Para analisar os perfis de expressão de genes cardíacos durante o desenvolvimento do coração de peixe-zebra, o RNA total foi de ser extraído do coração isolado. Aqui, apresentamos um protocolo para a coleta / corações batendo funcionais por um rápido esvaziamento manual a partir de embriões de peixes-zebra para obter mRNA específico cardíaca.
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Artigo de método
Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O coração embrionário do peixe-zebra é composta de apenas algumas centenas de células, o que representa apenas uma pequena fracção de todo o embrião. Portanto, para evitar o transcriptoma cardíaca de ser mascarado pelo transcriptoma embrionário global, é necessário recolher um número suficiente de corações para análises posteriores. Além disso, como o desenvolvimento do peixe-zebra cardíaca processe rapidamente, a recolha do coração e métodos de extracção de ARN precisa de ser rápido, a fim de assegurar homogeneidade das amostras. Aqui, apresentamos um protocolo de dissecção Manual rápido para a coleta / corações batendo funcionais a partir de embriões de peixes-zebra. Este é um pré-requisito essencial para a extração de RNA cardíaca específica posterior para determinar os níveis de expressão de genes específicos cardíaca por análises de transcriptoma, como em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR). O método baseia-se nas propriedades adesivas diferenciais do coração embrionário do peixe-zebra em comparação com outros tecidos; esta permite a rápida physeparação de Sical cardíaca a partir de tecido extracardiac por uma combinação de fluídico rompimento força de cisalhamento, filtração por etapas e coleta manual de transgênicos corações marcados com fluorescência.
Introdução
Peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente usada na biologia do desenvolvimento para estudar a organogénese in vivo, devido à sua rápida, transparente e extra-uterina do desenvolvimento embrionário, combinada com o tamanho pequeno e a disponibilidade de linhas repórter transgénicos com expressão específica para um tecido de proteínas fluorescentes. Este pequeno vertebrado é particularmente adequado para estudar o desenvolvimento do coração, já que oxigenação do embrião de peixe-zebra cedo não depende de batimento cardíaco e fluxo sanguíneo; esses recursos permitiram a caracterização de um grande número de mutantes cardiovasculares 1,2 e o peixe-zebra é agora um organismo modelo amplamente reconhecido para estudar doenças cardíacas 3.
Para estudar a expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário, as transcrições são comumente analisados por todo o monte de hibridização in situ (DESEJO) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, ou sequenciamento de próxima geração (RNA-Seq) 7. EnquantoDESEJO permite uma análise espacial-temporal da expressão gênica dentro de todo o embrião, níveis de transcrição são geralmente avaliada por RT-qPCR, microarrays ou abordagens de RNA-Seq. No entanto, estes métodos requerem enriquecimento tecido específico para perfil de expressão gênica.
Uma vez que o coração embrionário do peixe-zebra representa uma pequena fracção da totalidade do embrião, estudos transcriptoma durante o desenvolvimento cardíaco requerem um protocolo de dissecção e enriquecimento de corações. Além disso, para obter dados fisiologicamente relevantes, é importante para manter o tecido cardíaco totalmente funcional até a extracção de ARN. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar rapidamente fisiologicamente normal e corações batendo de centenas de embriões de peixes-zebra para se obter eficiência amostras de RNA de alta qualidade para análises posteriores. O presente método é baseado no protocolo descrito por Burns e MacRae, 2006 8. Para o enriquecimento de tecido cardíaco, ambos os métodos de usar uma linha de miocárdio repórter transgénicoe tirar vantagem das propriedades de adesão diferencial de corações de peixes-zebra embrionários contra outros tecidos. Resumidamente, por pipetagem muitos embriões cima e para baixo através de uma ponteira estreita, corações são simultaneamente lançado a partir de corpos embrionárias e, posteriormente, separados dos restos embrionários em duas etapas de filtração rápida; corações marcados com fluorescência são então classificadas manualmente a partir de detritos remanescentes e recolhidos para posterior processamento.
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da lei alemã e estado de Berlim; manuseio do peixe-zebra foi monitorada pela autoridade local para a protecção dos animais (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. A obtenção de embriões Zebrafish para Coração Extração
- Peixe-zebra repórter cardíaca transversal tal como a Tg (myl7: EGFP) twu34 linha transgénica 9, a fim de se obter os embriões com expressão específica do coração GFP.
- Manter os embriões em água ovo a 28,5 ° C, até a fase embrionária pretendida 10,11. Certifique-se de que a população embrião coletado é homogênea tanto geneticamente e por estágio de desenvolvimento para limitar as variações na expressão gênica.
- Dechorionate os embriões manualmente.
2. Dissecando Zebrafish embrionárias Corações
NOTA: Mantenha todas as soluções em gelo. Se possível, fazer o trabalho em equipe: uma pessoa disseca os corações do embtabaco de enrolar enquanto outra pessoa classifica os corações sob a lupa de fluorescência. Isto permite que o tratamento de várias centenas de embriões em algumas horas.
