A visualização não-lítica exocitose de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Summary

Nós descrevemos como visualizar macrófago C. neoformans (Cn) interações em tempo real, com especial ênfase para o processo de exocitose não-lítica usando microscopia de luz digital. Usando esta técnica individualmente macrófagos infectados podem ser estudados para determinar os vários aspectos deste fenómeno.

Abstract

Muitos aspectos da infecção de macrófagos por Cryptococcus neoformans têm sido extensivamente estudada e bem definido. No entanto, uma interação especial, que não é claramente compreendido é exocitose não-lítico. Neste processo, as células de levedura são libertadas para o espaço extracelular através de um mecanismo mal entendido que deixa ambos os macrófagos e Cn viável. Aqui, nós descrevemos a seguir como um grande número de macrófagos infectados individualmente por um período de 24 horas de infecção por microscopia de tempo decorrido. Macrófagos infectados estão alojados numa câmara de aquecimento, com uma atmosfera de CO ₂ ligado a um microscópio que fornece as mesmas condições que uma incubadora de cultura de células. Microscopia digital ao vivo pode fornecer informações sobre as interações dinâmicas entre um hospedeiro e patógeno que não está disponível a partir de imagens estáticas. Ser capaz de visualizar cada célula infectada pode fornecer pistas de como macrófagos lidar com infecções fúngicas, e vice-versa. Esta técnica isa ferramenta poderosa para estudar as dinâmicas que estão por trás de um fenômeno complexo.

Introduction

As fases de uma infecção fúngica entre células criptocócica e macrófagos são bem documentados ^1-3. Após as células de levedura são ingeridos pelos macrófagos, uma grande variedade de interacções podem ocorrer: o macrófago pode lisar a libertar a sua carga de fungos para o espaço extracelular, ou pode controlar a infecção, mantendo as células de levedura dentro dos limites da sua membrana celular ^4. No entanto, há vários anos, um novo resultado foi descrito de forma independente por dois grupos: exocitose não-lítico, um processo em que um macrófago expurgado algumas ou todas as células criptocócica para o ambiente circundante ou uma célula vizinha e tanto o hospedeiro e patógeno permanecer viáveis ^{​​5 -8.} Vários estudos têm tentado compreender os mecanismos moleculares por trás dessa interação, mas que ainda não têm uma compreensão completa sobre o que impulsiona este fenômeno.

A capacidade de capturar imagens em tempo real e posteriormente analisar infectar múltiplased macrófagos permite responder a muitas perguntas sobre as propriedades físicas que cercam exocitose não-lítica em relação ao tempo, a capacidade espacial, mudança na morfologia e até mesmo estresse de macrófagos durante uma infecção fúngica. Ao permitir que as células a serem alojados num ambiente que seja comparável ao de uma incubadora, podemos entrever a natureza dinâmica das interacções celulares de macrófagos-fúngica. Os pesquisadores usaram esta técnica para estudar vários componentes deste processo. O papel do fagossoma neste processo foi feito utilizando a coloração fluorescente aparente e actina agentes de bloqueio ^9, enquanto que um outro grupo utilizado este método para mostrar que a exocitose não-lítico foi bloqueada em células que têm tido a LAVAGEM nucleação domínios proteicos suprimido ^10. O efeito de sinalização de citoquinas também foi verificado por microscopia em tempo real ^11. Este processo não está limitado a C. neoformans como foi também observado com Candida albicans, diferentr patógeno, que tem a capacidade de infectar macrófagos ^12. Estes achados são exemplos de como este método pode fornecer uma riqueza de informações para uma área que sabemos tão pouco.

Protocol

Todo o trabalho animal foi feito de acordo com as normas e diretrizes do Instituto de Estudos de Animais no Albert Einstein College of Medicine.

1. Crescimento Condições de C. neoformans H99 (sorotipo A)

1. Crescer indivíduo C. neoformans (Cn) colônias em placas de ágar Sabouraud.
2. Um dia antes do experimento, selecione uma colônia e inocular 10 ml de caldo Sabouraud.
3. Permitir que a cultura a crescer durante a noite a 37 ° C com agitação a uma velocidade de 250 rpm.

