Descrevemos um protocolo para isolar e cultivar células epiteliais de âmnio humano (hAECs) usando reagentes livres de produtos de origem animal de acordo com as diretrizes atuais de boas práticas de fabricação (cGMP).
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Artigo de método
Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células epiteliais do âmnio humano (hAECs) derivadas de membranas de âmnio a termo ou pré-termo têm atraído a atenção de pesquisadores e clínicos como uma fonte potencial de células para a medicina regenerativa. A razão para esse interesse é a evidência de que essas células têm capacidade de diferenciação altamente multipotente, baixa imunogenicidade e funções anti-inflamatórias. Essas propriedades levaram os pesquisadores a investigar o potencial dos hAECs para serem usados para tratar uma variedade de doenças e distúrbios em estudos pré-clínicos em animais com muito sucesso.
hAECs encontraram ampla aplicação para o tratamento de uma variedade de doenças e distúrbios. As potenciais aplicações clínicas dos hAECs incluem o tratamento de acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, doença hepática, diabetes e doenças pulmonares crônicas e agudas. O progresso de estudos pré-clínicos em animais para ensaios clínicos requer um padrão mais alto de controle de qualidade e segurança para produtos de terapia celular. Por razões de segurança e controle de qualidade, é preferível que os protocolos de isolamento celular usem reagentes livres de produtos de origem animal.
Desenvolvemos protocolos para permitir que os pesquisadores isolem, criopreservem e cultivem hAECs usando reagentes livres de produtos de origem animal. A vantagem desse método é que essas células podem ser isoladas, caracterizadas, criopreservadas e cultivadas sem o risco de fornecer patógenos animais potencialmente prejudiciais aos seres humanos, mantendo rendimentos celulares, viabilidades e potencial de crescimento adequados. Para os pesquisadores que estão passando de estudos pré-clínicos em animais para ensaios clínicos, essas metodologias acelerarão muito a aprovação regulatória, diminuirão os riscos e melhorarão a qualidade de sua população de células terapêuticas.
Introdução
Células derivadas de fontes perinatais, como a placenta, membranas da placenta, do cordão umbilical e líquido amniótico têm atraído a atenção de pesquisadores e clínicos como uma fonte potencial de células para a medicina regenerativa 1,2. A razão para este interesse é que estes tipos de células todos possuem algum grau de plasticidade e imunomodulador capacidade 3, as propriedades que são fundamentais para as suas potenciais aplicações terapêuticas.
hAECs são uma população heterogénea epitelial que podem ser derivados de termo ou pré-termo membrana âmnio 4, proporcionando uma fonte potencial abundante de material celular regenerativo. As propriedades que tornam hAECs atraentes como uma terapia celular incluem a sua multipotência, baixa imunogenicidade, e propriedades anti-inflamatórias. hAECs foram encontrados para ser altamente multipotentes in vitro e in vivo, capaz de se diferenciar em linhagens mesodérmica (cardiomyocytes, miócitos, osteócitos, adipócitos), linhagens endoderme (células pancreáticas, células hepáticas, células do pulmão) e linhagens ectodérmica (cabelo, pele, células neurais e astrócitos) 5-10.
Reassuringly, apesar de suas hAECs multipotency parecem não quer formar tumores ou promover o desenvolvimento do tumor in vivo. Além disso, hAECs também são imunes privilegiado, expressando baixos níveis de classe II antígenos leucocitários humanos (HLA) 8. Esta propriedade provável subjaz a sua capacidade de fugir rejeição imunológica após o transplante alogênico e xenogênico, como demonstrado em estudos com macacos imunes competentes, coelhos, porquinhos da índia, ratos e porcos 11-13. hAECs exibir imunomodulador potente e propriedades imunossupressoras e, assim, oferecer vantagens práticas significativas para potenciais aplicações clínicas em terapia doença auto-imune. hAECs são acreditados para exercer funções imunomoduladoras em ambos os sistemas imune inata e adaptativa. Eme dos mecanismos sugeridos, é através da secreção de factores de 14 imunomodulador.
