Summary
Para analizar los perfiles de expresión de genes cardiacos durante el desarrollo del corazón del pez cebra, el ARN total tiene que ser extraído de corazones aislados. A continuación, presentamos un protocolo de recogida funcionales corazones / batiendo por disección manual de rápida a partir de embriones de pez cebra para obtener ARNm específico del corazón.
Abstract
El corazón embrionario de pez cebra se compone de sólo unos pocos cientos de células, lo que representa sólo una pequeña fracción de todo el embrión. Por lo tanto, para evitar que el transcriptoma cardiaca de ser enmascarada por el transcriptoma embrionario global, es necesario reunir un número suficiente de corazones para nuevos análisis. Además, como el desarrollo cardiaco pez cebra procede rápidamente, colección del corazón y los métodos de extracción de ARN tienen que ser rápida a fin de asegurar la homogeneidad de las muestras. A continuación, presentamos un protocolo rápido disección manual para recopilar funcionales corazones / golpeando a partir de embriones de pez cebra. Este es un requisito esencial para la posterior extracción de RNA específica del corazón para determinar los niveles de expresión de genes cardiacos específicos por análisis del transcriptoma, tales como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). El método se basa en propiedades adhesivas diferenciales del corazón embrionario de pez cebra en comparación con otros tejidos; esto permite la rápida physeparación de SICAL cardiaca a partir de tejido extracardíaca por una combinación de fuerza de cizallamiento de fluido interrupción, filtración por etapas y la recogida manual de los corazones transgénicos marcados con fluorescencia.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) es ampliamente utilizado en biología del desarrollo para estudiar la organogénesis in vivo debido a su desarrollo embrionario rápido, transparente y extrauterino, combinado con el pequeño tamaño y la disponibilidad de líneas reportero transgénicas con expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes. Este pequeño vertebrado es especialmente adecuado para estudiar el desarrollo del corazón debido a la oxigenación de los primeros embriones de pez cebra no se basa en los latidos del corazón y el flujo sanguíneo; estas características han permitido la caracterización de un gran número de mutantes cardiovasculares 1,2 y el pez cebra es ahora un organismo modelo ampliamente reconocido para estudiar enfermedades del corazón 3.
Para el estudio de la expresión génica durante el desarrollo embrionario, las transcripciones son comúnmente analizados por todo el montaje hibridación in situ (DESEOS) 4, RT-qPCR 5, 6, microarrays o secuenciación de próxima generación (RNA-Seq) 7. MientrasDESEO permite un análisis espacio-temporal de la expresión génica dentro de todo el embrión, los niveles de transcripción suelen ser evaluada por RT-qPCR, microarrays o enfoques de RNA-Seq. Sin embargo, estos métodos requieren el enriquecimiento de tejido para perfiles de expresión génica específica.
Puesto que el corazón embrionario de pez cebra representa una pequeña fracción de todo el embrión, los estudios transcriptoma durante el desarrollo cardiaco requieren un protocolo para la disección y el enriquecimiento de los corazones. Además, para obtener datos fisiológicamente relevantes, es importante mantener el tejido cardíaco totalmente funcional hasta la extracción de ARN. Aquí se describe un protocolo para aislar rápidamente fisiológicamente normal y el corazón palpitante de cientos de embriones de pez cebra para obtener de manera eficiente las muestras de ARN de alta calidad para análisis posteriores. El presente método se basa en el protocolo reportado por Burns y MacRae, 2006 8. Para el enriquecimiento del tejido cardiaco, ambos métodos utilizan una línea reportero infarto transgénicoy tomar ventaja de las propiedades de adherencia diferencial de los corazones de embriones de pez cebra en comparación con otros tejidos. En pocas palabras, con la pipeta muchos embriones arriba y abajo a través de una punta de pipeta estrecho, corazones son liberados al mismo tiempo de los órganos embrionarios y posteriormente separados de escombros embrionaria en dos etapas de filtración rápida; entonces los corazones etiqueta fluorescente se ordenan de forma manual desde la basura y los recogen para su posterior procesamiento.
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Protocol
Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la ley alemana y el estado de Berlín; manejo del pez cebra fue supervisado por la autoridad local para la protección de animales (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. La obtención de embriones de pez cebra para el Corazón de Extracción
- Cross pez cebra reportero cardiaca tales como la Tg (myl7: EGFP) twu34 línea transgénica 9 con el fin de obtener embriones con la expresión específica de GFP-corazón.
