (ml/seg), é o raio (cm) do segmento da veia e μ é a viscosidade do meio de perfusão.
   1. Modular o SS ajustando a viscosidade através da adição de 70 kDa dextrana. Meça a viscosidade com um viscosímetro. Aqui, adicione 8% de dextrano a 70 kDa para definir SS para 9-15 dyn / cm².
6. Ajuste a bomba de engrenagem para induzir um sinal cardióide pulsátil de 60 pulsos/min e amplitude constante gerando um fluxo unidirecional de 150 ± 15 ml/min, independente da pressão aplicada no sistema e controlado por um computador. Certifique-se de que o software de acionamento integre a aquisição e o monitoramento constantes de pressões, velocidade do fluxo, taxa de pulso e sinal. Se desejar, use uma segunda bomba (não sincronizada) para produzir um fluxo turbulento não laminar.

3. Montagem EVPS (Figura 1)

1. Antes de começar, certifique-se de que todo o equipamento seja estéril. Execute todas as etapas a seguir sob assepsia em uma capela de fluxo laminar.
2. Coloque a veia em uma placa de Petri cheia de meio. Use uma lâmina cirúrgica e divida a veia em 3 segmentos iguais.
3. Enxágue imediatamente um segmento em PBS. Divida o segmento em 3 partes, fixe uma em formalina para morfometria. Congele os outros dois para análise quantitativa de transcrição (RT-PCR) e proteína (western blot). Considere esses segmentos como uma veia de controle e não perfundida.
4. Use os 2 segmentos restantes para perfusão.
   1. Injete muito suavemente o meio na veia e determine a direção normal do fluxo; na presença de válvulas, a veia é invertida.
   2. A vedação das veias é de extrema importância para o sucesso experimental. Verifique se há vazamentos nas garantias. Proteja qualquer vazamento com suturas de seda 6-0.
5. Conecte o segmento da veia entre os dois cilindros metálicos, uma extremidade de cada vez (2.3, Figura 1). Fixe os cilindros com Ethibon 3-0 ao redor das reentrâncias (Figura 1A e B).
   1. Coloque todo o segmento venoso na câmara de perfusão previamente preenchida com meio. Repita o mesmo procedimento para o segundo segmento.
      NOTA: A falha em vedar adequadamente a veia do cilindro será uma fonte de vazamento, exigirá reintervenção e aumentará significativamente o risco de infecção e falha experimental.
6. Para reforçar (malhar) o segundo segmento, solte os dois cilindros (com o veio anexado) das peças em forma de L (2.3 e Figura 1).
   1. Seja gentil e não toque na veia com nenhum instrumento. Deslize a malha primeiro no cilindro e depois na veia. Um empurrão / puxão fará com que a malha fique na veia.
   2. Uma vez que a malha cubra toda a superfície da veia, prenda a veia revestida aos cilindros com Ethibon 3-0.
   3. Remonte o composto veia/cilindro no suporte em forma de L e transfira-o para a câmara de perfusão, previamente preenchida com meio.
7. Conecte cada cilindro metálico (entrada e saída) a um divisor em Y usando tubos de silicone tratados com peróxido com diâmetro interno de 3.2 mm.
8. Conecte o divisor de saída a um segundo divisor em Y usando o mesmo tipo de tubulação. A partir deste divisor em Y, use um tubo para medir a pressão de perfusão através de ambos os vasos. Conecte o outro de volta à coluna para formar um sistema de circuito fechado (Figura 2).
9. Dentro da incubadora, use um tubo longo (um metro de comprimento) para conectar a coluna de pressão ao cabeçote da bomba.
10. Complete a configuração conectando o cabeçote da bomba ao divisor em Y de entrada com outro tubo de comprimento longo (Figura 1).