As aplicações atuais de hAECs em modelos pré-clínicos de doenças animais incluem o tratamento de acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, doença hepática, diabetes e doenças pulmonares crônicas e agudas. Pesquisadores demonstraram interesse em utilizar hAECs para tratar pós-AVC inflamação do cérebro, devido às suas propriedades únicas. Há evidências de que hAECs pode atravessar a barreira sanguínea do cérebro, onde eles podem enxertar, para sobreviver até 60 dias, diferenciar-se em neurónios, diminuir a inflamação e promover a regeneração de tecido danificado sistema nervoso central em modelos animais de doenças neurológicas 15.
hAECs oferecer a capacidade de segmentar e reverter várias vias patológicas que contribuem para o desenvolvimento e progressão de esclerose múltipla. Por exemplo, os resultados de estudos animais pré-clínicos sugerem que hAECs são fortemente e imunossupressorapodem potencialmente induzir tolerância imunológica periférica e reverter respostas inflamatórias em curso. hAECs também têm mostrado ter a capacidade de se diferenciarem em células neuronais in vivo e aumentar neuroregeneração endógeno através da secreção de uma vasta gama de factores neurotróficos 16.
Células epiteliais humanas e de roedores âmnio já demonstraram a sua eficácia terapêutica para o tratamento de doença do fígado em modelos animais. Em um modelo de indução de lesão tetracloreto de carbono de doença hepática, HAEC transplante liderança para enxerto de hAECs viáveis no fígado, acompanhado de uma diminuição da apoptose dos hepatócitos, e diminuição da inflamação hepática e fibrose 17.
hAECs podem ser estimulados com factores pancreáticos expressas incluindo insulina e transportadores de glicose. Diversos estudos têm investigado o potencial de hAECs para restaurar os níveis de glicose no sangue em ratos diabéticos 18. Em ratos que receberamhAECs, tanto a nível de peso e de glicose no sangue do corpo de animais diminuiu para níveis normais após a injeção das células. Estes estudos apresentam um caso forte para o uso de hAECs para o tratamento da diabetes mellitus.
hAECs têm um papel comprovada na prevenção e reparação da lesão pulmonar aguda e crônica em adultos e modelos neonatais 19. Estes estudos revelaram que hAECs diferenciarem in vitro em células epiteliais do pulmão funcional que expressam múltiplas proteínas associadas à pulmão, incluindo fibrose cística da condutância transmembranar regulador (CFTR), o canal de iões, que é transformado em pacientes com fibrose cística 20. Além disso, quando hAECs são entregues para o adulto lesionado e pulmonar neonatal, que exercem os seus efeitos através da modulação de reparação de células imunitárias do hospedeiro, reduzindo o recrutamento de leucócitos pulmonar, incluindo neutrófilos, macrófagos e linfócitos 21-23.
Dada a sua abundância,registro de segurança, e aplicações clínicas comprovadas para várias doenças, os ensaios clínicos utilizando hAECs é inevitável. Com o objetivo de acelerar a tradução de terapias em HAEC de ensaios clínicos, desenvolvemos métodos para isolar, criopreservar e hAECs cultura de uma maneira adequada para os ensaios clínicos, utilizando reagentes sem produtos de origem animal, de acordo com boas práticas de fabricação atuais (cGMP) orientações .
Baseamos este protocolo um protocolo publicado anteriormente que estávamos usando com sucesso para isolar hAECs utilizando reagentes de origem animal 6. Nós alteramos o protocolo original para substituir os produtos derivados de animais com reagentes livre de produtos de origem animal, e posterior otimização foi realizada para otimizar o rendimento das células, viabilidade e pureza. Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo que iria cumprir com as normas regulamentares de fabricação de células para testes clínicos em humanos.
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Protocolo
NOTA: Prematuro da Placenta devem ser coletadas de gravidezes saudáveis Singleton, com uma preferência para cesarianas eletivas prazo. Escrito, o consentimento informado deve ser dada para a coleção de sua placenta. Seu comitê de ética em pesquisa em humanos relevantes devem aprovação totalidade da recolha e utilização de tecidos humanos.
1. Isolamento de Células Epiteliais Amnion
- Coloque a placenta em uma superfície estéril dentro de uma cabine de segurança biológica classe II.
