Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

Resumo

Para analisar os perfis de expressão de genes cardíacos durante o desenvolvimento do coração de peixe-zebra, o RNA total foi de ser extraído do coração isolado. Aqui, apresentamos um protocolo para a coleta / corações batendo funcionais por um rápido esvaziamento manual a partir de embriões de peixes-zebra para obter mRNA específico cardíaca.

Resumo

O coração embrionário do peixe-zebra é composta de apenas algumas centenas de células, o que representa apenas uma pequena fracção de todo o embrião. Portanto, para evitar o transcriptoma cardíaca de ser mascarado pelo transcriptoma embrionário global, é necessário recolher um número suficiente de corações para análises posteriores. Além disso, como o desenvolvimento do peixe-zebra cardíaca processe rapidamente, a recolha do coração e métodos de extracção de ARN precisa de ser rápido, a fim de assegurar homogeneidade das amostras. Aqui, apresentamos um protocolo de dissecção Manual rápido para a coleta / corações batendo funcionais a partir de embriões de peixes-zebra. Este é um pré-requisito essencial para a extração de RNA cardíaca específica posterior para determinar os níveis de expressão de genes específicos cardíaca por análises de transcriptoma, como em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR). O método baseia-se nas propriedades adesivas diferenciais do coração embrionário do peixe-zebra em comparação com outros tecidos; esta permite a rápida physeparação de Sical cardíaca a partir de tecido extracardiac por uma combinação de fluídico rompimento força de cisalhamento, filtração por etapas e coleta manual de transgênicos corações marcados com fluorescência.

Introdução

Peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente usada na biologia do desenvolvimento para estudar a organogénese in vivo, devido à sua rápida, transparente e extra-uterina do desenvolvimento embrionário, combinada com o tamanho pequeno e a disponibilidade de linhas repórter transgénicos com expressão específica para um tecido de proteínas fluorescentes. Este pequeno vertebrado é particularmente adequado para estudar o desenvolvimento do coração, já que oxigenação do embrião de peixe-zebra cedo não depende de batimento cardíaco e fluxo sanguíneo; esses recursos permitiram a caracterização de um grande número de mutantes cardiovasculares ^1,2 e o pei....

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da lei alemã e estado de Berlim; manuseio do peixe-zebra foi monitorada pela autoridade local para a protecção dos animais (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).

1. A obtenção de embriões Zebrafish para Coração Extração

1. Peixe-zebra repórter cardíaca transversal tal como a Tg (myl7: EGFP) ^twu34 linha transgénica ^9, a fim de se obter os embriões com expressão específica do coração GFP.
2. Manter os embriões em água ovo a 28,5 ° C, até a fase embrionária pretendida ^10,11. Certifique-se de que a população embrião coletado é homogênea t....

Resultados

Aqui, descrevemos uma experiência representativa dissecção do coração utilizando o peixe-zebra Tg (myl7: GFP) ^twu34 linhagem transgênica ^9, que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) exclusivamente dentro do miocárdio (Fig. 1). Foram coletadas ambos os corações dissecados e dos embriões a partir da qual eles foram derivados a avaliar a pureza da amostra coração. Resumidamente, homozigoto Tg (myl7: GFP) ^twu34 peixe-zebra ⁹ foram outcrossed com o tipo sel.......

Discussão

Este protocolo permite o rápido enriquecimento do tecido do coração embrionário do peixe-zebra por análises de expressão de genes. A quantidade e qualidade da amostra de RNA específico cardíaca depende muito de alguns passos cruciais: primeiro, a quantidade da amostra é muito melhor se a perda de corações é impedida em cada etapa do protocolo, uma vez que a purificação RNA só funcionará com suficiente material de partida. Em segundo lugar, a pureza da amostra, o que depende inteiramente do experimentador, é determinada .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento para criação de peixes e coleta de ovos			consulte o Zebrafish Book11 para obter detalhes
Estereomicroscópio
Microcentrífuga
Espectrofotômetro			e.g. Câmara
eletroforese
de ácido nucleico Thermo Scientific Nanodrop 2000Placas de Petri 4 cm Ø, revestidas com agarose a 1% em meio
Micropipetas e pontas (P20, P100, P1000)
Tubos de centrifugação de 1,5 ml Tubos
			de centrifugação de 15 ml e 50 ml
Par de pinças
Dumont #5ExactaCruz™ Pontas de Carregamento de Gel Redondas em Rack Estéril, 1-200μ l	Santa Cruz	sc-201732
100 μ m filtro (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)	BD Biosciences	352360
30 μ m filter (Filtros de Pré-Separação-30 µ m)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Gel de bloqueio de fase, pesado, tubos de 1,5 ml	Prime	2302810
Ovo água média			60 μ g/ml Sais Marinhos Instantâneos do Oceano em ddH2O, 0.00001% (p/v) Azul de Metileno
E3 médio			5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4
Tricaína (3-aminoácido benzóicoetiléster)	Sigma-Aldrich	A-5040	4 mg/ml Solução estoque de tricaína, pH 7
1% de agarose (em meio E3)
1% de gel de agarose (em tampão TBE)
Leibovitz&agudo; s L-15 médio	Gibco	21083-027
FBS (Soro Fetal Bovino)	Sigma	F4135
RNAlater	Ambion	AM7020
Trizol	Ambion	1559606
Glicogênio	Invitrogen	10814-010	20 µ g/µ l em água livre de RNase
isopropanol
clorofórmio
75% etanol (em DEPC-ddH2O)
Água livre de nuclease ou esterilizado com tratamento com DEPC ddH2O
Tampão
TBE (Tris / Borato / EDTA) tampão para eletroforese

de fluorescênciarefrigerada UV de E3dede carga de ácido nucleico