- Mantener los embriones en el agua de huevo a 28,5 ° C hasta la etapa embrionaria deseada 10,11. Asegúrese de que la población de embriones recogidos es homogénea tanto genética como por la etapa de desarrollo para limitar las variaciones en la expresión génica.
- Dechorionate los embriones manualmente.
2. Disección de pez cebra embrionarias Corazones
NOTA: Mantenga todas las soluciones en hielo. Si es posible, hacer el trabajo en equipo: una persona disecciona los corazones de la embryos mientras que otra persona ordena los corazones bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia. Esto permite que el procesamiento de varios cientos de embriones en unas pocas horas.
- Transferir unos 100 embriones en un tubo de 1,5 ml centrifugación. Anestesiar a los embriones con tricaína (0,16 mg / ml en medio de E3). Proceda una vez que los embriones son claramente anestesiados (que no nadan y los sedimentos en el fondo del tubo, pero sus corazones siguen latiendo).
- Eliminar la solución / E3 tricaína y lavar los embriones una vez con 1 ml L-15/10% de medio FBS y mantener en hielo.
NOTA: El medio FBS L-15/10% es importante para mantener los órganos y células vivas durante todo el procedimiento de disección hasta que los corazones se han transferido en RNAlater o Trizol. - Añadir 1 ml de L-15/10% de medio FBS a los embriones y la pipeta hacia arriba y abajo 5-8 veces con una Ronda Gel Cargando Consejo hasta que la yema esté completamente interrumpido. Pipeta los embriones gota a gota sobre la superficie de la solución, por lo que la caída va a estallar ylos embriones se rompen suavemente.
NOTA: Cómo vigorosamente y con qué frecuencia los embriones tienen que ser pipeta hacia arriba y abajo depende de la etapa de desarrollo de los embriones, se necesita decir más pipeteo en fases avanzadas (por ejemplo, a 56 HPF). - Para el primer lote de embriones disecados, evaluar la integridad de los embriones y la proporción de corazones disecados bajo un microscopio estereoscópico, ya que algunos corazones pueden permanecer unidos a los embriones si pipeteada demasiado suavemente. Ajuste el modo de pipeteo para las próximas rondas de disección en consecuencia.
NOTA: Utilice puntas de pipeta de retención baja y tubos de microcentrífuga para minimizar los corazones que se pegan al plástico. - Aplicar la muestra sobre un filtro de 100 micras colocado en un tubo de centrifugación de 50 ml; enjuagar el tubo de 1,5 ml con 1 ml de medio L-15/10% de FBS y luego aplicar esto a el filtro con el fin de minimizar la pérdida de la muestra (algunos corazones pueden estar pegadas a las paredes del tubo). Lavar el filtro dos veces con 1 ml L-15 / 10% de FBS. En este paso los corazones pasan a través del filtro y se recogen en el tubo de 50 ml.
- Aplicar el flujo a través sobre un filtro de 30 micras colocado sobre un tubo de centrifugación de 15 ml y enjuagar el filtro una vez con 1 ml L-15/10% de medio FBS. En esta segunda etapa de filtración, los corazones se retienen en el filtro y los residuos más pequeño se lava.
- Girar el filtro al revés y vaciar los corazones en el filtro en un agarosa recubiertas de placa de Petri 1% mediante la aplicación de tres lavados consecutivos con 1 ml de L-15/10% de FBS.
- Separar manualmente corazones GFP-positivas a partir de los restos de embriones no fluorescente (por ejemplo, lentes de ojo) con un par de pinzas bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia y se concentran en el centro del plato. Colecciónalos según la etapa 3.
NOTA: Si los embriones son mayores de 24 HPF, los corazones deben latir, lo que indica que los tejidos están todavía fisiológicamente normal.
3. Aislamiento de ARNm de disecciónted Corazones
- Recoge los corazones en el menor volumen posible (por ejemplo, 10 l) y pipeta en un tubo de 1,5 ml contiene 0,75 ml RNAlater (en hielo). Verifique que no haya corazones permanecen en la punta de la pipeta viéndolo bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
- Alternativamente, si una campana química está disponible en la vecindad inmediata del microscopio de fluorescencia, la transferencia de los corazones recogidos en Trizol (PRECAUCIÓN) bajo el capó química. Esto evita la posible pérdida de corazones de fricción en la punta de pipeta y también durante la centrifugación de los corazones (pasos 3.4, 3.5 y 3.7). Reúnase el corazón de varios ciclos de aislamiento en el mismo tubo con Trizol y vaya directamente al paso 3.8; el volumen final no debe superar el 10% del volumen original Trizol.