- Usando novelos estéreis solução salina equilibrada (HBSS), lavar o máximo de sangue possível da superfície da placenta e membranas.
- Com a placenta colocada com o cordão umbilical voltada para cima, mecanicamente separar o bordo exterior das membranas de âmnio e cório.
- Uma vez separados, retirar manualmente a membrana âmnio do cório membrana da placenta, trabalhando em torno da borda da membrana, para o cordão umbilical.
Nota: Tenha careful para remover quaisquer peças de contaminar membrana cório do âmnio. - Com uma tesoura estéreis, cortar a membrana âmnio aproximadamente a 2 cm da base do cordão umbilical e introduzir num recipiente selado a 500 ml contendo 250 ml de HBSS.
- Lavar cuidadosamente agitando o frasco lacrado contendo a membrana amnion.
- Retire a membrana amnion do recipiente de coleta usando uma pinça estéril, e coloque em uma placa de Petri de 15 cm.
- Corte a membrana amnion em pedaços de aproximadamente 5 cm de comprimento (quando mantido verticalmente com uma pinça), rejeitando pedaços sangrentos ou rasgadas.
- Coloque em um recipiente de 500 ml selado e lavar com 250 ml HBSS aproximadamente 3-5 vezes ou até que a membrana amnion se torna translúcido com o sangue não contaminante.
NOTA: Qualquer presença de sangue pode reduzir a eficiência da solução enzimática digerir. - Transferir todos os pedaços de membrana âmnio para um recipiente contendo 50 ml de solução enzimática a digerir, tendo o cuidado deminimizar transição de HBSS.
- Incubar as peças em âmnio enzimática solução num banho de água quente ou quarto digerem a 37 ° C durante 15 min com agitação suave para remover todo o sangue restante.
- Retire os pedaços de membrana amnion da solução enzimática e coloque em um novo recipiente estéril digerir.
- Adicionar 100 ml de solução enzimática fresca digerir à membrana âmnio e incubar a 37 ° C durante 60 min num banho de água ou sala quente com agitação suave (primeiro a digestão).
- Retire os pedaços de membrana âmnio e coloque em nova tomada recipiente cuidado para permitir a digestão enzimática solução para drenar a partir de cada pedaço de membrana.
NOTA: Este pode ser conseguido arrastando pedaços âmnio ao longo da borda interior do recipiente. - Adicione 100 ml de enzimática fresco digerir solução para as peças de membrana âmnio e incubar 60 min em banho-maria ou sala quente a 37 ° C com agitação suave (segunda digestão).
- Passe o suspensi celularem Passo de 1,14 por meio de um filtro de 70 ^ m e de centrifugação a 1000 xg durante 10 min.
- Remover e descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 4 ml de HBSS contendo 1 mg / ml de inibidor de enzima à base de soja. Pipeta suavemente várias vezes com uma pipeta de 1 ml para se obter uma suspensão de célula única.
NOTA: Nesta fase, as células podem ser deixadas em gelo até que as células da segunda digestão estão na mesma fase de processamento. - Retire os pedaços de membrana âmnio e coloque em nova tomada recipiente cuidado para permitir a digestão enzimática solução para drenar a partir de cada pedaço de membrana.
NOTA: Este pode ser conseguido arrastando pedaços âmnio ao longo da borda interior do recipiente. - Passar a suspensão de células a partir do Passo 1,18 através de um filtro de 70 ^ m e centrifugar a 1000 xg durante 10 min.
- Remover e descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 4 ml de HBSS contendo 1 mg / ml de inibidor de enzima à base de soja. Pipeta suavemente várias vezes com 1 mL de pipette para obter uma suspensão de célula única.
- Piscina células das duas digestões, alternativamente, manter ou digestões de células separadas após a contagem de células.
NOTA: Isso impede que a mistura de células potencialmente baixa viabilidade com células de alta viabilidade. - Adicionar HBSS para um volume final de 10-20 mL e realizar a contagem de células utilizando azul de tripano para medir a viabilidade.