2 Isolamento e Preparação de primário macrófagos Osso de C57 / Bl6 Ratos

1. Eutanásia ratos colocando animal numa câmara de CO ₂ até não mais respiração. Como segunda medida, cervicalmente deslocar o pescoço antes de começar a dissecção. Esterilizar todo o corpo com álcool etílico a 70%.
2. Remova os dois fêmures e tíbia e os ossos no lugar estéril DMEM.
3. Retire o excesso de tecido e músculo usando delicate limpa até os ossos estão completamente limpos.
4. Coloque os ossos intactos apenas em uma placa de Petri contendo álcool etílico a 70% e incubar por 3 min para matar microorganismos associados. Retirar os ossos e lugar em placa de Petri com DMEM estéril.
5. Corte cuidadosamente extremidades dos ossos. Segurar osso sobre uma vazios tubo de 50 ml colocados em gelo e cuidadosamente descarga 10 ml de DMEM frio usando uma agulha G 25 através de cada osso.
   NOTA: Cada rato irá produzir quatro ossos (2 fêmures, duas tíbias). Portanto, um rato deve produzir aproximadamente 40 ml de suspensão de células.
6. Centrifugar a suspensão de células à temperatura ambiente durante 10 min a 650 x g.
7. Durante esta centrifugação, preparar e esterilizar filtro de macrófagos da medula óssea que consiste em meios de DMEM suplementado com 20% de L929, 10% de soro fetal de vitelo, 10% de NCTC-109, 1% de Pen-Strep, 1% de HEPES, 1% de L-Glutamina alimentação , 1% de aminoácidos não essenciais, 0,1% de 2-mercaptoetanol.
8. Ressuspender resultando pellet com 10 ml de alimentação de mídia. Passe suspens celularesião positivo através de um filtro de 70 um da célula para interromper aglomerações de células e remover os detritos grandes.
9. Placa 1 ml de suspensão de células para 10 ml de meio de alimentação em placas de Petri, que são especificadas para uso de cultura de tecidos (para um total de 10 placas).
10. Permitir que as células aderir a 37 ° C com 10% de CO _2. Adicionar 5 ml de meio de alimentação fresca no dia 3 No dia 7, substituir completamente a mídia de alimentação e macrófagos está pronto para ser usado.
11. O dia antes do experimento, retire macrófagos de placa removendo mídia alimentação e adicionar 5 ml de uma célula suave descascar reagente ao prato.
12. Incuba-se durante 5-10 minutos a 37 ° C e remover macrófagos com pipetagem suave.
13. Células de pelotas por centrifugação a 650 xg durante 10 min.
14. Ressuspender o sedimento em 1 ml de alimentação de mídia. Usando uma diluição de 1:20, o cálculo da concentração de macrófagos por pipetagem de 10 ul de suspensão de células para um hemocitómetro.
15. Usando 14 milímetros com fundo de vidro placas de Petri, placa Aconcentração de 1 x 10 ⁵ macrófagos diretamente sobre o bem interior, que tem um máximo de 200 l, por isso tome cuidado para não exceder este volume como mostrado na Figura 4.
16. Permitir que as células adiram ao prato de Petri de vidro, colocando os pratos em uma incubadora a 37 ° C durante 1 hora.
17. Adicionar 1-2 ml de alimentação de meio suplementado com LPS a 1 mg / ml e IFNg em 500 u / ml, e permitir que as células a incubar durante a noite.