NOTA: Lea la Hoja de Seguridad Trizol (MSDS) antes de usar. Maneje reactivo Trizol bajo una campana y el desgaste recomendado Equipo de Protección Personal. Evite el contacto con la piel, ojos y clothing. Retirar todas las fuentes de ignición. - Agrupar los corazones de varias rondas de aislamiento en el mismo tubo con RNAlater (en hielo), como la eficiencia de aislamiento de ARN mejora con la cantidad de tejido recogido. Si el volumen total de la muestra supera el 10% del volumen RNAlater original, utilizar un tubo adicional con 0,75 ml RNAlater para el almacenamiento (en hielo).
- Centrifugar las muestras a 15.700 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar los corazones.
- Bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia, recoger cuidadosamente tanto sobrenadante como sea posible en un 1% de agarosa-placa de Petri recubierta que contiene 3 ml L-15/10% de medio FBS, pero no molestar los corazones sedimentadas en el fondo del tubo de centrifugación. Dado que hasta 15% de los corazones puede permanecer en el sobrenadante debido a la alta viscosidad de RNAlater, recuperarlos como se describe en el paso 3.7.
- Bajo una campana química, añadir 0,5 ml de Trizol al tubo que contiene los corazones sedimentadas y mantener en hielo.
- Bajo el microsco fluorescentepe, transferir los corazones (del paso 3.5) del plato de agarosa recubiertas de 1% FBS que contiene la solución RNAlater / L-15/10% en otro plato de agarosa recubiertas de 1% con 3 ml L-15/10% FBS para diluir el RNAlater. Recoge los corazones en el centro de la placa de Petri y transferirlos en un pequeño volumen en el tubo de corazones sedimentadas en Trizol bajo una campana química.
- Vortex el tubo de 1,5 ml que contiene los corazones en Trizol para interrumpir los corazones e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Bajo una campana química, añadir 100 l de cloroformo (ATENCIÓN), mezclar bien y pasar la solución / cloroformo Trizol en un 1,5 ml tubo de pre-hilado PLG (centrífuga 30 segundos a velocidad máxima antes de su uso). Incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
NOTA: Lea las MSDS cloroformo antes de su uso. Maneje reactivo cloroformo bajo una campana y el desgaste recomendado Equipo de Protección Personal. Evite el contacto con la piel, ojos y ropa. Mantener alejado de materiales incompatibles tales como los metales, los álcalis. - Centrifuge la muestra a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C y transferir la fase acuosa a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Añadir 5-10 g de glucógeno y 250 l preenfriados (a -20 ° C) isopropanol; mezclar bien e incubar durante la noche a -20 ° C.
- Centrifugar la muestra a 15.700 xg durante 30 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Lavar el sedimento con 1 ml de etanol 75%, se centrifuga a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Se deja evaporar el etanol mediante secado de la pastilla a temperatura ambiente hasta que se convierte en blanco (por ejemplo, durante 10-15 min).
- Añadir 20 l RNasa libre de ddH 2 O al sedimento y se incuba durante 10-15 min a 55 ° C para disolver el ARN; a continuación, mantener en hielo.
- Evaluar la concentración de ARN y la pureza por medición de la absorbancia. Evaluar la integridad del ARN mediante la ejecución de la muestra en un gel de agarosa al 1%.