- Confirmar o fenótipo de células epiteliais por citometria de fluxo. Perfaz-se misturas de anticorpos apropriados utilizando anti-EpCAM-PE (diluição 1: 2) de anti-CD90-PeCy5 (1: 250) e anti-CD105-APC (1: 100) em HBSS.
- Ressuspender um subconjunto de células a partir de uma ou ambas as digestões do coquetel de anticorpo numa concentração de 25 x 10 6 células / ml.
- Por citometria de fluxo, manchas de 1 x 10 6 células com misturas de anticorpos contendo controlos do isotipo de controlo (por exemplo. EP-IgG de isotipo 1 + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Mantenha ~ 1 x 10 6 células unstained para citômetro de fluxo set-up.
- Incubar as células em anticorpococktails a 4 ° C durante 60 min.
- Lavar as células 3 vezes em HBSS e ressuspender em 5 a 10 milhões de células por ml para citometria de fluxo.
- Execute citometria de fluxo e os resultados de nota. A pureza do isolado de células (a percentagem de EpCAM positiva e CD90 / CD105 células negativas) deverá ser de 90-95% e <1%, respectivamente.
- Separe um número adequado de células para testes de critérios de controle de qualidade ou de libertação adequadas conforme determinado pela aplicação final.
NOTA: Isso pode incluir doença / triagem viral, ou outro segurança ou critérios biológicos. - Para as restantes células, siga o protocolo de criopreservação, ou, alternativamente, coloque diretamente na cultura (direto à cultura passo 3.6).
2. Criopreservação de hAECs
- Determinar o número e viabilidade celular utilizando citometria de fluxo de dados ou contagem manual com exclusão do azul de tripan.
- Centrifugar a 700 xg por 5 min.
- Célula Resuspendas entre 1-10 milhões de células por ml em animais media criopreservação livre de produto.
- Pipetar um volume adequado de células para frascos de crioconservação anéis-O e colocar em um aparelho de congelamento controlado arrefecimento onde ocorre a aproximadamente 1 ° C / min até -80 ° C é alcançada.
- Transferir frascos em azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.
3. O descongelamento e Cultura da Cyropreserved hAECs
- Retirar os frascos de criopreservação de nitrogênio líquido e colocar no gelo.
Nota: Somente Para transferência - proceder rapidamente à próxima etapa. - Descongelar as ampolas rapidamente criopreservação a 37 ° C até que apenas uma pequena parte (aproximadamente 5 x 5 mm) de gelo mantém-se.
NOTA: É importante que a solução de células não aquecer para reduzir os efeitos tóxicos de DMSO no meio de criopreservação. - Diluir media criopreservação 10 vezes com (~ 4 ° C) meios livres de soro gelado, gota a gota, em um tamanho adequado adicionadod tubo ou recipiente.
- Centrifuga-se a 700 xg durante 5 min à TA.
- Ressuspender em meio isento de soro, a uma concentração aproximada de 1 milhão de células por ml. Determinar o número e viabilidade celular utilizando contagem automatizado ou manual, com exclusão do azul de tripan. Esperado viabilidade pós-descongelamento será 5-10% menos de viabilidade pré-criopreservação.
- Células placa em células tratadas com cultura plásticas padrão, ou, alternativamente, usar colágeno tipo I em superfícies de cultura do casaco.
- Para Tipo I revestimento Collagen seguir o protocolo abaixo
- Prepare ácido solúvel colágeno tipo I de placenta humana (colágeno 15 mg com 25 ml de água deionizada e 50 ácido acético glacial ul).
- Cubra copo com Parafilm e uma agitação moderada a 37 ° C, até filamentos de colagénio são dissolvidos.
- Solução de colagénio a filtração estéril utilizando um filtro de 0,22 um.
- Diluir o colágeno estoque 01:10 filtrada com água deionizada. Este estoque diluída é o conce trabalhandontration solução para revestimento de superfícies de plástico e de membrana.
- Revestimento de plástico colagénio, vidro e superfícies de membrana durante 2 horas à temperatura ambiente a 37 ° C, ou O / N a 2-8 ° C.
- Retire o excesso de fluido da superfície revestida, e deixe-a secar O / N.
- Enxágüe com água de grau de cultura de tecidos estéreis ou HBSS antes da introdução de células e meio.
