Descrevemos um protocolo para isolar e cultivar células epiteliais de âmnio humano (hAECs) usando reagentes livres de produtos de origem animal de acordo com as diretrizes atuais de boas práticas de fabricação (cGMP).
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Artigo de método
Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células epiteliais do âmnio humano (hAECs) derivadas de membranas de âmnio a termo ou pré-termo têm atraído a atenção de pesquisadores e clínicos como uma fonte potencial de células para a medicina regenerativa. A razão para esse interesse é a evidência de que essas células têm capacidade de diferenciação altamente multipotente, baixa imunogenicidade e funções anti-inflamatórias. Essas propriedades levaram os pesquisadores a investigar o potencial dos hAECs para serem usados para tratar uma variedade de doenças e distúrbios em estudos pré-clínicos em animais com muito sucesso.
hAECs encontraram ampla aplicação para o tratamento de uma variedade de doenças e distúrbios. As potenciais aplicações clínicas dos hAECs incluem o tratamento de acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, doença hepática, diabetes e doenças pulmonares crônicas e agudas. O progresso de estudos pré-clínicos em animais para ensaios clínicos requer um padrão mais alto de controle de qualidade e segurança para produtos de terapia celular. Por razões de segurança e controle de qualidade, é preferível que os protocolos de isolamento celular usem reagentes livres de produtos de origem animal.
Desenvolvemos protocolos para permitir que os pesquisadores isolem, criopreservem e cultivem hAECs usando reagentes livres de produtos de origem animal. A vantagem desse método é que essas células podem ser isoladas, caracterizadas, criopreservadas e cultivadas sem o risco de fornecer patógenos animais potencialmente prejudiciais aos seres humanos, mantendo rendimentos celulares, viabilidades e potencial de crescimento adequados. Para os pesquisadores que estão passando de estudos pré-clínicos em animais para ensaios clínicos, essas metodologias acelerarão muito a aprovação regulatória, diminuirão os riscos e melhorarão a qualidade de sua população de células terapêuticas.
Introdução
Células derivadas de fontes perinatais, como a placenta, membranas da placenta, do cordão umbilical e líquido amniótico têm atraído a atenção de pesquisadores e clínicos como uma fonte potencial de células para a medicina regenerativa 1,2. A razão para este interesse é que estes tipos de células todos possuem algum grau de plasticidade e imunomodulador capacidade 3, as propriedades que são fundamentais para as suas potenciais aplicações terapêuticas.
hAECs são uma população heterogénea epitelial que podem ser derivados de termo ou pré-termo membrana âmnio 4, proporcionando uma fonte potencial abundante de ....
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Protocolo
NOTA: Prematuro da Placenta devem ser coletadas de gravidezes saudáveis Singleton, com uma preferência para cesarianas eletivas prazo. Escrito, o consentimento informado deve ser dada para a coleção de sua placenta. Seu comitê de ética em pesquisa em humanos relevantes devem aprovação totalidade da recolha e utilização de tecidos humanos.
1. Isolamento de Células Epiteliais Amnion
- Coloque a placenta em uma superfície estéril dentro de uma cabine de segurança biológica classe II.
- Usando novelos estéreis solução salina equilibrada (HBSS), lavar o máximo de sangue possível da superfície da pl....
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Resultados
Quando este procedimento é seguido corretamente, um rendimento médio de 120 milhões de hAECs deve ser esperado, com um alcance típico de 80-160000000 células. A partir destes rendimentos, uma viabilidade média de 83 ± 4% pode ser esperado. O aumento do rendimento e a viabilidade média ligeiramente inferior no método clínico pode ser devido a actividade da tripsina maior do que o produto derivado de animal, e, talvez, também devido à ausência de proteínas do soro. Isolado hAECs ter um perfil de superfície celular média d.......
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Discussão
Existem vários parâmetros críticos que podem ter um impacto significativo no sucesso desta metodologia. Armazenamento da placenta ou âmnio por até 3 horas antes do isolamento do hAECs pode ser desejável para fins de logística ou programação, no entanto, recomenda-se que o tecido seja processado o mais rapidamente possível. Se o tecido é para ser armazenada, é recomendado que o armazenamento ser realizada seguindo esvaziamento e lavagem da membrana âmnio. Âmnio pode ser armazenado em HBSS estéril contendo antibióticos a .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o apoio financeiro do Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo de Victoria.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de | |||
| Coleta Bandeja de Decapagem | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Pinça de Curativo Liberty, pontiaguda 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Tesoura - Afiada/Reta | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Luvas de látex estéreis | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Vestuário de Proteção Vestuário | |||
| de Proteção (Bata) | U-line | S-15374-M | |
| Batas de isolamento | U-line | S-15374-M | |
| Luvas de látex estéreis | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Máscara facial de uso geral | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Capas | para sapatos U-line | S-7873W | |
| Mídia e reagentes | |||
| Hanks' Solução Salina Balanceada (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | sem cálcio ou magnésio |
| TripZeano (produto animal– tripsina recombinante livre) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Inibidor de Tripsina de Soja 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Reagente azul de tripano | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype controle | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| Controle do isotipo PeCy5 | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| Controle do isotipo APC | BD Pharmingen | 340754 | |
| Colágeno Tipo VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Pipeta graduada de 50 ml | BD/Falcon | 356550 | |
| Pipeta graduada | |||
| 5 ml | BD/Falcon | 356543 Tubos | |
| falcão de 50 ml | BD/Falcon | 352070 | |
| Placas de Petri de 15 cm | Corning | 351058 | |
| 70 μ m filtros | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μ m filtros | Millipore | SLGV033RS | |
| pontas de pipeta de 1 ml | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ l Pontas de pipeta | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| Seringa de 20 ml | BD/Medical | 309661 | |
| Espátula de plástico | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Barco de pesagem de plástico | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Frascos criogênicos | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Gabinete |
Referências
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med.
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Reimpressões e permissões