- Transferir cerca de 100 embriões para um tubo de centrifugação de 1,5 ml. Anestesiar os embriões com tricaína (0,16 mg / ml em meio de E3). Continuar uma vez que os embriões são claramente anestesiados (eles não nadar e sedimentos para o fundo do tubo, mas os seus corações são ainda batendo).
- Remover a solução / E3 tricaina e lavar os embriões, uma vez com 1 ml de L-15/10% de FBS e manter em gelo.
NOTA: O meio com FBS a L-15/10% é importante para manter os órgãos e células vivos durante todo o procedimento de dissecção até que os corações foram transferidos para RNAlater ou Trizol. - Adicionar 1 ml L-15/10% de FBS para os embriões e pipeta cima e para baixo 5-8 vezes com uma rodada Gel Carregando Dica até que a gema é completamente interrompido. Pipetar os embriões gota a gota sobre a superfície da solução, de modo que a queda vai rebentar eos embriões são suavemente interrompido.
NOTA: Como vigorosamente e quantas vezes os embriões têm de ser pipetados cima e para baixo depende do estágio de desenvolvimento dos embriões, ou seja, mais de pipetagem é necessária em estágios finais (por exemplo, a 56 hpf). - Para o primeiro lote de embriões dissecados, avaliar a integridade dos embriões e a proporção de corações dissecados sob microscópio estereoscópico, uma vez que alguns corações podem permanecer solidários com os embriões se pipetaram muito gentilmente. Ajuste o modo de pipetagem para as próximas rodadas de dissecção de acordo.
NOTA: Use baixos dicas retenção pipetas e tubos de microcentrífuga para minimizar corações degola ao plástico. - Aplicar a amostra para um filtro de 100 um colocado em um tubo de 50 ml de centrifugação; enxaguar o tubo de 1,5 mL com 1 mL de meio L-15/10% de FBS e, em seguida, aplicar essa para o filtro, a fim de minimizar a perda da amostra (alguns corações pode ser aderente às paredes do tubo). Lavar o filtro duas vezes com 1 ml de L-15 / 10% de FBS. Neste passo os corações passar através do filtro e são recolhidas no tubo de 50 ml.
- Aplicar o fluxo de passagem para um filtro de 30 mm colocada sobre um tubo de centrifugação de 15 mL e lavar o filtro uma vez com 1 ml de L-15/10% de FBS. Neste segundo passo de filtração, os corações são retidas no filtro e pequenos detritos é lavado.
- Ligue o filtro de cabeça para baixo e lavar os corações para fora do filtro para um 1% de agarose revestidos por placa de Petri por aplicação de três lavagens consecutivas com 1 ml de L-15/10% de FBS.
- Separar manualmente corações GFP positivas a partir dos detritos embrionário não fluorescente (por exemplo, lentes oculares) com um par de pinças sob um estereomicroscópio fluorescência e concentrá-las no centro do prato. Recolha-os de acordo com a etapa 3.
NOTA: Se os embriões são mais velhos do que 24 hpf, o coração deve ser de bater, o que indica que os tecidos ainda estão fisiologicamente normal.
3. Isolamento de mRNA a partir de dissecçãoted Corações
- Recolha os corações no menor volume possível (por exemplo, 10 ul) e pipeta em um tubo de 1,5 ml contendo 0,75 ml RNAlater (no gelo). Verifique se não há corações permanecer na ponta da pipeta por vê-lo sob um microscópio estereoscópico fluorescência.
- Como alternativa, se um capuz químico está disponível nas imediações de um microscópio de fluorescência, transferir os corações coletados em Trizol (CUIDADO) sob o capô química. Isto evita a possível perda de corações que furam na ponta da pipeta e também durante a centrifugação dos corações (passos 3.4, 3.5 e 3.7). Reúnem-se os corações de várias rodadas de isolamento no mesmo tubo com Trizol e ir diretamente para a etapa 3.8; o volume final não deve exceder 10% do volume inicial de Trizol.
NOTA: Leia a Ficha de Segurança Trizol Produto (FDSP) antes do uso. Pega reagente Trizol sob um capuz e desgaste recomendado Equipamento de Proteção Individual. Evitar o contacto com a pele, olhos e clothing. Remova todas as fontes de ignição. - Reúnem-se os corações de várias rondas de isolamento no mesmo tubo com RNAlater (em gelo), como a eficiência de isolamento de ARN aumenta com a quantidade de tecido recolhido. Se o volume total da amostra for superior a 10% do volume inicial RNAlater, utilizar um tubo adicional com 0,75 ml RNAlater para armazenamento (em gelo).
- Centrifuga-se as amostras a 15.700 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar os corações.
- Sob um microscópio estereoscópico de fluorescência, recolher cuidadosamente, tanto sobrenadante quanto possível num revestidos por placa de Petri de agarose 1% contendo 3 ml de L-15/10% de FBS, mas não perturbe os corações sedimentadas no fundo do tubo de centrifugação. Uma vez que até 15% dos corações pode permanecer no sobrenadante devido à elevada viscosidade do RNAlater, recuperá-los, tal como descrito na etapa 3.7.
- Dentro de uma câmara química, adicionar 0,5 ml de Trizol para o tubo contendo os corações sedimentadas e manter em gelo.