4. Perfusão de veias

1. Após a conclusão da montagem do EVPS, encha a coluna com meio (fique abaixo do duto de saída da veia para permitir o reabastecimento). Adicione mais mídia à coluna até que o sistema esteja cheio. Mova todo o sistema para a incubadora mantida a 37 ± 0,1 °C com um pH mantido constante em 7,40 ± 0,01 (usando um algoritmo de CO₂/pH baseado na equação de Henderson-Hasselbach).
2. Traga a cabeça da bomba de engrenagem para fora da incubadora e conecte-a ao acionamento da bomba de engrenagem. Aparafuse as hastes para prender o conjunto.
3. Ligue a potência da bomba, certifique-se de que está ativada no software de condução e aguarde 5 minutos para que o meio seja distribuído igualmente em todos os compartimentos.
4. Para monitorar a pressão, use um monitoramento da linha arterial. Conecte a saída de pressão EVPS (corresponde ao cateter arterial) ao transdutor de pressão conectado ao computador.
   1. Certifique-se de que o tubo esteja totalmente cheio de meio e não contenha bolhas. Retire a bolha do sistema de cultura através do tubo de "linha arterial" (Figura 2). Preste atenção ao display e procure um sinal cardióide pulsátil de 60 pulsos/min de amplitude constante. Neste ponto, a pressão média está entre 0-10 mm Hg. Se a pressão for < 0 e a coluna esvaziar progressivamente, procure um vazamento (colateral da veia ou vedação inadequada entre a veia e o tubo).
5. Defina a pressão mínima para 6 mm Hg para um teste venoso ou 90 mm Hg para um teste arterial. Nessas condições, um injetor de ar aplica a pressão necessária à coluna e ao sistema.
6. Troque o meio a cada 2 dias usando o tubo conectado à coluna de pressão. Para evitar danos por mudança de pressão, abra primeiro o plugue da coluna.

5. Conclusão da Perfusão

1. Após 3 ou 7 dias de perfusão: retire a EVPS da incubadora e desmonte as veias. Descarte as extremidades das veias proximal e distal de 5 mm fixadas ao equipamento. Corte um anel central de 5 mm de espessura do segmento restante e fixe em formalina (morfometria). Congelar os fragmentos restantes e reduzi-los a pó para análises moleculares posteriores.

Resultados

O EVPS fornece uma ferramenta valiosa para avaliar independentemente as forças hemodinâmicas sobre o remodelamento e a IH dos enxertos de veia safena humana.

Figura 1 mostra a câmara de perfusão e o suporte para veia. Nas Figuras 1A e B, o suporte para veia é apresentado antes (Figura 1A) e depois (Figura 1B) da montagem, respectivamente. Ele é composto (de cima para baixo) por um tubo liso de aço inoxidável c...

Discussão

Este estudo revela um sistema de perfusão venosa ex vivo (EVPS) para realizar extensos estudos hemodinâmicos em veias humanas. Este sistema permite a perfusão das veias safenas sob parâmetros hemodinâmicos definidos na ausência de fatores inflamatórios e de crescimento agravantes liberados pelas células circulantes in vivo. Assim, proporciona uma melhor compreensão das vias subjacentes envolvidas no controle da HI em enxertos de veias humanas^5,11,12,15.

As perturba...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
Penicilina/Estreptomicina/Fungizone	Bioconcept	4-02F00-H
Dextrano de Leuconostoc spp. 500 g	Sigma-Aldrich	31390
Tampão PBS CHUV pH 7,1-7,3 1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
Meio de inclusão de crioseccionamento - Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Tubo de Silicone (Peróxido) L/S 16 (96400-16 ) - 7,5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y-splitter	Idex Saúde & Science GMBH	Conector
35 mm Placa de cultura	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Tubo Falcon	BD Bioscence	352096
50 ml Tubo Falcon	BD Bioscence	352098
Bomba de engrenagem - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
Cabeça da Bomba	Idex Health & Ciência GMBH	MI0008
Kit de Monitoramento TRANSPAC IV	icumedical	011-0J736-01
Seringas de 20 ml	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson& Johnson	EH7346H
Mesh ProVena 6-8mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl: Perfusão da solução de cloreto de sódio 0,9% (100 ml)	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S Standard Drive	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
Cartão de aquisição	National Instruments	PCI-6024 E
Medidor de vazão módulo	Transonic Systems Inc.	TS410 e T402
Torneira com 3 vias	BD Connexta Luerlock	394600
Millex Filtro	Milian	SE2M229I04

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