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Representative Results
A continuación, describimos un representante experimento disección cardíaco usando el Tg pez cebra (myl7: GFP) twu34 línea transgénica 9, que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) exclusivamente dentro del miocardio (Fig. 1). Se recogieron tanto los corazones disecados y los embriones a partir de los cuales se derivaron para evaluar la pureza de la muestra del corazón. En pocas palabras, homocigotos Tg (myl7: GFP) pez cebra twu34 9 se outcrossed con el tipo salvaje de manera que todos los corazones embrionarios fueron etiquetados GFP. Unos 500 embriones (56 HPF) se transfirieron a tubos de 1,5 ml (aprox. 100 embriones en cada uno) (Fig. 1A1, 1B). Cada tubo se procesó como se describe en la sección de Protocolo (paso 2) y en la Figura 1A. Los corazones fueron liberados por pipeteando arriba y abajo varias veces (Fig. 1A2) y después se aplican a un filtro de 100 micras (Fig. 1A3). Los pedazos grandes de tejido embrionario se mantuvieron en este filtro; esta fracción fue recuperado y puesto en Trizol foLa extracción de RNA r para obtener un "embrión sin corazón" muestra de ARN (Fig. 1A3). El medio de flujo que contiene corazones se aplica entonces a un filtro de 30 micras (Fig. 1A4), que mantiene el corazón y el tejido desechos de tamaño similar. Corazones GFP-positivas fueron expulsadas del filtro en una placa de Petri de agarosa recubierto (Fig. 1A5, 1C), se reunieron rápidamente en el medio del plato bajo un estereomicroscopio fluorescente y se transfirió a 0,75 ml RNAlater (Fig. 1A6). Dentro de este tubo con RNAlater, se agruparon los corazones derivados de 5 rondas de disección (aprox. 300 corazones de 500 embriones que representan una eficiencia de extracción de alrededor de 60%). Una comparación de las muestras del corazón antes de la clasificación de los restos de embriones en 56 HPF (Fig. 1C) versus 36 HPF (Fig. 1C) se muestra en la Figura 1. En 56 HPF, la interrupción de embriones produjo escombros más embrionario ( tales como lentes, punta de flecha, Fig. 1C) que en 36 HPF después de la etapa de filtración de 30 micras (fig. 1C).
Para determinar la pureza del 56 HPF muestra "corazón", se compararon los niveles de expresión de cardiaca en comparación con las transcripciones extracardiacas en "corazón" y "embrión sin corazón" muestras por RT-qPCR. Para este fin, se extrajeron los ARNm a partir de esas dos muestras y se evaluó la calidad del ARN en un gel de agarosa (Figura 2A) y cantidad, por medición de la absorbancia (Tabla 1) como se describe en la sección de protocolo (paso 3). El aprox. 300 corazones produjeron 660 ng de ARN. A continuación, se sintetizó ADNc utilizando M-MLV transcriptasa inversa RNasa H (-) y hexámeros aleatorios de acuerdo a instrucciones del fabricante, y los experimentos de RT-qPCR se realizaron como se ha descrito 12. Se calcularon los relativos niveles de expresión génica de diferentes marcadores específicos de tejido como polipéptido ligera de la miosina 7 [myl7, un marcador de infarto] 9, dominio de inserción de quinasa del receptor como [kdrl, un / marcador endocárdica endotelial] 13, beta hemoglobina embrionaria-1.1 [hbbe1.1, un marcador de eritrocitos] 14, crystallin-alfa A [cryaa, un marcador de la lente de ojo] 15, y la proteína glial fibrilar ácida [GFAP, un marcador del sistema nervioso central] 16 (Figura 2B). El factor de iniciación de la traducción eucariótica pez cebra 1B [eif1b] 12 fue utilizado como un gen de referencia interna (véase el cuadro 2 para los números de GenBank ID, primer secuencias, tamaños de productos de PCR y la especificidad de tejido para cada gen). Como era de esperar, myl7 fue altamente enriquecido en la muestra "corazón" en comparación con el "embrión sin corazón" de la muestra (Fig. 2B). El kdrl marcador de células endoteliales fue encontrado para ser enriquecido moderadamente en la muestra de corazón, como se esperaba (alrededor de 40% de las células cardíacas en 56 HPF están expresando kdrl células endocárdicas) (Fig. 2B). El hbbe1.1 marcador eritrocitos fue excesivamente representados en la muestra "corazón", a pesar de que los corazones estaban stgolpes enfermo después de la disección, que debe expulsar a las células rojas de la sangre desde el corazón (Fig. 2B). Por el contrario, los niveles de expresión del sistema nervioso central y marcadores de lentes (GFAP y cryaa, respectivamente) fueron extremadamente bajas en el "corazón" de la muestra (Fig. 2B). En conjunto, se concluye que los rendimientos de protocolo de disección corazón de alta calidad y ARN específica cardiaca de toda embriones de pez cebra.