- Sob o microsco fluorescentepe, transferir os corações (a partir do passo 3.5) a partir do 1% de agarose revestidas de prato contendo solução de FBS RNAlater / L-15/10% em outro prato revestido de agarose a 1% com 3 ml de L-15/10% de FBS para diluir a RNAlater. Recolher os corações no centro da placa de petri e transferi-las num volume pequeno para o tubo de corações sedimentados em Trizol sob uma coifa química.
- Vortex o tubo de 1,5 ml contendo os corações em Trizol para interromper o coração e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Dentro de uma câmara química, adicione 100 clorofórmio ul (CUIDADO), misturar bem e transferir a solução / clorofórmio Trizol em um 1,5 ml pré-fiado tubo PLG (centrífuga 30 segundos a velocidade máxima antes de usar). Incuba-se durante 3 minutos à temperatura ambiente.
NOTA: Leia as MSDS clorofórmio antes de usar. Pega reagente clorofórmio, sob um capuz e desgaste recomendado Equipamento de Proteção Individual. Evitar o contacto com a pele, olhos e vestuário. Manter longe de incompatíveis, como os metais, álcalis. - Centrifuge a amostra a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C, e transferir a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 ml.
- Junte 5-10 ug de glicogénio e 250 pi pré-arrefecida (-20 ° C) isopropanol; misturar bem e incubar durante a noite a -20 ° C.
- Centrifuga-se a amostra a 15.700 xg durante 30 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 75%, centrifugar a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Deixe evaporar o etanol por secagem do sedimento à temperatura ambiente até se tornar branco (por exemplo, para 10-15 min).
- Adicionar 20 ul de ARNase isento de ddH2O para o sedimento e incubar durante 10-15 min a 55 ° C para dissolver o ARN; em seguida, manter em gelo.
- Avaliar a concentração de ARN e pureza por medição de absorvância. Avaliar a integridade do RNA por a execução da amostra sobre um gel de agarose a 1%.
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Resultados
Aqui, descrevemos uma experiência representativa dissecção do coração utilizando o peixe-zebra Tg (myl7: GFP) twu34 linhagem transgênica 9, que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) exclusivamente dentro do miocárdio (Fig. 1). Foram coletadas ambos os corações dissecados e dos embriões a partir da qual eles foram derivados a avaliar a pureza da amostra coração. Resumidamente, homozigoto Tg (myl7: GFP) twu34 peixe-zebra 9 foram outcrossed com o tipo sel...
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Discussão
Este protocolo permite o rápido enriquecimento do tecido do coração embrionário do peixe-zebra por análises de expressão de genes. A quantidade e qualidade da amostra de RNA específico cardíaca depende muito de alguns passos cruciais: primeiro, a quantidade da amostra é muito melhor se a perda de corações é impedida em cada etapa do protocolo, uma vez que a purificação RNA só funcionará com suficiente material de partida. Em segundo lugar, a pureza da amostra, o que depende inteiramente do experimentador, é determinada ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a C. Burns, C. McRae por delinear o princípio básico deste protocolo de purificação e a F. Priller pela implementação inicial deste método em nosso laboratório. S.A.-S. é apoiado por uma cátedra Heisenberg da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabalho foi apoiado pela bolsa DFG SE2016/7-1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento para criação de peixes e coleta de ovos | consulte o Zebrafish Book11 para obter detalhes | ||
| Estereomicroscópio | |||
| Microcentrífuga | |||
| Espectrofotômetro | e.g. Câmara | ||
| eletroforese | |||
| de ácido nucleico Thermo Scientific Nanodrop 2000Placas de Petri 4 cm Ø, revestidas com agarose a 1% em meio | |||
| Micropipetas e pontas (P20, P100, P1000) | |||
| Tubos de centrifugação de 1,5 ml Tubos | |||
| de centrifugação de 15 ml e 50 ml | |||
| Par de pinças | |||
| Dumont #5ExactaCruz™ Pontas de Carregamento de Gel Redondas em Rack Estéril, 1-200μ l | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μ m filtro (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μ m filter (Filtros de Pré-Separação-30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Gel de bloqueio de fase, pesado, tubos de 1,5 ml | Prime | 2302810 | |
| Ovo água média | 60 μ g/ml Sais Marinhos Instantâneos do Oceano em ddH2O, 0.00001% (p/v) Azul de Metileno | ||
| E3 médio | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 | ||
| Tricaína (3-aminoácido benzóicoetiléster) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Solução estoque de tricaína, pH 7 |
| 1% de agarose (em meio E3) | |||
| 1% de gel de agarose (em tampão TBE) | |||
| Leibovitz&agudo; s L-15 médio | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Soro Fetal Bovino) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glicogênio | Invitrogen | 10814-010 | 20 µ g/µ l em água livre de RNase |
| isopropanol | |||
| clorofórmio | |||
| 75% etanol (em DEPC-ddH2O) | |||
| Água livre de nuclease ou esterilizado com tratamento com DEPC ddH2O | |||
| Tampão | |||
| TBE (Tris / Borato / EDTA) tampão para eletroforese |
Referências
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Reimpressões e permissões