- HAECs em placas a uma densidade de 25.000 células / cm2 em meio isento de soro, e para permitir a ligação ocorrer durante 72-96 hr.
- Após a ligação, mudar mídia cuidadosamente aspiração e substituindo com um volume adequado de meio isento de soro a cada 2-3 dias.
- Células de passagem utilizando o protocolo abaixo
- Aspirar os meios de cultura de células e lava-se com o volume de HBSS estéril 1x
- Adicionar o volume 1x de solução enzimática digerir e incubar durante 5-15 minutos, ou até que as células sejam observadas separando-se da superfície da cultura de células.
- Recolhe enzimática digerir solução contendo as células, garantindo cells são destacados da superfície da cultura de células pipetando repetidamente a solução enzimática contra a superfície de cultura de células digerir
- Centrifugar a 700 xg por 5 min.
- Ressuspender o sedimento de células em um volume apropriado de HBSS contendo 1 mg / ml de inibidor de enzima à base de soja. Pipeta suavemente várias vezes com uma pipeta de 1 ml para se obter uma suspensão de célula única.
- Adicionar meio isento de soro para uma concentração aproximada de 1 milhão de células / ml. Determinar o número e viabilidade celular utilizando contagem automatizado ou manual, com exclusão do azul de tripan.
- HAECs em placas a uma densidade de 25.000 células / cm2 em meio isento de soro, e continuar com métodos de cultura Standard.
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Resultados
Quando este procedimento é seguido corretamente, um rendimento médio de 120 milhões de hAECs deve ser esperado, com um alcance típico de 80-160000000 células. A partir destes rendimentos, uma viabilidade média de 83 ± 4% pode ser esperado. O aumento do rendimento e a viabilidade média ligeiramente inferior no método clínico pode ser devido a actividade da tripsina maior do que o produto derivado de animal, e, talvez, também devido à ausência de proteínas do soro. Isolado hAECs ter um perfil de superfície celular média d...
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Discussão
Existem vários parâmetros críticos que podem ter um impacto significativo no sucesso desta metodologia. Armazenamento da placenta ou âmnio por até 3 horas antes do isolamento do hAECs pode ser desejável para fins de logística ou programação, no entanto, recomenda-se que o tecido seja processado o mais rapidamente possível. Se o tecido é para ser armazenada, é recomendado que o armazenamento ser realizada seguindo esvaziamento e lavagem da membrana âmnio. Âmnio pode ser armazenado em HBSS estéril contendo antibióticos a ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o apoio financeiro do Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo de Victoria.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de | |||
| Coleta Bandeja de Decapagem | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Pinça de Curativo Liberty, pontiaguda 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Tesoura - Afiada/Reta | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Luvas de látex estéreis | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Vestuário de Proteção Vestuário | |||
| de Proteção (Bata) | U-line | S-15374-M | |
| Batas de isolamento | U-line | S-15374-M | |
| Luvas de látex estéreis | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Máscara facial de uso geral | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Capas | para sapatos U-line | S-7873W | |
| Mídia e reagentes | |||
| Hanks' Solução Salina Balanceada (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | sem cálcio ou magnésio |
| TripZeano (produto animal– tripsina recombinante livre) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Inibidor de Tripsina de Soja 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Reagente azul de tripano | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype controle | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| Controle do isotipo PeCy5 | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| Controle do isotipo APC | BD Pharmingen | 340754 | |
| Colágeno Tipo VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Pipeta graduada de 50 ml | BD/Falcon | 356550 | |
| Pipeta graduada | |||
| 5 ml | BD/Falcon | 356543 Tubos | |
| falcão de 50 ml | BD/Falcon | 352070 | |
| Placas de Petri de 15 cm | Corning | 351058 | |
| 70 μ m filtros | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μ m filtros | Millipore | SLGV033RS | |
| pontas de pipeta de 1 ml | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ l Pontas de pipeta | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| Seringa de 20 ml | BD/Medical | 309661 | |
| Espátula de plástico | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Barco de pesagem de plástico | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Frascos criogênicos | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Gabinete |
Referências
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Reimpressões e permissões