Figura 1. extracción del corazón de embriones de pez cebra. (A) Esquema que representa el procedimiento de extracción del corazón. Alrededor de 100 embriones vivos se recogen en un tubo de 1,5 ml (A1, B, B '), y luego anestesiados con pipeta arriba y abajo varias veces a través de una punta de pipeta estrecha para liberar los corazones (A2). La solución resultante que contiene los tejidos embrionarios (A2) se aplica entonces a un filtro de 100 micras (A3). Tejidos embrionarios sin yema y hearts, y residuos grandes embrionario permanecen en el filtro (A3). El flujo a través se recoge en un tubo de 50 ml (A3) y luego se aplica a un filtro de 30 micras (A4). Los corazones y los desechos pequeños son retenidos en el filtro 30 micras y se transfirieron a una pequeña agarosa recubiertas de placa de Petri (A5, C, C '). EGFP corazones etiquetados (C, C '; flecha) se clasifican manualmente desde los escombros restantes, tales como lentes (C, punta de flecha), y se recogen en RNAlater (A6). Este procedimiento se repite al menos 5 veces y todos los corazones se agruparon para su posterior procesamiento. (BC) Superposición de fluorescencia (EGFP en verde) y DIC imágenes de Tg transgénico vivo (myl7: EGFP) twu34 embriones a 56 HPF (B, C) y 36 HPF (B ', C'), a dos pasos del corazón procedimiento de disección: antes de la disección de embriones (B, B ') y justo después del lavado del filtro de 30 micras, antes de la clasificación de los corazones de los escombros en la placa de Petri (C, C'). Barra de escala: 500 micras.
Figura 2. Análisis de la calidad del ARN y la pureza por electroforesis y RT-qPCR, respectivamente. (A) ARN total de la muestra "corazón" (2 l) y de la "embrión sin corazón" de la muestra (1 l), derivado de 56 embriones HPF, resolvieron en un gel de agarosa al 1%. Prominente S18 y S28 rRNA bandas indican que los ARN no se degradan. Los niveles de expresión relativos de la myl7 marcadores específicos de tejido (miocardio), kdrl (endotelio), hbbe1.1 (eritrocitos), cryaa (objetivo), y GFAP (CNS) según lo determinado por RT-qPCR para la muestra "corazón" (B) normalizados al "embrión sin corazón" de la muestra. Los experimentos de RT-qPCR se realizaron como triplicados técnicos y datos se dan como media ± SEM. Se realizó un análisis de la prueba t no pareada. **** P <0,0001; ** P <0,005. pb, par de bases.
| ID de la muestra | ng / l | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | cursor abs. | 340 en bruto |
| corazones | 32.97 | 0.82 | 0.41 | 2.01 | 0.35 | 2,355 | 0,031 |
| embriones sin corazones | 568.82 | 14.22 | 7.00 | 2.03 | 2.04 | 6,965 | 0,018 |
Tabla 1. ARN cantidad y la calidad de la medición espectrofotométrica. La cantidad y calidad del ARN del "corazón" y "embrión sin corazón" muestras obtenidas de 56 HPF embriones medido por espectrofotometría.
| geNebraska | GenBank # | secuencia de cebador | Tamaño del producto de PCR (pb) | Marcador específica de tejido |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | miocardio |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | endotelio / endocardio |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFA | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | sistema nervioso central |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | lente de ojo | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | eritrocitos |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | gen de referencia |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Tabla 2. Los cebadores usados para los experimentos de RT-qPCR. Nombre, número de acceso GenBank, secuencia, tamaños de productos de PCR y especificidad tisular se muestran para todos los genes analizados.
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Discussion
Este protocolo permite el rápido enriquecimiento de tejido del corazón embrionario de pez cebra para la expresión génica análisis. La cantidad y la calidad de la muestra específica cardiaca ARN depende en gran medida de unos pocos pasos cruciales: en primer lugar, la cantidad de la muestra se mejora en gran medida si la pérdida de corazones se impide a cada paso del protocolo, ya que la purificación del ARN sólo funcionará con suficiente material de partida. En segundo lugar, la pureza de la muestra, que depende totalmente de la experimentador, se determina por la clasificación y recogida de corazones dentro de la placa de Petri mientras estrictamente con exclusión de otros tejidos. En tercer lugar, calidad de la muestra depende críticamente de limitar la degradación del ARN que puede ocurrir en la interrupción de los embriones; esto se logra mediante el uso de medio de cultivo celular para evitar la muerte celular y manteniendo las muestras en hielo. La degradación del ARN se detiene una vez que los corazones se han transferido en RNAlater o Trizol. Eso corazones laten en la placa de Petri demuestra poderosamente que el t cardiacacuestión es fisiológicamente normal después de la disección.