3 Co-incubação de macrófagos murino primário e C. neoformans

1. No dia da experiência, remover um ml de células e de cultura de sedimento de levedura durante a noite inoculados por centrifugação durante 5 min a 420 x g.
2. Lave as células três vezes com PBS estéril para remover a mídia e produtos criptocócicas extracelulares como o glucuronoxylomannan polissacarídeo (GXM) na velocidade e tempo mencionado acima.
3. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS estéril e fazer uma diluição a 1: 100. Pipeta de 10 mL de tele diluição para um hemocitómetro e contar as células. Adicionar células de levedura a uma MOI de 1: 5. Por exemplo, se houver um x 10 ⁵ macrófagos / bem, faça uma suspensão de células de 5 x 10 ⁶ / ml de Cn e adicione 100 ml desta solução para um montante total de 5 x 10 ⁵ Cn.
4. Adicionar o volume calculado de suspensão de células criptocócica a 1 ml de meios de alimentação com o anticorpo mAb 18B7 a uma concentração de 10 ug / ml. Incubar suspensão de células à temperatura ambiente durante 5 min.
5. Remova a mídia de alimentação de vidro de fundo placa de Petri e lavar 1x com PBS estéril. Adicionar 100 ul de opsonizado Cn directamente a bem.
6. Permitir que as células a incubar durante 2 horas a 37 ° C com 10% de CO _2.
7. Depois de co-incubação, verifique com o microscópio que os macrófagos internalizaram Cn. Para ser considerado internalizada, as células criptocócicas deve ser visto claramente dentro dos limites do macrófago.
8. Lavar 3x prato de Petri com PBS estéril para remover todo e qualquer extracellular Cn.
9. Adicionar 1-2 ml de alimentação de mídia sem a adição de mAb 18B7 e configurar microscópio.

Exocitose 4 Visualizando Non-lítica em tempo real Digital Utilizando Microscopia de Luz

NOTA: Para realizar estes experimentos, um microscópio que vem com uma câmara de incubação anexo que inclui CO ₂ entrega e uma unidade de aquecimento é necessário.

1. Antes da experiência, pré-aquecer a câmara de incubação de, pelo menos, 30 minutos a 37 ° C. Certifique-se de que a unidade de CO ₂ lê 5% no início da experiência.
2. Lugar com fundo de vidro placa de Petri na plataforma de microscópio, cubra com CO ₂ tampa e feche todas as portas para garantir que nenhum calor escapa.
3. Usando a objetiva de 10X com o microscópio em contraste de fase, o foco em um campo claro de macrófagos infectados. Com base na experiência, determinar o objectivo usado por quantos macrófagos precisam de ser estudados.
4. Configurar o seu software microscópio para take uma imagem a cada 4 minutos, por um período de 24 horas.
5. Após 24 horas, o experimento terá atingido a conclusão e um total de 361 imagens terão sido recolhidas. Exportar estas imagens como .jpegs a uma compressão de 5%. Usando o software Image J, ver imagens como uma pilha Visual em 5 quadros por segundo. Se o filme tem que ser visto para publicação ou uma apresentação, salvá-lo como qualquer um avi ou mov arquivo dependendo do formato que funciona melhor para o telespectador.

Results

As imagens que esta técnica produz podem ser analisados ​​em uma variedade de maneiras de coletar informações em torno do que acontece depois que as células tenham fagocitado C. neoformans. Como pode ser visto na Figura 1, há aproximadamente 100 macrófagos que estão infectados ou não infectados. Cada um desses macrófagos dá ao espectador a oportunidade de estudar interações patógeno-hospedeiro em um nível muito microscópico. Como as Figuras 2 e 3 mostram, exist...

Discussion

Aqui, descrevemos um método através do qual as interacções macrófagos-fúngicas podem ser registados e analisados ​​em tempo real, ao longo de um período de 24 horas. Nosso laboratório tem usado esse protocolo para estudar muitos dos aspectos temporais da exocitose não-lítica e continuará a usar microscopia em tempo real para determinar os componentes morfológicos que cercam este processo.

Para esta técnica para produzir resultados ideais, deve ser dada especial atenção a determinadas etapas ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Aminoácidos Não Essenciais	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoetanol	Invitrogen	21985-023	Tóxico
3003 Placas de Petri para Cultura de Tecidos	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Placas de cultura com fundo de vidro	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Anticorpo não comercial produzido em nosso laboratório
Axiovert 200M Microscópio com câmara de incubação	Zeiss