Nós descrevemos como visualizar macrófago C. neoformans (Cn) interações em tempo real, com especial ênfase para o processo de exocitose não-lítica usando microscopia de luz digital. Usando esta técnica individualmente macrófagos infectados podem ser estudados para determinar os vários aspectos deste fenómeno.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
A visualização não-lítica exocitose de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitos aspectos da infecção de macrófagos por Cryptococcus neoformans têm sido extensivamente estudada e bem definido. No entanto, uma interação especial, que não é claramente compreendido é exocitose não-lítico. Neste processo, as células de levedura são libertadas para o espaço extracelular através de um mecanismo mal entendido que deixa ambos os macrófagos e Cn viável. Aqui, nós descrevemos a seguir como um grande número de macrófagos infectados individualmente por um período de 24 horas de infecção por microscopia de tempo decorrido. Macrófagos infectados estão alojados numa câmara de aquecimento, com uma atmosfera de CO 2 ligado a um microscópio que fornece as mesmas condições que uma incubadora de cultura de células. Microscopia digital ao vivo pode fornecer informações sobre as interações dinâmicas entre um hospedeiro e patógeno que não está disponível a partir de imagens estáticas. Ser capaz de visualizar cada célula infectada pode fornecer pistas de como macrófagos lidar com infecções fúngicas, e vice-versa. Esta técnica isa ferramenta poderosa para estudar as dinâmicas que estão por trás de um fenômeno complexo.
Introdução
As fases de uma infecção fúngica entre células criptocócica e macrófagos são bem documentados 1-3. Após as células de levedura são ingeridos pelos macrófagos, uma grande variedade de interacções podem ocorrer: o macrófago pode lisar a libertar a sua carga de fungos para o espaço extracelular, ou pode controlar a infecção, mantendo as células de levedura dentro dos limites da sua membrana celular 4. No entanto, há vários anos, um novo resultado foi descrito de forma independente por dois grupos: exocitose não-lítico, um processo em que um macrófago expurgado algumas ou todas as células criptocócica para o ambiente circundante ou uma célula vizinh....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todo o trabalho animal foi feito de acordo com as normas e diretrizes do Instituto de Estudos de Animais no Albert Einstein College of Medicine.
1. Crescimento Condições de C. neoformans H99 (sorotipo A)
- Crescer indivíduo C. neoformans (Cn) colônias em placas de ágar Sabouraud.
- Um dia antes do experimento, selecione uma colônia e inocular 10 ml de caldo Sabouraud.
- Permitir que a cultura a crescer durante a noite a 37 ° C com agitação a uma velocidade de 250 rpm.
2 Isolamento e Preparação de primário macrófagos Osso de C57 / Bl6 Ratos
- Eutanásia r....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
As imagens que esta técnica produz podem ser analisados em uma variedade de maneiras de coletar informações em torno do que acontece depois que as células tenham fagocitado C. neoformans. Como pode ser visto na Figura 1, há aproximadamente 100 macrófagos que estão infectados ou não infectados. Cada um desses macrófagos dá ao espectador a oportunidade de estudar interações patógeno-hospedeiro em um nível muito microscópico. Como as Figuras 2 e 3 mostram, exist.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Aqui, descrevemos um método através do qual as interacções macrófagos-fúngicas podem ser registados e analisados em tempo real, ao longo de um período de 24 horas. Nosso laboratório tem usado esse protocolo para estudar muitos dos aspectos temporais da exocitose não-lítica e continuará a usar microscopia em tempo real para determinar os componentes morfológicos que cercam este processo.
Para esta técnica para produzir resultados ideais, deve ser dada especial atenção a determinadas etapas .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não temos concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIH prêmios 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Aminoácidos Não Essenciais | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoetanol | Invitrogen | 21985-023 | Tóxico |
| 3003 Placas de Petri para Cultura de Tecidos | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Placas de cultura com fundo de vidro | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Anticorpo não comercial produzido em nosso laboratório | ||
| Axiovert 200M Microscópio com câmara de incubação | Zeiss |
Referências
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal p....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