Se recomienda comenzar con al menos 300 corazones (es decir, alrededor de 500 embriones), de la que suficiente ARN de forma segura se puede precipitar (junto con 5.10 g de glucógeno). Sin embargo, no podemos excluir que un menor número de corazones sería suficiente para los experimentos a pequeña escala. Es simplemente importante tener suficiente ARN para determinar la concentración, pureza y la integridad de la muestra. Por favor, tenga en cuenta que los contenidos de ARN pueden variar dependiendo de la etapa de desarrollo y en el fondo genético del embrión (por ejemplo, en el caso de mutantes con corazones anormales). Por lo tanto, la cantidad mínima de embriones necesarios para un experimento tendría que determinarse en cada caso individual.
Hay pocas diferencias técnicas entre este protocolo y un protocolo anterior por Burns y MacRae, y no creo que hay una diferencia significativa en la eficiencia o la velocidad entre los dos protocolos.Sin embargo, hemos introducido mejoras: Lo más importante, le sugerimos el uso de solución de estabilización RNAlater. Esto es importante por dos razones: primero, para recoger el ARN de alta calidad para experimentos adicionales tales como RT-qPCR mediante la reducción de la degradación del ARN a un mínimo, como RNAlater inactiva inmediatamente RNasas y estabiliza el ARN dentro de los tejidos o células. En segundo lugar, RNAlater es crucial para permitir la recogida de los corazones en diferentes días, lo cual es importante cuando el número de embriones es un factor limitante. También permite la puesta en común de los corazones que puedan ser necesarios para obtener una cantidad suficiente de material de partida para el aislamiento eficiente de ARN de alta calidad con Trizol. Transferir los corazones directamente en Trizol sería omitir el uso de RNAlater, sin embargo, debido a los peligros de salud, este paso tendría que ser realizado bajo una campana química, que no se puede suponer que se encuentra en la proximidad directa del microscopio de fluorescencia para todos los experimentadores .
Encontramos tsombrero de la disección del corazón funciona bien con embriones entre 20-72 HPF [12; datos no publicados para 72 HPF]. Sin embargo, el procedimiento de extracción se hace más difícil a medida que aumenta la edad embrionaria y longitud: se requiere adicional y pipeteo más contundente para introducir con éxito los embriones en la punta larga y separar los corazones de otros tejidos embrionarios. Como resultado, los desechos más embrionario está presente dentro de la preparación de la muestra (véase la Figura 1C, C ') y el experimentador tiene que tener más cuidado en la clasificación de los corazones en el plato petri.
El protocolo de disección corazón que aquí se presenta permite un análisis de todo el perfil de expresión cardiaca de diferentes tipos de células, incluyendo el miocardio y el endocardio. Además la separación de tipos de células cardíacas se podría lograr mediante el uso de endocardial- y el infarto específica-reportero líneas [por ejemplo, Tg (myl7: GFP) twu34 y Tg (kdrl: mCherry IS5] 9, 17 para la extracción del corazón combinado con la separación FACS. En contraste con el método de 18,19 Translating ribosoma Purificación por Afinidad (TRAP), que permite el análisis de la transcripción específica de tejido sin disección de tejido, nuestro enfoque no se limita a mRNAs activamente traducidas pero también incluye mRNAs no-activamente traducidas o ARN no codificantes. Una aplicación alternativa del protocolo de disección corazón es analizar la expresión de proteínas dentro de los corazones: los niveles de proteína pueden evaluarse mediante transferencia de Western y de la proteína de localización puede ser analizado por inmunohistoquímica, como se conserva la anatomía del corazón durante el procedimiento de disección.
En resumen, presentamos aquí un protocolo detallado para disecar funcionales corazones / paliza por parte de cientos de embriones en un corto período de tiempo, que pueden ser utilizados para la obtención de ARN (o proteína) muestras específicas de corazón de alta pureza para análisis posteriores.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
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